Cultures organotypique de tranche d'étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

Résumé

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Résumé

Les cellules exprimant NG2 (polydendrocytes, les cellules précurseurs d'oligodendrocytes) sont la quatrième grande population de cellules gliales dans le système nerveux central. Au cours du développement embryonnaire et postnatal elles prolifèrent activement et génèrent oligodendrocytes myélinisantes. Ces cellules ont souvent été étudiés dans des cultures primaires dissociées, co-cultures de neurones, et dans le tissu fixe. Utilisation de lignées de souris transgéniques nouvellement disponibles tranche systèmes de culture peuvent être utilisés pour étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans les deux régions de la matière grise et blanche du cerveau et le cervelet. Cultures tranches sont préparées à partir de souris postnatales et sont maintenues en culture pendant 1 mois. Ces rondelles peuvent être imagées à plusieurs reprises au cours de la période de culture cellulaire pour étudier le comportement et les interactions. Cette méthode permet la visualisation de la division cellulaire NG2 et les étapes menant à la différenciation des oligodendrocytes, tout en permettant une analyse détaillée de région dépendent cellules oligodendrocytes et NG2 hétérogénéité fonctionnelle. Ceci est une technique puissante qui peut être utilisé pour étudier les signaux intrinsèques et extrinsèques qui influent sur ​​ces cellules au cours du temps dans un environnement cellulaire qui ressemble étroitement à celle trouvée in vivo.

Introduction

Cultures tranche Organoytpic du système nerveux central se sont avérées extrêmement utiles pour l'étude de la biologie des neurones et des cellules gliales dans un système ^{semiintact: 1 - 4.} Ces cultures sont relativement simples à adopter et à conserver de nombreux avantages des cultures de cellules dissociées primaires telles que la manipulation de l'environnement extracellulaire et un accès facile pour l'imagerie des cellules vivantes à long terme répétées et des enregistrements électrophysiologiques ^{5 - 9.} En outre, des cultures de tranches de tissu cytoarchitecture maintenir en 3 dimensions, la connectivité neuronale régionale, et la plupart des types cellulaires majeurs sont présents dans le système. Ces propriétés font de ces cultures un système unique et pratique pour étudier le comportement de cellules individuelles et de la physiologie des interactions cellulaires et environnementaux.

NG2 cellules sont une population de cellules gliales dans le système nerveux central des mammifères, qui continuent à proliférer et à produire myelinating oligodendrocytes pendant le développement embryonnaire et postnatal ^10. Ils ont été largement étudiés dans des cultures primaires de cellules dissociées, et le développement récent des lignées de souris transgéniques avec expression spécifique des cellules NG2 des protéines fluorescentes a facilité la cartographie du destin in vivo et des enregistrements électrophysiologiques dans des préparations de tranches aiguës. Même avec ces études, on sait peu sur la dynamique temporelle de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes. Bien que la culture de cellules dissociées est largement utilisé pour l'installation par rapport à des manipulations pharmacologiques et génétiques, il n'est pas adapté pour interroger les différences fonctionnelles de ces cellules dans les différentes régions du cerveau en particulier quand il est souhaitable de maintenir le cadre de la micro-cellulaire. Cultures Slice offrent une alternative simple qui se prête à des manipulations pharmacologiques et ont été utilisées pour étudier la myélinisation des oligodendrocytes ^11,12, celluleréponse parti- après lysolécithine (LPC) ou anticorps induit une démyélinisation ^13,14, et l'induction de la remyélinisation par un traitement pharmacologique ^15.

Une méthode pour enquêter et effectuer l'imagerie en direct et les tissus fixés (ou postfixation) analyse de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes dans les cultures organotypique prises de fois le cerveau et le cervelet est décrit. Il s'agit d'une méthode puissante qui peut être utilisé pour étudier le sort cellulaire des cellules NG2 simples après la division ¹⁶ et de découvrir la région et la différence d'âge-dépendante du facteur de croissance induit la prolifération des cellules NG2 ^17. Cette technique relativement simple est largement accessible à approfondir cellule intrinsèque et / ou l'environnement mécanismes de régulation de la physiologie de ces cellules gliales et leur réponse à l'activité neuronale ou lésions de la myéline.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux suivent les directives et ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Connecticut.

NOTE: Pour ces expériences constitutifs NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) et inductibles NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) de souris transgéniques a traversé à Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP reporter ²⁰ (JAX # 006148) lignes respectivement ont été utilisés à l'image des cellules NG2 et de leur progéniture. Pour l'image oligodendrocytes matures, PLPDsRed souris transgéniques ²¹ ont été utilisés. Pour la survie compatibles, les tranches peuvent être isolés à partir de souris jusqu'à 10 jours après la naissance à la fois du cerveau et le cervelet.

