Phantoms simulant un tissu pour l'évaluation du potentiel proche infrarouge Applications d'imagerie de fluorescence en chirurgie du cancer du sein

Résumé

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Résumé

Inexactitudes dans la localisation de la tumeur peropératoire et l'évaluation des résultats de la marge chirurgicale dans le résultat sous-optimal de la chirurgie mammaire conservatrice (CMC). L'imagerie optique, en particulier d'imagerie par fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF), peut réduire la fréquence des marges chirurgicales positives suivant BCS en fournissant au chirurgien un outil de localisation de la tumeur avant et peropératoire en temps réel. Dans l'étude actuelle, le potentiel de BCS NIRF-guidée est évaluée en utilisant des fantômes de tissu mammaire simulant pour des raisons de fins de normalisation et de formation.

fantômes de sein avec des caractéristiques optiques comparables à celles du tissu mammaire normal ont été utilisés pour simuler la chirurgie mammaire conservatrice. Tumeur simulant inclusions contenant le colorant fluorescent vert d'indocyanine (ICG) ont été incorporés dans les fantômes à des endroits prédéfinis et imagé pour la localisation de la tumeur avant et peropératoire, la résection de la tumeur en temps réel NIRF-guidée, NIRF-guidéeévaluation de l'étendue de la chirurgie, et l'évaluation des marges chirurgicales post-opératoires. Une caméra NIRF mesure a été utilisée comme un prototype clinique à des fins d'imagerie.

fantômes mammaires contenant des inclusions de tumeurs simulation offrent un outil simple, peu coûteux et polyvalent pour simuler et évaluer l'imagerie peropératoire de la tumeur. Les fantômes gélatineux ont des propriétés élastiques semblables au tissu humain et peuvent être coupés à l'aide d'instruments chirurgicaux classiques. De plus, les fantômes et contiennent de l'hémoglobine pour l'intralipide imitant absorption et la diffusion de photons, respectivement, ce qui crée des propriétés optiques uniformes semblables à un tissu de sein humain. Le principal inconvénient de l'imagerie NIRF est la profondeur de pénétration limitée de photons lors de la propagation à travers le tissu, ce qui empêche (non invasif) imagerie de tumeurs profondes avec les stratégies épi-illumination.

Introduction

chirurgie mammaire conservatrice (BCS) suivie d'une radiothérapie est le traitement standard pour les patients atteints de cancer du sein avec T _{1-T 2} carcinome du sein ^1,2. Inexactitudes dans l'évaluation peropératoire de la mesure de résultat de la chirurgie des marges chirurgicales positives dans 20 à 40% des patients qui ont subi BCS, nécessitant une intervention chirurgicale supplémentaire ou une radiothérapie ^3,4,5. Bien résection étendue des tissus sains adjacents du sein pourrait réduire la fréquence des marges chirurgicales positives, ce sera aussi entraver le résultat esthétique et augmenter comorbidité ^6,7. De nouvelles techniques sont donc nécessaires que de fournir une rétroaction sur la position peropératoire de la tumeur primaire et l'étendue de la chirurgie. L'imagerie optique, en particulier la fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) d'imagerie, peut réduire la fréquence des marges chirurgicales positives suivantes BCS en fournissant au chirurgien un outil de localisation de la tumeur avant et en per-opératoire rEAL-temps. Récemment, notre groupe a rapporté sur le premier essai chez l'humain de l'imagerie de fluorescence de la tumeur ciblée chez les patients atteints de cancer de l'ovaire, montrant la faisabilité de cette technique pour détecter des tumeurs primaires et des métastases par voie intrapéritonéale avec une sensibilité élevée ^8. Avant de procéder à des études cliniques chez des patients atteints de cancer du sein, toutefois, la possibilité d'NIRF différentes applications d'imagerie de tumeurs ciblées dans BCS peut déjà être évaluée en utilisant des fantômes préclinique.

Le protocole de recherche suivant décrit l'utilisation de l'imagerie NIRF dans des fantômes de simulation de tissus mammaires contenant des inclusions de tumeurs fluorescentes simulant ^9. Les fantômes constituent un outil peu coûteux et polyvalent pour simuler la résection localisation de la tumeur avant et peropératoire, en temps réel NIRF-guidé tumeur, l'évaluation de l'état de la marge chirurgicale, et la détection de la maladie résiduelle. Les fantômes gélatineux ont des propriétés élastiques semblables au tissu humain et peuvent être coupés à l'aide de classiqueinstruments urgical. Au cours de la procédure chirurgicale simulé, le chirurgien est guidé par l'information tactile (dans le cas d'inclusions palpables) et l'inspection visuelle de la zone opératoire. En outre, l'imagerie NIRF est appliquée pour fournir au chirurgien un retour d'information en temps réel sur la mesure per-opératoire de chirurgie.

Il convient de souligner que l'imagerie NIRF nécessite l'utilisation de colorants fluorescents. Idéalement, les colorants fluorescents doivent être utilisés qui émettent des photons dans la plage spectrale de l'infrarouge proche (650-900 nm) afin de minimiser l'absorption et la diffusion des photons par des molécules physiologiquement abondantes dans les tissus (par exemple, l'hémoglobine, les lipides, l'élastine, le collagène, et de l'eau) ^10,11. En outre, autofluorescence (c.-à-, l'activité de fluorescence intrinsèque dans les tissus en raison de réactions biochimiques dans les cellules vivantes) est minimisé dans le domaine du proche infrarouge du spectre, ce qui entraîne des ratios optimaux ¹¹ tumeur à-fond. En conjuguant NIRF teint de tumeur targeted fragments (par exemple, des anticorps monoclonaux), l'administration ciblée de colorants fluorescents peuvent être obtenus pour des applications d'imagerie per-opératoires.

Comme l'oeil humain est insensible à la lumière dans la plage spectrale de l'infrarouge proche, un dispositif de caméra très sensible est nécessaire pour l'imagerie NIRF. Plusieurs systèmes d'imagerie NIRF pour l'utilisation peropératoire ont été développés jusqu'à présent ^12. Dans la présente étude, nous avons utilisé une coutume construire NIRF système d'imagerie qui a été développé pour une application peropératoire en collaboration avec l'Université technique de Munich. Le système permet l'acquisition simultanée des images en couleurs et des images de fluorescence. Pour améliorer la précision des images de fluorescence, un système de correction est mis en œuvre pour des variations d'intensité de lumière dans le tissu. Une description détaillée est fournie par Themelis et al ^13.

Protocole

1. créer des moules en silicone pour Inclusions tumorales simulant

1. Ramassez les objets solides de la forme désirée et la taille qui peuvent servir de modèles pour des inclusions de tumeur simulant, par exemple, des perles ou des billes.
2. Nettoyer soigneusement les modèles de tumeurs. Afin d'assurer un enlèvement facile du moule de silicone, les modèles de tumeurs peuvent être pulvérisées avec un anti-adhérent par pulvérisation ou recouverts d'une mince couche de vaseline ou la cire d'abeille.
3. Placez chaque modèle dans un carré paroi mince boîtier séparé (plastique) avec une surface lisse. Si nécessaire, fixer le modèle de la partie inférieure de la boîte pour le maintenir en position. Utilisation d'une boîte qui est légèrement plus grand que le modèle de la tumeur elle-même pour éviter de perdre des quantités excessives de silicone.
4. Verser la quantité requise de composant silicone A dans un bol à mélanger et ajouter le composant B de silicone dans un rapport de 10: 1 en poids. Bien mélanger les deux composants. Eventuellement, une pompe à vide peut être utilisé pour éliminer les bulles d'air du mélange de silicone.
5. Doucement pour le mélange de silicone dans la boîte en plastique pour éviter la formation de bulles. Le mélange de silicone doit être traité dans les 45 minutes pour obtenir des résultats optimaux.
6. Laisser le mélange de silicone pour solidifier au moins 6 heures avant de le couper et de retirer le moule du modèle de tumeur. Eventuellement, le moule en silicone peut être découpé selon un motif en zigzag pour lui permettre de s'adapter ensemble arrière proprement. La force maximale de la silicone est obtenu au bout de 3 jours.

2. Créez solution saline tamponnée au Tris

1. Créer une solution saline tamponnée au Tris (TBS) en ajoutant une solution de 6,1 g (50 mM) de Tris et 8,8 g (150 mM) de NaCl à 800 ml d'eau désionisée.
2. Ajouter 1,0 g (15 mmol) de _NaN3 pour bloquer l'oxygénation de l'hémoglobine (étape 3.3 et 4.4) et à inhiber la croissance bactérienne. ATTENTION: NaN ₃ est un poison grave. Il peut être mortel en contact avec la peau ou ingestion. La toxicité de ce composé est comparable à celle des cyanures alcalins solubles et la dose mortelle pour un être humain adulteest d'environ 0,7 g. Toujours suivre les consignes de sécurité fournies par le fabricant.
3. Ajuster le pH à 7,4 et porter le volume à 1000 ml avec de l'eau désionisée.

3 Créer fluorescentes Inclusions

1. Ajouter 2 g d'agarose à 50 ml de TBS à partir de l'étape 2 Le point de fusion plus élevé par rapport à de l'agarose gélatine (étape 4.2) empêche les inclusions de se dissoudre et de fuite de colorant fluorescent lorsqu'il est placé dans de la gélatine fondue. En option, la quantité d'agarose ajouté peut être modifiée pour une ou 3 g d'obtenir des inclusions plus tendres ou palpables tumorales, respectivement.
2. Chauffer la suspension d'agarose en utilisant un four micro-ondes jusqu'à ce que le point d'ébullition est atteint. Mélangez soigneusement jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous.
3. Ajouter 1,1 g (17 mol) et de l'hémoglobine 5 ml d'Intralipid à 20% dissous dans 50 ml de TBS au mélange sous agitation constante agarose à ressembler à des caractéristiques optiques du tissu mammaire environnant fantôme (étape 4).
4. Ajouter 20,0 mg (250,8 pmoles) du colorant fluorescent vert d'indocyanine à 83,8 ml d'eau désionisée. Assurez-vous que le colorant soit complètement dissous.
5. Pipette 5,0 ml de cette solution et l'ajouter au mélange d'agarose pour obtenir une concentration finale de 14 uM. Eventuellement, d'autres colorants fluorescents que l'ICG peuvent être utilisés si on le désire avec leur concentration optimale.
6. Remplir délicatement les moules en silicone créés à l'étape 1 avec le mélange agarose chaude à l'aide d'une seringue (figure 1A). Répétez ce processus jusqu'à ce que toutes les moules sont remplis.
7. Laissez les inclusions fluorescentes se solidifient à la température ambiante pendant environ une heure. Protéger les inclusions de la lumière en couvrant l'ensemble du moule de papier d'aluminium.
8. Après solidification, ouvrez délicatement le moule et appuyez sur l'inclusion (figure 1B). En option, utilisez la pointe de la seringue pour appliquer de petites gouttes de mélange agarose fondu sur la surface de l'inclusion. En répétant ce processus plusieurs fois sur le même emplacement, petit tuéperons mor peuvent être créés pour simuler des tumeurs infiltrantes.
9. Protéger les inclusions d'agarose de la lumière et de la déshydratation en les enveloppant dans du papier d'aluminium et les stocker dans un réservoir de stockage humide à 4 ° C.
   REMARQUE: L'utilisation de concentrations de colorant fluorescent inférieures ou supérieures à l'optimum de concentration connue sera à la fois résultat en diminution de l'intensité du signal fluorescent. La réduction apparemment paradoxal de l'intensité du signal avec l'augmentation des concentrations de colorant supérieures à la concentration optimale de colorant fluorescent est due à un phénomène connu sous le nom de trempe. Lors de l'évaluation de la profondeur de pénétration maximale d'un colorant fluorescent dans des fantômes, en utilisant la concentration optimale est obligatoire.

4 Créer Phantoms mammaires

1. Obtenir un moule en forme de coupe afin de créer des fantômes mammaires de la taille désirée et le volume, par exemple, un bol en verre ou en plastique. Le moule doit avoir une surface lisse pour éviter la gélatine sous forme d'adhérer au moule. Un volum moulee de 500 ml permettra de créer des fantômes du sein de taille suffisante.
2. Pour créer un fantôme du sein avec un volume de 500 ml, ajouter 50 g de gélatine 250 fleurs pour 500 ml de TBS (étape 2). Chauffer la suspension de la gélatine à 50 ° C sous agitation constante.
3. Une fois que la gélatine soit complètement dissoute, que le mélange de gélatine et refroidir progressivement le maintenir à une température constante de 35 ° C en utilisant un bain d'eau chaude.
4. Sous agitation constante, ajouter 5,5 g (85 mmol) de l'hémoglobine bovine et 25 ml d'Intralipid à 20% pour simuler l'absorption et la diffusion des photons dans le tissu, respectivement.
5. Prérefroidissement du moule en forme de coupelle à 4 ° C pendant au moins 1 heure. Verser ensuite le mélange de gélatine dans le moule à un niveau qui correspond à la profondeur prédéterminée de l'insertion de la tumeur simulant agarose (figure 1C). Laisser le mélange de gélatine se solidifier à 4 ° C pendant 30 minutes à une heure.
6. Après solidification, positionner une inclusion agarose fluorescent simulant une tumeur à la surface de le fantôme et temporairement rivent l'inclusion avec une petite aiguille. Jusqu'à un maximum de trois inclusions fluorescentes simulant une tumeur peuvent être incorporés dans un seul fantôme du sein. Un espace suffisant (au moins 5 cm) doit être maintenue entre inclusions tumorales simulant individuels (Figure 1D).
7. Verser le reste du mélange de gélatine à chaud dans le volume restant du moule, ce qui permet l'adhérence de ces deux couches, sans créer d'artefacts de réfraction. Marquer l'emplacement des inclusions de tumeurs fluorescentes simuler sur le moule. Laissez le fantôme solidifier O / N à 4 ° C.
8. Une fois solidifié, enlever les aiguilles utilisées pour la fixation temporaire des inclusions et retirez délicatement le fantôme du sein de son moule (figure 1E). Protéger le fantôme du sein de la lumière et de la déshydratation en l'enveloppant dans une feuille d'aluminium et le stocker dans un réservoir de stockage humide à 4 ° C.

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Figure 1: les étapes séquentielles consistant à créer des fantômes mammaires tumorales contenant des inclusions simulant fluorescents. Après la création des moules en silicone de la forme et de la taille désirée, les moules sont remplis avec le mélange fondu d'agarose à l'aide d'une seringue (A). inclusions de tumeur simulant de taille et de forme différentes ont été produites dans la présente étude (B). Ensuite, une mince couche de mélange de gélatine fondue est coulée dans un moule revêtu de mesure du sein en bois (C). Après solidification, les inclusions de tumeurs simulant sont positionnés, obsédés temporairement, et recouverts d'une couche de mélange de gélatine fondue (D). Après solidification, le fantôme du sein est doucement retiré de son moule (E). Le spectre peut alors être appliquée pour simuler diverses applications d'imagerie NIRF (F).ref = "/ files / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5 Réglez le système de caméra NIRF

1. Système d'appareil photographique pour une application intra-opératoire NIRF est nécessaire pour simuler l'imagerie par NIRF ciblée dans la chirurgie du cancer du sein. Plusieurs systèmes d'imagerie pour NIRF en temps réel NIRF peropératoire imagerie sont actuellement disponibles pour utilisation expérimentale. Bien qu'il existe certaines différences entre ces dispositifs, ils contiennent tous une source de lumière d'excitation (l'excitation des inclusions de tumeurs fluorescentes) et un dispositif d'imagerie hautement sensible pour la détection des photons émis.
2. Assurez-vous d'utiliser une source de longueur d'onde suffisante de lumière d'excitation. Pour les inclusions simulant une tumeur contenant l'ICG, utiliser une source de lumière d'excitation (par exemple laser) qui émet des photons entre 750 et 800 nm. Si un colorant fluorescent alternative est utilisée, la longueur d'onde d'excitation doit être ajustée conforme la ma les instructions du fabricant concerné.
3. Dans le cas où le système de caméra NIRF contient un filtre d'émission pour filtrer les bruits de fond indésirables, assurez-vous que le bon filtre est utilisé. Pour inclusions tumorales simulant contenant ICG, utiliser un filtre d'émission entre 800 et 850 nm. Colorants fluorescents alternatifs peuvent nécessiter filtres d'émission différentes, selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Assurez-vous qu'il existe un chevauchement nul entre l'excitation et la longueur d'onde d'émission pour éviter les images trop saturées. En outre, le temps d'acquisition d'image peut être ajustée pour obtenir des images fluorescentes optimales. Dans le cas des inclusions fluorescentes profondément enracinés ou des signaux fluorescents faibles, l'image du temps d'acquisition peut être augmentée jusqu'à plusieurs secondes à min. Dans le cas d'inclusions superficielles ou des signaux fluorescents solides, le temps d'acquisition peut être réduit à quelques millisecondes pour tenir compte du taux vidéo imagerie de fluorescence en temps réel.

