Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Résumé

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Résumé

La plupart des processus morphogénétiques dans l'intestin du foetus ont été déduites à partir des coupes minces de tissus fixés, présenter des instantanés de changements au cours des stades de développement. Des informations en trois dimensions à partir de coupes sériées minces peut être difficile à interpréter en raison de la difficulté de reconstituer des coupes en série et parfaitement maintenir l'orientation correcte du tissu sur coupes sériées. Les études récentes de Grosse et al., 2011 soulignent l'importance des trois dimensions informations pour comprendre la morphogenèse des villosités de l'intestin en développement ^1. Reconstruction tridimensionnelle de cellules intestinales individuellement marqués ont démontré que la majorité des cellules épithéliales de l'intestin contact avec les deux surfaces apicales et basales. En outre, la reconstruction en trois dimensions du cytosquelette d'actine à la surface apicale de l'épithélium a démontré que la lumière intestinale est continue et que les lumières secondaires sont un artefact de sectioning. Ces deux points, ainsi que la démonstration de la migration nucléaire interkinetic dans l'épithélium intestinal, définis l'épithélium intestinal en développement un épithélium pseudo et non stratifiées comme le pensait auparavant ^1. La capacité d'observer l'épithélium en trois dimensions a été décisif pour démontrer ce point et la redéfinition de la morphogenèse épithéliale dans l'intestin du foetus. Avec l'évolution des technologies d'imagerie multi-photonique et logiciel de reconstruction tridimensionnelle, la capacité de visualiser intact, le développement des organes s'améliore rapidement. Excitation à deux photons permet une pénétration moins dommageable plus profondément dans les tissus à haute résolution. Imagerie à deux photons et la reconstruction 3D de l'ensemble des intestins de souris fœtales à Walton et al., 2012 ont contribué à définir le modèle de villosités excroissance ^2. Nous décrivons ici un ensemble de système de culture d'organe qui permet le développement ex vivo de villosités et extensions de ce système de culture pour permettreles intestins pour être en trois dimensions imagé au cours de leur développement.

Introduction

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protocole

NOTE: Toutes les souris ont été traitées avec humanité en utilisant des protocoles approuvés par l'Université du Michigan Medical School Unité de médecine de laboratoire et les animaux selon les directives du Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux.