1 tranche Préparation

1. Dans une hotte de culture, de placer des inserts de culture de tissu à six plaques à puits et ajouter 1 ml de milieu de culture de la tranche (recette dans la section des réactifs). Placer les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec 5% de CO ₂ d'au moins 2 heures avant la dissection.
2. Stériliser tous les outils et broyeur de tissus avec 70% d'éthanol.
3. tampon de bulle de dissection (recette dans la section des réactifs) avec 95% O _2, 5% de CO ₂ sur la glace pendant au moins 15 min avant le début de la dissection.
4. Anesthésier souriceaux en les plaçant sur de la glace pendant 5-10 min selon des protocoles approuvés animaux. Déterminer la profondeur de l'anesthésie appropriée en confirmant que les souris ne répondent pas à la queue et pieds pincement.
5. Décapiter les animaux à l'aide de ciseaux pointus, suivant des protocoles d'animaux. Enlever rapidement le crâne sur le cerveau et le cervelet en faisant d'abord une coupe sagittale suivie par incision latérale, en utilisant des outils stérilisés. Couper les nerfs crâniens de la surface ventrale du cerveau et du cervelet avec soin par laminage du tissu sur le côté.
6. Passer tissu stérile dans une boîte de 35 mm contenant du tampon oxygéné de dissection glacée.
7. En utilisant une lame de rasoir, couper le cervelet et le cerveau antérieur. Ensuite, faire une coupe mi-sagittal thropouah le cerveau et le cervelet, la séparation des hémisphères.
8. Coupez les 300 coupes coronales et sagittales um d'épaisseur du cerveau et du cervelet avec un hachoir manuel de tissu. REMARQUE: Un hachoir manuel de tissu permet un traitement rapide de dissection à la culture incubation sans la nécessité d'intégration agarose. Un vibratome peut également être utilisé comme décrit précédemment ^9.
9. Transfert tranches séparées dans le tampon de dissection froide fraîchement barboter sur la glace.
10. Utiliser une petite dissection ou pesant spatules pour séparer les sections individuelles et de les transférer à préincubée six plats et avec des inserts de culture.
11. Retirez tout tampon de dissection excès de la surface de l'insert de culture en utilisant une pipette de transfert jetable ou une pointe P 200 de la pipette. Deux à trois cerveau antérieur ou trois tranches de cervelet peut être placé sur un insert de culture.
    REMARQUE: Pour obtenir des résultats cohérents avec les cultures du cerveau antérieur, il est idéal pour les tranches couvrant la partie antérieure d'un tiers de corps calleux(Figure 1A) afin d'étudier les deux régions grises et blanches matière dans la même tranche. Chaque animal donne généralement de six tranches de cerveau antérieur et les six tranches de cervelet.
12. Placez les six plaques ainsi dans l'incubateur et remplacer le milieu de la tranche avec 1 ml de milieu de tranche 1 jour après la préparation de tranche, puis tous les deux jours jusqu'à ce que la tranche fixation.
13. Selon l'expérience, utiliser des tranches après 5-7 jours de culture. Utilisez uniquement des tranches qui deviennent transparent après les quelques premiers jours et jeter ceux qui ont des zones opaques inégales. REMARQUE: les régions opaques dans les tranches sont visibles à l'œil nu et apparaissent comme un amas de cellules sombres en contraste de phase. Après la technique a été maîtrisé, morts tranches opaques sont rares, en moins de 1-5% des tranches.

2. imagerie time-lapse de la division cellulaire et NG2 Oligodendrocyte différenciation

REMARQUE: Pour effectuer laps de temps imagerie de NG2 la prolifération et la différenciation cellulaire, nous utilisons NG2cre: souris ZEG ¹⁶qui expriment l'EGFP dans les cellules NG2 et de leur progéniture (figure 1C-E). expression de rapporteur dans cette ligne est suffisamment robuste pour obtenir des images en direct des cellules GFP + dans les tranches immédiatement après la coupe pour une période de temps d'au moins quatre semaines. Les images les plus nettes sont obtenues après la période initiale de l'amincissement de la tranche, qui se produit au cours des 3-5 premiers jours de culture.

