Analyseur portable à base d'impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale

Résumé

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Résumé

De nombreux troubles liés au cerveau ont mort des cellules neuronales impliquées dans leur physiopathologie. Amélioration des modèles in vitro pour étudier les effets neuroprotecteurs ou neurotoxiques de drogues et les voies en aval concernés aiderait mieux comprendre les mécanismes moléculaires de neuroprotection / neurotoxicité et pourrait faciliter le développement de médicaments. Cependant, de nombreux tests in vitro existantes sur la toxicité comportent des limites importantes - plus évaluer la neurotoxicité et la neuroprotection à un seul point du temps, ne permettant pas d'observer l'évolution temporelle et la cinétique de l'effet. En outre, la possibilité de recueillir des informations sur les voies de signalisation impliquées dans la neuroprotection aval en temps réel serait d'une grande importance. Dans le protocole en vigueur, nous décrivons l'utilisation d'une cellule d'analyse en fonction de l'impédance en temps réel pour déterminer les effets neuroprotecteurs de la serotonine 2A (5-HT _2A) des agonistes du récepteur dans une lignée de cellules neuronales dans le cadre sans marquage et en temps réel conditions à l'aide de mesures d'impédance. De plus, nous démontrons que les inhibiteurs de la seconde piste de messagerie peuvent être utilisés pour délimiter les molécules en aval impliqués dans l'effet neuroprotecteur. Nous décrivons également l'utilité de cette technique pour déterminer si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à un effet neuroprotecteur observé. Le système utilise des plaques spéciales microélectroniques dénommé E-plaques qui contiennent alternance réseaux de microélectrodes d'or sur la surface inférieure des puits, servant de capteurs cellulaires. L'affichage de l'impédance est modifiée par le nombre de cellules adhérentes, la viabilité des cellules, la morphologie, et l'adhérence. Un paramètre sans dimension appelé l'indice cellulaire est dérivé à partir des mesures d'impédance électrique et est utilisée pour représenter l'état de la cellule. Dans l'ensemble, le temps réel analyseur de cellules à base d'impédance permet en temps réel, l'évaluation sans étiquette de la neuroprotection et la neurotoxicité, et l'évaluation de la deuxième participation de voies de messagerie, contribuant à plusévaluation détaillée et à haut débit de composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, pour la sélection des candidats thérapeutiques.

Introduction

La mort cellulaire neuronale joue un rôle critique dans la pathophysiologie de nombreux troubles liés au cerveau ^1. La disponibilité d'informations fiables et à haut débit dans des tests de toxicité in vitro est essentiel d'avoir un meilleur aperçu des mécanismes de la neurotoxicité et d'aider à sélectionner des molécules neuroprotectrices comme candidats thérapeutiques dans le développement de médicaments ^2. Cependant, il ya beaucoup de limitations à la plus largement utilisée in vitro neurotoxicité assays.They évaluer la neurotoxicité / neuroprotection à un seul point dans le temps ne permet pas la résolution cinétique; utilisent souvent l'étiquette ou de la sonde qui peut interférer avec les voies de signalisation et de limiter d'autres études dans la même population de cellules, et sont souvent de main-d'œuvre, et dans de nombreux cas ne fournit pas une approche mécanistique. Dans la présente étude, nous avons démontré l'utilité d'une cellule d'analyse en fonction de l'impédance en temps réel afin de déterminer la neurotoxicité et de neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale, en temps réel et sans marqueur sousconditions et permettent de mieux comprendre les mécanismes en aval à travers l'analyse de la seconde piste de messagerie impliqués dans l'effet.

