Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

Résumé

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Résumé

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introduction

Les ganglions lymphatiques sont des compartiments spécialisés où les réponses immunitaires adaptatives contre des antigènes étrangers autonomes et sont initiés et coordonnés. La procédure présentée ici décrit une digestion enzymatique courte combinée avec pipetage mécanique automatisé pour obtenir des ganglions lymphatiques suspension cellulaire unique et accéder aux cellules stromales ganglionnaires viables qui maintiennent l'expression de surface de plusieurs molécules.

former cellules stromales ganglionnaire l'échafaud du ganglion lymphatique et remplit trois grandes fonctions: ils filtrent première fluides corporels pour déguster des antigènes, des agents pathogènes et leur pathogène motif moléculaire associé (PAMP), ainsi que des cytokines et danger motif moléculaire associé (atténue) présente dans le corps. Deuxièmement, ils attirent et instruisent les cellules présentatrices d'antigènes (APC) et des lymphocytes d'interagir et d'initier des réponses immunitaires adaptatives; et la troisième, ils fournissent un environnement structurel pour l'homéostasie et la différenciation des lymphocytes ¹-3. Pendant les cellules ganglionnaires du stroma de l'inflammation produisent des facteurs de croissance, des cytokines et des chimiokines, à adapter l'organisation de gonflement ainsi l'interaction entre les cellules dendritiques (DCs), T et les cellules B. L'orchestration de réponses immunitaires est seulement possible en raison de l'architecture structurale complexe formé par les différentes populations de cellules stromales.

Les cellules stromales de ganglions lymphatiques sont des cellules CD45 négatives et peuvent être distinguées par l'expression de CD31 ou de gp38 dans les cellules endothéliales et fibroblastiques ^{1 -6.} Gp38 ⁺ CD31 ^- définit les cellules de la zone T réticulaire (TRC, également connu sous le FRC: les cellules réticulaires fibroblastiques), gp38 ⁺ CD31 ⁺ définit cellules lymphatiques endothéliales (LEC), gp38 ^- CD31 ⁺ définit les cellules endothéliales de sang (BEC). En outre, la caractérisation des sous-populations a révélé l'existence d'autres cellules stromales de ganglions lymphatiques. En effet, une petite population de cellules pericyte comme a été caractérisée dans legp38 ^- CD31 ^- population ^7. Par conséquent, l'adaptation de la procédure d'isolement est avantageux pour l'identification et la caractérisation des propriétés fonctionnelles différentes cellules stromales de ganglions lymphatiques.

Avant le développement des ganglions lymphatiques cellules stromales digestion protocoles de l'étude des cellules stromales de ganglion lymphatique a été limitée à des observations in situ en utilisant la section de tissu et la microscopie. Néanmoins, des études structurales et fonctionnelles ont montré des caractéristiques importantes des cellules stromales de ganglions lymphatiques. Les cellules stromales de ganglions lymphatiques sont associés à podoplanin, du collagène et de la matrice extracellulaire des protéines (ECM) pour former un complexe d'une structure en 3 dimensions appelé système de conduites qui transporte les protéines lymphatiques et de masse moléculaire associé-bas à partir du sinus sous-capsulaire du ganglion de la haute endothéliale veinules dans la zone des cellules T ^8. DCs sont en contact étroit avec les cellules du stroma et peut être observé dans la saillie tubulaire constructure duit à l'échantillon liquide et de détecter les antigènes ^8. L'interaction des cellules stromales de ganglions lymphatiques (TRC et ESL) avec les PED est médiée par la presse et la présentation des chimiokines CCL21 et CCL19 ^9,10. CCL19 et CCL21 sont reconnus par le récepteur CCR7 faciliter les DC et les cellules T à migrer vers la zone des cellules T des ganglions lymphatiques ^4,11. Malgré l'utilisation de chimiokines similaires, les cellules T ont PED et les routes de migration différentes dans les ganglions lymphatiques ^12. Par la suite, en utilisant une digestion enzymatique de ganglion lymphatique et de l'isolement des cellules stromales de ganglions lymphatiques pures, des études fonctionnelles ont été effectuées sur le rôle des différentes cellules des ganglions lymphatiques de stroma et de leur capacité à interagir avec des DC et des lymphocytes T / B ^6,13. Tout d'abord, la diaphonie entre les cellules T productrices d'IFN-effectrices de γ et de cellules stromales de ganglions lymphatiques induit la production d'oxyde nitrique du métabolite montré à atténuer les réponses des lymphocytes T et la prolifération dans des organes lymphoïdes secondaires ^{14 à 16.} Deuxièmement, la lymphe node cellules stromales ont été rapportés pour soutenir la différenciation de sous-ensembles de régulation à courant continu par l'intermédiaire de la production d'IL-10 ^17, et à moduler naïf homéostasie des cellules T par l'intermédiaire de la production d'IL-7 ^6,18. En troisième lieu, l'expression des TLR dans les cellules stromales de ganglions lymphatiques suggère que les cellules stromales sont sensibles à un signal dérivé de l'infection ou des auto-molécules libéré au cours de la lésion tissulaire. En effet, le traitement de cellules stromales de ganglions lymphatiques avec le ligand de TLR3 poly (I: C) induit une régulation à la hausse modeste de grande expression d'histocompatibilité de classe complexe I et la régulation positive de co-inhibiteur molécule PD-L1, mais pas de molécules de costimulation, ce qui des changements dramatiques dans les tissus périphériques antigènes expression ^19. Plusieurs groupes ont montré des cellules stromales de ganglions lymphatiques expriment des antigènes de tissus périphériques et induire une tolérance des cellules T autoréactives ^19,21-27. Par conséquent, la compréhension des interactions entre les cellules stromales de ganglions lymphatiques et l'autre re migratoire etcellules ganglionnaires sident aideront à trouver de nouvelles molécules cibles pour permettre l'activation ou la suppression de la réponse immunitaire lors de l'inflammation. Par conséquent, la mise en œuvre de la séparation enzymatique de la publication du ganglion lymphatique est nécessaire.