1 Tout le Système de culture d'organes

1. Préparation des milieux et des plaques de culture
   1. Dans une culture de tissu capot, enlevez 5 ml de BGJb médias de la bouteille de et ajouter 5 ml de Pen / Strep. Préparer un stock de travail des médias dans un tube conique de 50 ml, en ajoutant 1 ml de 5 mg / ml d'acide ascorbique à 49 ml de BGJb médias (avec Pen / Strep).
   2. Préparer une plaque de culture à 6 puits en ajoutant 1 ml de chacune des sous transwell.
      NOTE: Si les 6 transwell ne sont pas utilisés, déplacer transwell supplémentaires dans une plaque à 6 puits stérile frais pour une utilisation ultérieure. Ajouter 3 ml de travailler BGJb médias à chacune des trois boîtes de Pétri de 10 cm stériles.
2. Préparation pour la dissection
   1. Faire tremper les outils de dissection dans 70% ethanol et être sûr de garder les outils propres tout en travaillant.
   2. Mettre en place la zone de dissection avec un grand seau à glace et placer la plaque de culture à 6 puits et 10 cm boîtes de Pétri avec BGJb médias sur la glace. Travailler sur la glace autant que possible, tout en disséquant et la préparation des intestins de la culture.
   3. Anesthésier les souris femelles adultes dans une chambre avec isofluorane (100 pi) avant l'euthanasie par dislocation cervicale pour la récolte de l'intestin du foetus.
   4. Après la récolte, les fœtus de leur mère, en scène chaque fœtus soigneusement selon le tableau ¹³ Theiler mise en scène. Ne vous fiez pas aux jours post-coït pour déterminer l'âge de chaque fœtus comme des variations allant jusqu'à 24 heures dans le stade de développement sont régulièrement observés dans une seule portée.
3. Dissection de l'intestin du foetus
   1. Euthanasier fœtus par décapitation avant le retrait de l'intestin.
   2. Disséquer chaque intestin en tampon phosphate salin (DPBS) de 1x Dulbecco puis plaCE dans une boîte de Pétri de 10 cm de travailler BGJb médias.
   3. Retirez délicatement la rate de l'estomac et le pancréas de l'estomac et du duodénum supérieur.
   4. Séparez délicatement l'épiploon prenant soin de laisser l'épiploon attachée autant que possible et en séparant seulement assez de connexions pour permettre à l'intestin pour être redressé.
      NOTE: Pour les intestins plus que E14.5 ou ceux qui sont mis en culture pendant plus de 24 heures, séparer délicatement l'intestin en 3 segments égaux pour permettre contenu luminal de couler à travers l'intestin et être expulsés des extrémités coupées. Toutefois, pour les cultures commencé avant E13.5, attendre après 24 heures de culture avant de se séparer les 3 segments de l'intestin pour permettre la séreuse de croître correctement sur toute la longueur de l'intestin.
   5. Utilisez une pipette de bouche pour transférer les morceaux intestinales sur les transwell de la plaque de culture (1.1.2).
   6. Repositionner délicatement les intestins au besoin afin qu'ils soient directement à travers la transwell.
      NOTE: Une fois que les intestins commencent à s'installer contenu luminal dans le tube, les plier dans l'intestin entraînera une sauvegarde et des dommages à l'intestin.
4. Culture et le traitement
   1. Retirez le support sous le transwell, ajouter 700 ul de milieu de traitement (médias travaillent avec des protéines recombinantes ajoutés ou des inhibiteurs pharmacologiques) dans le cadre du transwell.
   2. Ajouter 300 ul de milieu de traitement goutte à goutte sur le dessus de l'intestin et laisser tremper à travers le transwell. Repositionner les intestins comme nécessaire.
   3. Changer agents de traitement au moins une fois par jour ou plus souvent fonction de la demi-vie du réactif de traitement.
5. Préparation de protéine des billes d'agarose imprégné d'une source localisée de réactif de traitement
   1. Remettre en suspension les billes d'agarose dans leur conteneur de stockage et transférer 100 pl de billes d'agarose dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
   2. Remplir le volume restant du tube avec 1x stérile Phosphate solution saline tamponnée (PBS) et mélanger les perles pour les laver. Placez le tube de centrifugeuse dans un rack pendant quelques minutes pour permettre aux billes de se déposent au fond et puis pipette au large de la PBS à partir au-dessus des perles. Remplir le tube de centrifugeuse stérile de PBS 1x et répéter deux fois plus le processus de lavage.
   3. Préparation de la protéine d'intérêt à deux fois la concentration désirée pour le traitement.
   4. Mélanger 5 pi de billes d'agarose lavés avec 5 pi de la protéine actions 2x et agiter doucement les perles dans la protéine. Placer le tube sur la glace pendant 1 heure, en mélangeant délicatement toutes les 10-15 min.
   5. Rincer les perles brièvement stérile 1x PBS avant de placer les perles sur les intestins.
6. Placement des billes d'agarose
   1. Placez délicatement les billes d'agarose sur le dessus de l'intestin à l'aide d'une pipette de bouche avec des aiguilles capillaires tirés. Placez les perles avec une extrême prudence, car une manipulation brutale peut endommager l'intestin et prévenir le développement des villosités dans la zone lésée.
   2. Placez deux fois plus de billes que nécessaire pour l'analyse depuis les intestins vont subir les mouvements péristaltiques et environ la moitié des billes placées roulera hors de l'intestin au cours de la durée de la culture.
7. Fixation des intestins culture
   1. Retirez délicatement les médias de traitement de dessous de la transwell et permettre aux intestins sécher à l'air pendant 3 min.
   2. Ajouter 1 ml de fixatif sous la Transwell pendant 2 min, puis recouvrir la partie supérieure de l'intestin avec 2 ml de fixatif pour le reste de la période de fixation. Fixer avec 4% de paraformaldéhyde O / N à 4 ° C ou pendant 2 heures à température ambiante.