Des études antérieures ont confirmé la validité de la cellule d'analyse en temps réel afin de déterminer la cytotoxicité, ainsi que les effets sur la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires par comparaison avec des techniques classiques ^3,4,5,6. Par exemple, une bonne corrélation a été observée entre les lectures de la norme viabilité cellulaire WST-1 essai et cellulaires valeurs de l'indice à plusieurs points dans le temps dans des conditions de prolifération basale et après deux paradigmes différents toxiques dans les cellules HeLa ^3. Dans A549 et MDA-MB-231 cellules prolifération et la cytotoxicité provoquée par le paclitaxel de stabilisation des microtubules ont montré des valeurs très similaires lors de l'évaluation par la mesure de l'indice cellulaire et la sulforhodamine utilisé en standard B (SRB) essai ^4. Dans la lignée cellulaire neuronale de neurones de l'hippocampe immortalisés Index HT-22 cellulaires mesures ont été validés pour leur capacité to détecter la prolifération cellulaire, la cytotoxicité et la glutamate cytoprotection contre le 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) largement utilisé du 2,5-diphényl-bromure (MTT) ^5. Dans la même étude, les résultats d'analyse de MTT et les mesures de l'indice cellulaire aussi bien corrélées à la mesure neuronale des cellules progénitrices prolifération, cytotoxicité après les facteurs de croissance privation et de sauvetage de la cytotoxicité par le pan-caspase inhibiteur QVD ^5. La cytotoxicité induite dans des cellules NIH 3T3 par Vandetanib (récepteur du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire et d'un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique) a montré des résultats similaires avec des valeurs mesurées de l'indice cellulaire ou neutre essai d'absorption rouge ^6.

Récemment, nous avons utilisé le système d'analyse de cellules en temps réel pour évaluer les effets neuroprotecteurs de la figure 2A de la sérotonine (5-HT _2A) agoniste du récepteur de chlorhydrate de (±) -2,5-diméthoxy-4-iodoamphétamine (DOI) dans une lignée cellulaire neuronale ( cellules SK-N-SH) et criblés pour la participation du second voies de messagerie par le biais de la surveillance de l'effet de leur inhibition chimique sur la neuroprotection observée ^7. Fait intéressant, le _récepteur 5-HT _2A a agonistes fois hallucinogènes et nonhallucinogenic (comme DOI et lisuride, respectivement), ce qui peut activer les deux secondes voies de messagerie communs et distincts ^8.

Les avantages de la technique présentée est qu'il permet de recueillir des informations en temps réel sur la survie des cellules au cours de jours, pour délimiter les voies de seconds messagers impliqués, afin d'évaluer la contribution possible des effets de prolifération à la neuroprotection, et pour sélectionner un temps optimal des études supplémentaires de point final sur la même population de cellules. Un diagramme schématique du flux de travail dans le protocole actuel est présenté sur la figure 1.

Protocole

Préparation 1

1. Placez la station de la temps réel analyseur de cellules dans un incubateur de culture de tissu fixée à 37 ° C et 5% de CO _2. Effectuer toutes les manipulations de culture cellulaire et de traitements pharmacologiques dans une hotte de culture de tissu dans des conditions stériles.
2. NOTE: neuronale lignées cellulaires nécessitant différents réglages de température par rapport à des conditions normales de culture, doivent être ajustés en conséquence. Pour les lignées cellulaires faiblement adhérentes, utiliser les agents de revêtement pour faciliter l'interaction des cellules avec les microélectrodes d'or dans le fond des puits de la plaque E-96.
3. Préparer 1,000X solutions stock des composés pharmacologiques pour le traitement de culture cellulaire (agents neuroprotecteurs ou deuxième inhibiteurs de voies de messagerie dans le solvant approprié - diméthylsulfoxyde ou de l'eau stérile) et de les stocker à -20 ° C. Utilisez le solvant comme véhicule dans les traitements suivants.
4. Culture des cellules de neuroblastome humain SK-N-SH dans du DMEM / F1Deux milieu supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (milieu de prolifération) dans des flacons de culture cellulaire avec 175 cm ² de surface de densité d'environ 75%. Garder nombre de passage de cellules dans une plage (environ 10 passages) pour vérifier la cohérence entre les expériences en termes de taux de prolifération cellulaire et de la réponse de cytotoxicité. Les nombres inférieurs de passage sont préférés.
5. Laver la couche adhérente de cellules SK-N-SH avec du PBS, et trypsiniser avec une solution de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Centrifuger les cellules à 170 xg pendant 5 min pour éliminer la trypsine. Remettre en suspension les cellules dans du milieu de prolifération de 10 ml. Compter les cellules avec Sceptre compteur de cellules et d'ajuster le nombre de cellules à 300 000 cellules / ml en diluant les cellules avec un milieu de prolifération.