e "> 6. Simulation des demandes NIRF imagerie en chirurgie du cancer du sein

1. Prendre le sein fantôme simulant un tissu de son récipient et placez-le sur une surface plane non fluorescent. Ensuite, placer le dispositif de formation d'image au-dessus de la NIRF fantôme du sein, en laissant une distance de travail suffisant pour l'excision des inclusions de tumeurs simuler.
2. Localiser l'inclusion fluorescent tumeur simulant NIRF utilisant l'imagerie et / ou la palpation du sein fantôme. Dans le cas où aucun signal de fluorescence peut être détectée, l'inclusion est soit placé trop profondément dans le fantôme pour la détection ou le temps d'acquisition d'image doit être augmentée.
3. Une fois que l'inclusion est localisée, inciser le fantôme du sein et enlever l'inclusion de la tumeur simulant sous en temps réel NIRF d'orientation à l'aide d'instruments chirurgicaux classiques. Alternativement, l'inclusion peut être excisé guidé uniquement par inspection visuelle et palpation du fantôme du sein pour simuler la norme des soins.
4. Directement après l'enlèvementde l'inclusion de la tumeur simulant, l'image de la cavité chirurgicale pour toute activité fluorescent restant indiquant excision insuffisante.
5. Dans le cas d'une activité fluorescente restant, exciser le reste de l'inclusion, sous la direction de NIRF directe jusqu'à aucun signal fluorescent est à gauche.
6. L'image des fragments de fantômes excisées pour simuler macroscopique évaluation de l'état de la marge NIRF guidée. Présentes, coupez le tissu fantôme en 3 - 5 plaques mm et l'image des plaques en conséquence. Le signal de fluorescence atteint dans les marges chirurgicales indique l'existence de marges chirurgicales positives.

Résultats

Les résultats de cette étude ont été rapportés ailleurs ^9.

Nos données montrent que l'imagerie NIRF peut être appliquée pour détecter les inclusions de tumeurs fluorescentes en simulant des fantômes de tissu mammaire simulant, en simulant une chirurgie mammaire conservatrice NIRF guidée chez les patients atteints de cancer du sein. L'utilisation de notre modèle fantôme, nous avons trouvé localisation peropératoire de la tumeur, la résection de la tumeur NIR...

Discussion

Nous avons simulé des applications cliniques potentielles de BCS NIRF guidées par l'utilisation de fantômes en forme de sein avec des inclusions de tumeurs simulation intégrés. Localisation peropératoire de la tumeur, la résection de la tumeur NIRF guidée, l'évaluation de l'étendue de la chirurgie, et l'évaluation des marges chirurgicales post-opératoires ont été trouvées tout réalisable en utilisant un système de caméra NIRF construire sur mesure. Détection non invasive de la tumeur i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine hemoglobin	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	H2500	Simulates absorption of photons in tissue
Intralipid 20%	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	I141	Simulates scattering of photons in tissue
Silicone A translucent 40 (2-components poly-addition silicone)	NedForm, Geleen, The Netherlands		Package consists of components A and B, that should be mixed one on one (A:B=10:1).  Link to manufacturers page: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 Bloom	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	48724	Construction of breast-shaped phantoms
Agarose	Hispanagar, Burgos, Spain		Construction of tumor-simulating inclusions
Tris	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	T1503
HCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	258148
NaCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	S9888
NaN3	Merck, Darmstadt, Germany	822335	CAUTION: severe poison. The toxicity of this compound is comparable to that of soluble alkali cyanides and the lethal dose for an adult human is about 0.7 grams.
Examples of NIRF imaging devices for intraoperative application:
T2 NIRF imaging platform	SurgVision BV, Heerenveen, The Netherlands		Customized NIRF imaging system used in the current study. More details available at www.surgvision.com
Photodynamic Eye	Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, Germany	PC6100	www.iht-ltd.com
FLARE imaging system kit	The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USA		www.theflarefoundation.org
Fluobeam	Fluoptics, Grenoble, France		www.fluoptics.com
Artemis handheld camera	Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, the Netherlands		www.quest-mi.com
Examples of NIRF fluorescent dyes for intraoperative application:
Indocyanine green	ICG-PULSION,  Feldkirchen, Germany	PICG0025DE	Clinical grade fluorescent dye for NIRF imaging used in the current study. More details available at www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA	929-70021	www.licor.com