2. imagerie de l'intestin fixes

1. Imagerie Wholemount
   1. Placez les intestins entiers (avec fluorescence endogène) sur une diapositive avec 100 pi de 1x DPBS. Utilisez une pince à organiser doucement les intestins.
   2. Utilisez un tissu de laboratoire pour retirer soigneusement les DPBS et ajouter immédiatement 100 pi de 70% de glycérol à faire la mo tissure transparente et augmenter la profondeur possible de l'imagerie.
      REMARQUE: Si une plus grande pénétration de l'intestin est souhaité, au lieu de monter l'intestin dans 70% de glycérol, tremper l'intestin dans quelques gouttes d'orientation claire solution pour 10-30 min. Pipeter au large de la solution mise au point claire et monter l'intestin avec le Mont Effacer.
   3. Tremper chaque des quatre coins d'une lamelle en pâte à modeler et ramasser une petite quantité d'argile à utiliser comme entretoises entre la lame et lamelle pour maintenir la lamelle de l'aplatissement de l'intestin.
   4. Sceller la lamelle sur la lame avec valap fondu appliquée avec un coton-tige.
   5. L'image sur les intestins soit un microscope confocal debout ou inversé. S'il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails.
2. Vibratome sectionnement de l'intestin fixes (pour une vue en coupe transversale de structures intestinales)
   1. Intégrer dans les intestins 7% d'agarose dans de petits moules en plastique (10 x 10 x 15 mm) et permettre aux blocs d'agarose àrefroidir et se solidifier.
   2. Retirer des blocs d'agarose à partir de moules en plastique et des blocs d'agarose colle à l'étape de collecte de vibratome avec de la colle instantanée.
   3. Remplir le stade de la collecte de froid de glace 1x DPBS.
   4. Couper des sections à une épaisseur comprise entre 100-150 um. Pour les sections plus épaisses utilisent les solutions de compensation (décrits dans la section 2.1.2) pour visualiser plus profondément dans la section.
   5. Verser vibratome sections de l'étape de la collecte dans un puits d'une plaque à 6 puits pour le stockage à 4 ° C.
3. Immunofluorescence, de tissus vibratome sectionnés fixes
   1. Placez 5-12 sections vibratome par puits dans une plaque de 24 puits avec 1x DPBS.
   2. Retirer 1x DPBS et ajouter 500 ul de solution de perméabilisation par puits. Secouez délicatement les échantillons pendant 25 min à température ambiante.
   3. Après perméabilisation, laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X.
   4. Bloquer les échantillons pendant au moins 30 min dans 500 pi de solution de blocage.
   5. Après blocage, eXCHANGE la solution de blocage avec 500 ul d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et conserver les échantillons à 4 ° CO / N.
      REMARQUE: Les dilutions d'anticorps primaires qui fonctionnent bien sur des coupes congelées et paraffine fonctionnent généralement bien sur vibratome sections aussi, cependant anticorps nécessitant l'extraction de l'antigène nucléaire en général ne fonctionnent pas bien avec ce protocole (par exemple, BrdU).
   6. Le jour suivant, laver les échantillons 3 fois pendant 15 min à chaque fois avec une solution de blocage.
   7. Après lavage, 500 ul d'appliquer l'anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage. Enveloppez la plaque de 24 puits dans du papier d'aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et de la roche les échantillons pendant 45 minutes à 2 heures à température ambiante.
   8. Laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X pendant 15 minutes chacun et monter les sections de vibratome sur des lames comme décrit à la section 2.4.
4. Montage sections vibratome
   1. Préparer des lames pour vibratome de montage par couper de fines tranches de double-stick bande et en les plaçant sur les côtés longs des lamelles.
   2. Placez délicatement 5-10 sections vibratome entre le ruban adhésif double-bâton sur les lames dans une goutte de 100 pi de PBS 1x.
   3. Déplier toutes les sections et les étaler en une seule couche sur la diapositive.
   4. Retirez tout excès d'agarose ou des morceaux inégaux qui empêcherait une lamelle de siéger plat.
   5. Soigneusement utiliser un tissu de laboratoire pour absorber l'excès de PBS 1x autour des sections de vibratome.
   6. Ajouter une goutte de milieu de montage aqueux sur des sections de vibratome et lamelle.
   7. Sceller les lamelles sur les lames avec fondu valap appliquée avec un coton-tige.
   8. Image, les sections de vibratome sur soit un microscope confocal droit ou inversé. S'il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails sur la sélection d'un système d'imagerie.