Protocoles publiés précédemment utilisent différentes combinaisons de base de la collagénase-digestion enzymatique avec une faible contrainte mécanique ^6,19,20. Cependant, de longues incubations avec des enzymes de digestion ou de la combinaison différente de digestion enzymatique peuvent dégrader diverses molécules de surface nécessaires pour analyser l'état d'activation et d'identifier de nouvelles cellules stromales ganglionnaires. Selon le type de l'analyse de cellules du stroma, le Protocole de liaison Protocole Fletcher ou peut-être plus approprié. Dans la procédure décrite, une digestion enzymatique légèrement plus courte est associée à la ventilation mécanique automatisé pour minimiser la dégradation de surface marqueur des cellules stromales nœud lymphatiques viable. Cette procédure permet d'isoler hautement reproductible etdistinction des populations de cellules stromales de ganglions lymphatiques avec une faible variabilité et plus de 95% de viabilité. Les cellules stromales de ganglions lymphatiques fraîchement isolées peuvent être directement utilisés pour l'expression de marqueurs de surface, l'analyse des protéines, et des études de la transcription, ainsi que la création de lignées de cellules stromales pour effectuer des tests fonctionnels in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Dans cette publication vidéo et de protocole, toutes les procédures d'animaux ont été réalisées conformément au protocole approuvé pour les animaux par cantonal Autorité de Bâle-Ville, Suisse.

1. ganglions lymphatiques Préparation et digestion

1. L'eau de pré-chauffage dans un bêcher à 37 ° C sur un agitateur magnétique à plaque chauffante.
2. Préparer de base moyen de la manière suivante: milieu DMEM (sans pyruvate) supplémenté avec 2% de FCS, 1,2 mM de _CaCl2 et Pen / Strep (100 unités de pénicilline, 100 ug de streptomycine).
3. Stériliser tous les instruments de dissection avant utilisation.
4. Euthanasier souris ganglionnaire donateurs par CO ₂ asphyxie et disséquer de façon aseptique les ganglions lymphatiques. Ne pas disséquer la graisse entourant. NOTE: Ce protocole est optimisé pour le noeud périphérique drainage lymphatique peau (inguinale, brachiale, axillaire).
5. Placez les ganglions lymphatiques dans une boîte de Pétri stérile contenant 2 ml de glace milieu basique froid.
6. Perturber le ganglion lymphatique capsule l'aide de deux aiguilles de 25 G fixés sur seringue de 1 ml.
7. Transférer le tissu des ganglions lymphatiques perturbé dans un tube à fond rond de 5 ml contenant 750 polypropylène milieu de base supplémenté avec ul de 1 mg / ml de collagénase IV et 40 ug / ml de DNAse I.
8. Ajouter un agitateur magnétique stérile dans chaque tube.
9. Placer le tube dans le bécher avec 37 ° C préchauffé eau et remuer les tubes à une vitesse lente (1 tour / s) pendant 30 min.
10. Retirer le tube de l'agitateur magnétique avec plaque chauffante et laisser des fragments de ganglions lymphatiques s'installent.
11. Retirez délicatement le surnageant enrichi en "cellule non-stromal". REMARQUE: Si l'analyse de T, B, les cellules dendritiques et CD45 ^- CD31 ^- gp38 ^- est prévu, sauf la "cellules stromales non" fraction.
12. Laver le tissu des ganglions lymphatiques restant une fois avec 750 pi de milieu basique. REMARQUE: Cette étape est nécessaire uniquement si vous travaillez avec des souris immuno-compétentes.
13. Laissez fragments de ganglions lymphatiques s'installent.
14. Retirez lefraction flottante des cellules non-stroma.
15. Ajouter aux fragments de ganglion lymphatique 750 pi de milieu de base supplémenté avec 3,5 mg / ml de collagénase D et 40 pg / ml de DNase I.
16. Placer le tube de retour dans le bécher contenant 37 ° C préchauffé eau.
17. Digérer le tissu des ganglions lymphatiques de 5 min, tout en agitant lentement.
18. Lymphatiques fragments de tissus de noeud désagrégées par pipetage et mélange 700 ul de 10 cycles à la vitesse maximale à l'aide d'une pipette multicanaux automatisé. NOTE: Ce qui perturbe le tissu des ganglions lymphatiques pour améliorer la digestion.
19. Placer le tube de retour dans le bécher avec 37 ° C de l'eau préchauffée.
20. Des fragments de tissu de ganglion lymphatique digérer pendant encore 10 minutes tout en remuant lentement.
21. Ventiler fragments de tissus de ganglions lymphatiques par pipetage et mélange pendant 99 cycles à vitesse maximale à l'aide d'une pipette multicanaux automatisé.
22. Ajouter 7,5 pl d'EDTA 0,5 M pour assurer le maintien de la suspension de cellules isolées.
23. Des fragments de tissu de ganglion lymphatique Ventiler par tuyauPrép et en mélangeant pendant 99 cycles à vitesse maximale à l'aide d'une pipette multicanaux automatisé.
24. Ajouter 750 pi de milieu de base et passer les cellules à travers une maille de nylon de 70 um.
25. Centrifugeuse suspension cellulaire 5 min à 1500 xg, 4 ° C.
26. Les cellules stromales peuvent maintenant être utilisés pour une analyse ultérieure.