2. placage et la prolifération des cellules SK-N-SH

1. Ajouter milieu de prolifération de 100 ul dans chaque puits de la plaque de E-96 et le laisser pendant 30 min dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pour équilibrer. Insérez le E-Plate 96 dans la station d'analyse de cellules en temps réel dans l'incubateur à _CO2 à 37 ° C.
2. Démarrez le logiciel de l'analyseur de cellules en temps réel. Sur la page Mise sélectionner les puits inclus dans l'expérience et entrent dans les boîtes de saisie des informations sur le type de cellule, le nombre de cellules, les noms et les concentrations de composés chimiques utilisés pour le traitement des cellules.
   NOTE: Pour les fins du présent protocole au moins 4 répétitions sont recommandés pour chaque traitement.
3. Sur la page du logiciel de l'annexe déterminer "Steps" inclus dans l'expérience, en sélectionnant le nombre de balayages de mesure l'indice cellulaire et l'intervalle entre les balayages pour chaque étape. Depuis l'étape 1 est prédéterminée pour la mesure de fond, sélectionnez «Ajouter une étape» et réglez l'étape 2 pour mesurer l'indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures.
   NOTE: Pour les traitements, dans lequel les effets avec une cinétique rapide sont attendus, mis balayages à intervalles plus rapprochés.
4. Cliquez sur Démarrer pour lancer l'étape prédéterminée automatiquement 1et mesurer l'impédance des supports de fond. Cette valeur est soustraite automatiquement par le logiciel au niveau de chaque point de données une fois que les cellules sont ajoutées aux puits.
5. Utilisation préparé précédemment dans l'étape 1.5), suspension de cellules de 300 000 cellules / ml dans du milieu de prolifération. 30 000 cellules / puits pour la toxicité cellulaire / études de neuroprotection et 15 000 cellules / puits pour des études de prolifération de cellules. Sortez le E-Plate et ajouter 100 suspension cellulaire par puits pour la toxicité cellulaire / études de neuroprotection et ajouter 50 ul suspension de cellules et milieu de prolifération de 50 pi par puits pour les études de la prolifération cellulaire. Le nombre de cellules étalées par puits doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire de façon empirique.
6. Agitez doucement le E-Plate 96, même pour le placage des cellules. Laisser la plaque E-96 à 30 min dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pour permettre aux cellules de se déposent uniformément sur le fond des puits.
7. Insérez le E-Plate 96 dans la station d'analyse cellulaire en temps réel et commencer à l'étape 2 de l'annexe pâge. Surveiller les valeurs de l'indice de la cellule à travers l'expérience en regardant les courbes de cellules sur la page de terrain et les données de l'indice cellulaire premières sur la page Index portable du logiciel.

3. la privation de sérum

1. 24 heures après l'étalement des cellules, mettre en pause l'expérience, et retirez le E-Plate 96 de la station d'analyse cellulaire en temps réel. Diluer deuxième inhibiteurs de messager des stocks 1,000X avec un milieu sans sérum / DMEM F12 - 200 × la concentration finale. Traiter les cellules avec 1 pi inhibiteurs de la seconde piste de messagerie pour être testés pour leur implication dans la neurotoxicité / neuroprotection 30 min avant de commencer la cytotoxicité, pour inhiber les voies respectives. Retour le E-Plate 96 de la gare et reprendre les mesures expérimentales de l'indice de la cellule.
2. Après 30 min de pause à nouveau l'expérience. Retirez délicatement milieu de prolifération pleinement de l'E-Plate 96 puits avec une pipette (ou multi-canal pipette), en prenant soin de ne pas perturber la couche de cellules adhérentesen orientant le bord de la pointe de la pipette à l'angle du puits. Ajouter 200 pl / puits de DMEM sans sérum / milieu F12 (milieu de privation de sérum). Assurer un échange rapide d'un milieu de culture cellulaire pour réduire au minimum l'agitation mécanique des cellules.
3. Diluer les composés à tester pour leurs effets neuroprotecteurs de 1,000X actions avec le milieu DMEM / F12 sans sérum à 200 × la concentration finale. Ajouter 1 composés de pi à tester leurs effets neuroprotecteurs et 1 pi inhibiteurs de la seconde piste de messagerie dans les puits individuels selon le plan expérimental.
4. Dans les cellules pour des études de prolifération ne changez pas moyen. Diluer les composés à tester de 1,000X actions à 200 × la concentration finale dans le milieu de la prolifération, de traiter avec 1 l par puits et continuer à la culture en milieu de prolifération.
5. Reprendre l'expérience pour poursuivre Index cellulaires mesures toutes les 15 minutes pendant 96 heures comme indiqué précédemment.