3. imagerie en direct de l'intestin entiers

Intestins récolté de fetuses après E12.5, avec l'épiploon connecté laissée intacte, développer avec succès villosités en culture en utilisant le système ci-dessus. Par conséquent, ce système ex vivo permet la capture d'images en direct z-section de l'intestin de développement qui peut être reconstituée pour une vue en trois dimensions de la morphogenèse au cours du temps.

1. Mise en place d'imagerie en temps réel
   1. Utilisez de la colle instantanée à respecter une membrane de polycarbonate individu à un tamis à mailles fines. Cela fournit un échafaudage de support pour maintenir l'intestin en place sous l'objectif de trempage du microscope confocal verticale. S'il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus de détails sur la sélection de microscopes d'imagerie en direct.
   2. Placer le tamis dans le puits central d'une plaque de culture.
   3. Placer l'intestin disséqué sur la membrane de polycarbonate et on ajoute une goutte de colle instantanée à chaque extrémité. Utilisez seulement assez de colle pour fixer l'intestin, mais pas l'enduire!
   4. Ajouter culture libre de médias de phénol rouge ci-dessous le polycarbonatemembrane dans le puits central de la plaque de culture.
   5. Ajouter de l'eau à la bordure extérieure de la plaque de culture à fournir de l'humidité.
   6. Depuis l'intestin foetal subit ondes péristaltiques analogues de contraction dans la culture, ajouter 100 ul d'une solution 1: 5 de xylazine dans du PBS 1x à 3 ml de milieu à contrôler les mouvements de l'intestin, tandis que l'imagerie. Cette posologie sera de contrôler les mouvements intestinaux pour environ 8-10 heures sans compromettre le développement des villosités.
   7. Pour une vue transversale de l'intestin, intégrer les intestins vivants dans une solution d'agarose à 3-4% et couper des sections épaisses (150-500 de um) sur un vibratome. Correspondre à la rigidité de l'agarose avec la rigidité de l'intestin étant déterminée empiriquement et couper le stade de développement. En général, une solution d'agarose à 3% fonctionne bien pour les intestins de moins de E14.5 et une solution à 4% fonctionne bien pour les intestins E15-E16.
   8. Coller les sections de vibratome à une membrane de polycarbonate, apposée sur un tamis à mailles (comme dans la section 3.1.1) etculture comme décrit dans la Section 3.1.2-3.1.6.
   9. Effectuer l'imagerie en temps réel en utilisant un microscope confocal à fluorescence à deux photons (laser d'excitation entre 690-1,040 nm) sur un support vertical avec une table réglable.
   10. Laser à deux photons réglé à 900 nm permet une pénétration profonde avec la meilleure résolution pour les signaux de GFP. Il réduit les dommages aux tissus en imagerie. En outre, le réglage de la puissance du laser pour l'émission le plus bas possible pour réduire les dommages des tissus. En général pour obtenir une bonne excitation de la GFP, en utilisant 12% de la puissance du laser à deux photons.

Résultats

Culture des explants entiers de l'intestin fœtal permet l'analyse de la localisation, la distribution, et la durée des molécules de signalisation qui coordonnent le développement intestinal, comme ce système permet la manipulation de la signalisation avec des réactifs pharmacologiques ou des protéines recombinantes. Le système de culture Transwell (Figure 1A, reproduit à partir de Walton et al., 2012) ² fournit une interface air-liquide, ce qui permet de placer la dr...

Discussion

La nature dynamique et les interactions de tissus complexes de l'intestin en développement exige une visualisation 3D d'avoir une appréciation complète de ces événements morphogénétiques. Avec l'évolution des technologies d'imagerie, la capacité d'examiner en détail la morphogenèse des villosités se développe / amélioration et, avec elle, la compréhension de la communication spatiale et interaction pendant l'organogenèse est grandement améliorée.

Des...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416