2. coloration des cellules des ganglions lymphatiques stromales

1. Utilisez une combinaison de l'anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anticorps anti-CD31 de reconnaître avec succès des cellules TRC, ESL, BEC et DN.
2. Incuber le tissu des ganglions lymphatiques digéré avec Live traqueur / Dead, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) dans 100 ul de HBSS contenant 2 % de FCS pendant au moins 20 min, 4 ° C, dans l'obscurité.
3. Laver les cellules en ajoutant 500 l de HBSS contenant 2% de SVF
4. Centrifugeuse suspension cellulaire 3 min à 1500 xg, 4 ° C.
5. Re-suspendre dans 100 ul de HBSS contenant 2% de FCS.
6. Exécutez les cellules colorées dans un cytomètre de flux EQUIPPed avec les optiques suivantes: source d'excitation avec un maximum de trois lasers: bleu (488 nm, refroidi par air, 20 mW à l'état solide), rouge (633 nm, 17 mW HeNe) et le violet (405 nm, 30 mW à l'état solide) .
7. Porte CD45 ^- cellules à exclure les cellules hématopoïétiques.
8. maillots Gate (FSC-W) et des cellules vivantes (ELS / trackers DEAD) à exclure doublets et les cellules mortes.
9. Terrain gp38 contre CD31 pour visualiser TRC (gp38 ⁺ CD31 ^-), ESL (gp38 ⁺ CD31 ^+), BEC (gp38 ^- CD31 ⁺⁾ des cellules (voir la figure 1) et DN (gp38 ^{- -} CD31).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Le présent protocole est un protocole de modification de digestion publié par Link et al. 2007 ⁶ avec un temps de digestion plus courte (45 minutes au maximum), en raison de la désagrégation mécanique avec une pipette à canaux multiples automatisé. En outre, la procédure est plus uniforme, minimise la dégradation de marqueurs de surface sur les différentes cellules du stroma de ganglion lymphatique et permet la manipulation de plus d'un échantillon à la fois.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L'étude des cellules stromales de ganglions lymphatiques est récemment devenu un axe de recherche en raison du développement de deux protocoles de digestion publiés ^6,13. Les deux protocoles sont suffisants pour obtenir des cellules stromales noeud unique lymphatiques, mais diffèrent dans l'utilisation d'enzymes de digestion et le temps de digestion. Etant donné que les cellules stromales et les marqueurs de surface sont sensibles à la digestion enzymatique et une contrainte mécanique, un ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Final concentration 2%
CaCl2	Sigma	499609	Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation		>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D	Roche	11088882001	use at 3.5 mg/ml
DNAse I	Roche	11284932001	use at 40 µg/ml
Stiring magnets	FAUST		5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml	Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function	IKA-RCT-standard	9720250
Petri dishes 100 mm, sterile	TPP	6223201
25 G needles	Terumo
anti mouse CD45 Ab	Biolegend		Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab	Biolegend		Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab	Biolegend		Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab	Biolegend		Clone MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a	Biolegend		Clone APA5
anti mouse CD80	Biolegend		Clone 16-10A1
anti mouse CD40	Biolegend		Clone 1C10
anti mouse I-Ab	Biolegend		Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)	Biolegend		Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit	Invitrogen	L10119