4. données Analyse

1. Pour neurotoxicité / données de neuroprotection normaliser l'indice cellulaire au dernier point de temps avant le traitement pharmacologique ou changement de milieu pour réduire les variations entre les expériences en sélectionnant "Cell normalisée Index" et "normaliser Time" sur la page de la parcelle.
2. Mettez en surbrillance les puits sur la page de la parcelle pour les conditions expérimentales d'intérêt et cliquez sur "Ajouter" pour tracer les courbes normalisées de l'indice de la cellule. Observer la cinétique de l'effet neurotoxique / neuroprotecteur, ou de messagers deuxième inhibition que les courbes de l'indice cellulaire normalisées en fonction du temps.
3. Respecter les courbes de l'indice de portable pour les traitements médicamenteux testés en milieu de prolifération en fonction du temps d'évaluer si un effet sur la prolifération est impliqué dans l'effet neuroprotecteur / neurotoxique.
4. Exporter l'info expérimental pour tous les points Cell temps Indice de la page du logiciel Indice de cellules dans un fichier Excel pour lancer l'évaluation statistique des résultats
   NOTE: Dans une première étape dans l'analyse statistique, un ensemble de programmes MATLAB modifiés qui utilisent le test t de Welch, avec le p-valeur tracée semilogarithmically, utiliser axe inversé sur l'échelle de temps (à condition que les fichiers de code supplémentaires). Ces programmes permettent la détection des valeurs de p au-dessus de l'évolution temporelle de l'ensemble de l'expérience en temps réel de l'analyseur de la cellule, et ainsi faciliter la sélection de points dans le temps pour l'analyse statistique plus détaillée. Voir le matériel complémentaire pour des informations détaillées sur les programmes.
5. Pour l'analyse statistique des différences cellulaires valeurs de l'indice sous différentes conditions de traitement à des moments spécifiques, sélectionnez des valeurs de l'indice cellulaire à des moments respectifs à partir du fichier Excel exporté. Analyser les valeurs de l'indice de la cellule pour les points de temps choisis avec un sens ou dans les deux sens l'analyse de variance (Anova) suivie d'un test post-hoc en utilisant un logiciel statistique.

Résultats

Privation de sérum conduit à diminuer dans les piles valeurs de l'indice, qui peuvent être surveillés en permanence avec la cellule d'analyse en temps réel

Stimuli neurotoxiques aux cellules conduisent à une diminution de cellulaires valeurs de l'indice, qui peut être surveillé en temps réel avec la technique présentée et dont la dynamique dépend de la relance neurotoxique spécifique et le type de cellule étudiée. Figure 2 mo...

Discussion

Le protocole actuel présente l'utilité d'une cellule d'analyse en temps réel pour évaluer de façon continue et dans des conditions sans étiquette / les effets neuroprotecteurs des composés neurotoxiques dans des lignées cellulaires neuronales et pour mieux comprendre les secondes voies de messagers impliqués dans l'effet.

Même si l'utilité du temps réel analyseur de cellules pour étudier la cytotoxicité et les effets des médicaments sur la prolifération ce...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate