Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Résumé

CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l'analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.

Résumé

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Introduction

Il a été connu depuis de nombreuses années que les suppressions ou des copies supplémentaires de segments chromosomiques causent une déficience intellectuelle, une dysmorphie et des malformations congentical, et dans certains cas provoquer des syndromes génétiques ^1. Cependant, la seule technologie disponible jusqu'au milieu des années 2000 pour la détection du génome entier de ces changements était G-bandes analyse des chromosomes, qui a une résolution de l'ordre 5-10Mb, selon la région et la nature du déséquilibre, et qui ne peut pas détecter chromosomes anormaux où la matière a été remplacé par une région d'un chromosome différent avec le même motif de bandes. Techniques cytogénétiques auxiliaires tels que l'hybridation fluorescente in situ et multiplex sonde amplification spécifique de ligature en ont été disponibles pour l'interrogation des loci spécifiques, en cas de suspicion déséquilibre syndromique spécifique, mais ce ne est que l'introduction d'hybridation génomique comparative (CGH array) en s diagnostic clinique de routineervice ^2-5 que la détection du génome entier du nombre de copies variantes (CNV) est devenu possible à une résolution considérablement augmenté (généralement autour de 120kb). Travaux de service clinique parallèlement à des études de recherche ont montré que CNV pour certaines régions sont très répandues dans la population normale ^6-7, tandis que d'autres CNV, auparavant indétectable, sont associés à neurodisabilities comme l'autisme et l'épilepsie ^8-11.

Le protocole décrit dans ce document est utilisé dans notre laboratoire de diagnostic clinique UK National Health Service (NHS); nous utilisons de nouvelles stratégies d'hybridation, les tests par lots et de la robotique de minimiser les coûts de ce service financé par l'Etat.

Avant le protocole détaillé ci-dessous, l'ADN de haute qualité doit être extraite de la matière de départ appropriée, habituellement du sang, des cellules cultivées ou des échantillons de tissus. Spectrophotométrie peut être utilisé pour mesurer la concentration (devrait être> 50 ng / ul) et vérifier 260: 280 rapports d'absorbance (b devraite 1,8 à 2,0). L'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour vérifier que l'ADN soit de haut poids moléculaire sans dégradation significative.

Ce protocole est conçu pour les laboratoires de débit plus élevés qui sont étiquetage 96 échantillons par exécution à l'aide automatisés robotique de manipulation de liquides. Cependant, il peut être adapté pour les laboratoires de débit inférieurs sans automatisation.

Protocole

1. L'étiquetage Réaction

1. Avant d'utiliser, dUTP pré-aliquote cyanine 3 et 5 nucléotides marqués, non marqués et des amorces aléatoires aux concentrations recommandées par le fabricant et magasin en plaques à 96 puits à -20 C prêt à l'emploi. Pour les fins de ce protocole, aliquote 10,5 pi de la dUTP marqué de appropriée et 10,5 ul nucléotides non marqués et des amorces aléatoires à chaque puits.
2. Décongeler la plaque prête à l'emploi de 96 puits de nucléotides et des amorces à 4 ° C pendant environ 1 heure, à l'abri de la lumière.
3. Une fois décongelé, équilibrer cette plaque à température ambiante pendant au moins 30 min, à l'abri de la lumière.
4. Equilibrer échantillons d'ADN à 60 ° C pendant au moins 15 min.
5. L'utilisation d'un robot de manipulation liquide, distribuer de l'eau sans nucléase à chaque puits d'une plaque de 96 puits.
   NOTE: Le volume d'eau dépendra de la concentration de chaque échantillon d'ADN d'entrée et doit être suffisante pour donner une concentration finale de 50 ng / ul.
6. Utilisation d'un liquide hanmani- robot, pipette 1 ug d'ADN dans un puits de la plaque à 96 puits (voir 1.5) pour porter le volume total à 20 ul.
   NOTE: quantités d'ADN inférieures peuvent être utilisés même si la qualité des données qui en résulte peut être compromise (pour les échantillons précieux, les quantités d'ADN d'entrée vers le bas à 400 ng peuvent être utilisés).
7. En utilisant un robot de manipulation de liquide, transférer 20 pi de nucleotides et des amorces équilibrée dans chaque puits de la plaque de l'ADN dilué.
8. Sceller la plaque 96 puits avec des bouchons de bande (un joint étanche est essentiel).
9. Dénaturer l'ADN à 99 ° C pendant 10 min dans une machine PCR avec un couvercle chauffé et puis enclenchez refroidir sur glace pendant 5 min à des amorces de recuit.
10. L'utilisation d'un robot de manipulation de liquide, ajouter 10 pi de l'ADN Klenow Exo enzyme polymérase ADN à chaque pipette et mélanger soigneusement.
    NOTE: Le volume total devrait être de 50 pi.
11. Sceller la plaque à 96 puits et incuber à 37 ° C pendant 16 heures.
    REMARQUE: Une incubation plus courte de 4 heures est suffisante cependant un O / N danscubation peut être plus pratique.
12. En utilisant un robot de manipulation de liquide, ajouter 5 ul de tampon d'arrêt à chaque puits.
    REMARQUE: Un résumé des réactifs utilisés pour la réaction de marquage est indiqué dans le Tableau 1.

2. Suppression non constituées en nucléotides

1. Retirer nucléotides non constituées en société en utilisant la silice-membrane à base de colonnes de spin et un robot de spin de traitement de la colonne dédiée (les colonnes de spin peuvent également être traitées manuellement). Suivez les instructions du fabricant.
   1. Transférer le contenu de chaque puits dans un tube de 2 ml; pré-label-ci avec ID et de.
      REMARQUE: Cette étape peut être réalisée manuellement ou de préférence en utilisant un robot de manipulation de liquide.
   2. Si l'on utilise un robot de traitement de colonne de centrifugation, puis charger le robot avec 2 ml des tubes, des colonnes de centrifugation de purification de l'ADN et des tampons associés.
   3. Ajouter 250 ul de haute teneur en sel, tampon de liaison (tampon PB) l'ADN à la réaction de marquage pour lier l'ADN marqué à la silicemembrane.
   4. Éliminer les impuretés en lavant la membrane deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (tampon PE).
   5. Ajouter 15 pi de tampon d'élution faible de sel (tampon EB) à la membrane pour récupérer l'ADN purifié, marqué dans un volume de ~ 12 ul.

3. Mélanger Paires Hyb

1. Combiner les paires appropriées de la cyanine 3 et 5 de l'ADN marqué, COT-1 ADN, un mélange de blocage fourni par le fabricant et un tampon d'hybridation fourni par le fabricant en utilisant un robot de manipulation de liquide.
   NOTE: Ces paires Hyb peut être un échantillon et une référence, ou un échantillon vs échantillon si CNV partagé ne sont pas un problème (par exemple, nous jumelons régulièrement des échantillons de phénotype correspondent pas, comme une dysplasie des patients rénale vs un patient de craniosténose, car ils sont très peu probable pour transporter le même cliniquement significative CNV). Si l'on utilise un ADN de référence, une source d'ADN du commerce est recommandée, et il doit être traité le long de l'échantillon.
   1. Utilisation d'une manipulation de liquides robot, ajouter COT-1 ADN (3333 ng / ul), le fabricant fournies blocage mélange et un tampon d'hybridation à chaque puits d'une plaque à 96 puits de sorte que chaque puits contient 1,1 ul COT-1 ADN, 4,95 ul de mélange de blocage et 24,75 ul du tampon d'hybridation.
   2. Ajouter 9,35 ul de l'ADN approprié cyanine 3-marqué dans chaque puits. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage.
   3. Ajouter 9,35 ul de l'ADN approprié cyanine 5 marqué à chaque puits. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage.
   4. Sceller la plaque à 96 puits et vortex pendant 1 min. Faites tourner la plaque à 96 puits pour recueillir le contenu au fond de chaque puits.

4. Hybridation

1. Préchauffer un four à hybridation à 65 ° C et préchauffer une diapositive de support et une chambre d'hybridation pour chaque diapositive de tableau.
   1. Dénaturer l'ADN marqué à une pré-incubation avant l'hybridation étant à appliquer sur les tableaux. Effectuer une hybridation dans un four rotatif pendant 24 heures.
   2. Incuber la plaque à 96 puits à 70 ° C pendant 30 minutes, puis laisser à 37 ° C pendant au moins 5 min.
   3. Travailler sur une plate-forme chauffée à 42 ° C, charger la sauvegarde chaque diapositive dans une chambre d'hybridation avant de l'utiliser. Assurez-vous que la partie transparente de la lame de joint se aligne avec la partie «fenêtré» de la chambre d'hybridation.
   4. Pipet 42 ul du mélange d'hybridation préparé précédemment (voir section 3) sur la position appropriée sur le réseau sauvegarde diapositive. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage. Pipet lentement sur le centre de chaque position, assurant que le liquide ne touche pas la limite de l'anneau en caoutchouc.
   5. Une fois toutes les positions sur la lame de support sont remplis, abaissez délicatement la lame de tableau sur elle et assembler la chambre d'hybridation. Assurez-vous que le côté du tableau avec écrit sur elle est confrontée à la diapositive de support. Veillez à serrer l'hybridation vis de chambre entièrement.
   6. Inspectez la chambre d'hybridation assemblé. ENSure qu'il n'y ait pas de fuite de mélange d'hybridation à l'extérieur des limites de la bague en caoutchouc et chaque bulle d'air est d'environ 4 mm de hauteur lorsque la chambre d'hybridation est reposé sur son extrémité verticalement. Tournez la chambre d'hybridation et vérifier qu'il n'y a pas de bulles d'air qui sont coincés en position et ne bouge pas. Se il ya toutes ces choses, donner la chambre forte d'un robinet sur le banc. Vérifiez que toutes les bulles d'air se déplacent.
   7. Placer la chambre d'hybridation dans le four rotatif à 65 ° C pendant 24 heures. Assurez-vous que le rotor four est équilibrée; utiliser d'autres chambres vides si nécessaire.

5. Lavage et diapositives Numérisation

1. Laver tableaux pour éliminer l'ADN marqué excès et puis analyser pour mesurer la fluorescence de chaque sonde.
   1. Prenez chambres d'hybridation sortie du four et à démonter. Les diapositives de tableaux et joints seront collées; plonger ceux-ci dans une tampon de lavage et utiliser une paire de pinces en plastique, plat tranchant pour les forcer à part.
   2. DiSCard la diapositive de joint et placer la lame de tableau dans un rack immergée dans un tampon 1.
   3. Laver la glissière de tableau dans ~ 700 ml de tampon de lavage fraîche 1 pendant 5 min, en remuant vigoureusement (utiliser une puce et d'un agitateur magnétique).
   4. Transférer la lame de tableau à ~ 700 ml tampon de lavage 2 et laver pendant 90 secondes, en remuant vigoureusement. Soulevez doucement les diapositives de tableaux sur tampon de lavage 2, ils devraient émerger sec.
   5. Charger la lame de matrice dans un porte-lame du dispositif de balayage, en utilisant un protecteur de lame. Chargez la diapositive dans le scanner de réseau et de numérisation en suivant les instructions du fabricant du tableau.

Résultats

Chaque sonde sur un réseau hybride est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouge et vert (voir Figure 1). Le ratio de rouge à un signal vert fluorescent pour chaque sonde est quantifiée par le scanner et le logiciel associé graphiquement en ratios de log2 selon leur position génomique, et identifie les régions relevant de limites prédéfinies extérieur. Les traces de tableau résultant permettent interprétation de régions identifiées comme génomiquement déséquilibrée. Par exemp...

Discussion

CGH array ne détectera pas remaniements équilibrés ou des anomalies de ploïdie tels que la triploïdie. En outre, les déséquilibres mosaïque de bas niveau ne peuvent pas être détectés. Cependant, CGH array a une résolution plus élevée pour la détection CNV que l'analyse des chromosomes bandes G laquelle il a remplacé dans de nombreux laboratoires de cytogénétique. Ce est donc la norme de référence actuelle pour la détection du génome entier CNV. Elle peut être remplacée par des technologies de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH wash buffers	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridisation buffer	Agilent	5188-5380
Minelute purification kit	Qiagen	28006
Array CGH labelling kit	Enzo	ENZ-42672-0000