1. Tout au long de l'expérience, garder les tranches dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C et ne retirez que pour de brèves périodes de temps (moins de 15 min par tranche), en gardant le couvercle sur la plaque de six puits tandis que d'imagerie.
2. En utilisant un microscope inversé à fluorescence équipé d'une caméra numérique, de capturer des images au premier point de temps à l'aide d'un objectif 10X. REMARQUE: premiers points de temps varient par l'expérience et peuvent être le jour où les coupes ont été préparés ou n'importe quel moment après le temps.
3. Capturez des images à partir de plusieurs régions à un point de temps dans les deux zones de la matière grise et blanche de la tranche. Remarque èmee région imagée par des sites spécifiques au sein de la tranche et de la cartographie de la position de l'image sur un schéma qui peut être utilisée pour des séances de formation d'image ultérieures. Points de repère utiles peuvent inclure des bords des tranches et / ou l'orientation de faisceaux de matière blanche. L'image de quatre à huit endroits sur chaque tranche à chaque point de temps.
4. Capturer les images subséquentes à un intervalle de 4-6 heures si l'examen de la division des cellules NG2 et la différenciation des oligodendrocytes, idéalement plus de 5-7 jours.
5. Capturer une image finale de toutes les régions et de fixer les tranches immédiatement. Ajouter 1 ml de fixateur (PFA 4% avec 0,1 M de L-lysine 0,01 M métaperiodate de sodium) à la partie inférieure de l'insert de culture, puis ajouter 1 ml d'autre sur le dessus des tranches. Prenez soin de ne pas injecter le fixateur directement sur la tranche, car il peut se détacher de la membrane. Fixer le tissu pendant 30 minutes et procéder à l'immunohistochimie en utilisant des marqueurs spécifiques au stade de développement tel que décrit dans la section 4.
6. Tranches lavage avec du phosphate de sodium 0,2 M tampon 3 x 10 m. Si nécessaires, des tranches de conserver à 4 ° C à 0,2 M tampon phosphate de sodium pendant 1-3 jours avant immunomarquage mais idéalement effectuer de coloration dans les 24 heures. Passez par immunohistochimie comme décrit ci-dessous dans la section 4 pour déterminer la proportion de cellules qui sont différenciées en oligodendrocytes (figure 2D-F).

3. destin cartographie de NG2 descendance de la cellule en utilisant des souris transgéniques inductible Reporter dans les cultures Slice

NOTE: Pour suivre le destin des cellules NG2 d'un point de temps particulière dans la culture, NG2creER inductibles: souris transgéniques YFP peuvent être utilisés.

1. Induire une recombinaison Cre et expression du reporteur par l'ajout de 100 nM 4OHT dissous dans de l'éthanol au milieu de culture. REMARQUE: cellules positives Reporter devraient apparaître dans les 1-2 jours à une efficacité d'induction de ~ 20-25% YFP cellules NG2 + + / NG2 + et à ce point de temps seront tous des cellules au stade de cellules NG2 (Figure 2A-C)
2. Fixer et laver la tranches, à différents points dans le temps après diverses manipulations (décrits dans les sections 2.5 et 2.6).

4 Slice immunohistochimie

1. Couper les membranes avec les tranches attachées sur les inserts à l'aide d'un scalpel.
2. Transfert tranches de puits individuels d'une solution saline 24 plaque contenant bien tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un ensemble de pinces à épiler, en prenant soin de ne pas perturber la composition de la tranche d'enlèvement de la membrane.
3. Transférer les tranches sur une plaque à 24 puits avec une solution de blocage contenant 5% de sérum normal de chèvre (NGS) et 0,1% de Triton-X100 dans du PBS pendant 1 heure.
4. Incuber les tranches d'anticorps primaire O / N à 5% NGS dans du PBS à 4 ° C. Pour identifier les cellules au stade de la cellule NG2, en utilisant des anticorps dirigés contre le récepteur PDGFRa et NG2. Pour identifier les oligodendrocytes différenciés, utiliser un anticorps à l'antigène polypose adénomateuse coli (APC; clone CC1).
5. Sur la deuxième tranches de lavage de jour en PBS 3 x15 min, puis incuber dans Antibo secondairemeurt dans 5% NGS dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Laver les tranches dans du PBS 3 x15 min et monter sur des lames. Montage de tranches vers le haut et face à la membrane diapositive de sorte que la membrane ne sera pas entre l'objectif et le tissu.

Résultats

Des exemples de données représentatives sont donnés ci-dessous qui ont été obtenus à partir de cultures de tranche de la fois le cerveau et le cervelet de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP et PLPDsRed lignées de souris transgéniques. Cellules NG2 peuvent être visualisés sur plusieurs jours dans du cerveau antérieur et le cervelet tranches (figure 1B-D, la vidéo 1) et le phénotype de ces cellules peut être déterminé qu'après la fixation et immunologique avec des anticorps NG2 et CC1

Discussion

La myélinisation dans le système nerveux central est essentiel pour une communication efficace neuronale et la survie des axones ^22. Cellules NG2 génèrent en permanence des oligodendrocytes myélinisantes à l'âge adulte, tout en maintenant une population résidente dans la plupart des régions du cerveau ^{16,23 - 25.} Certains mécanismes génétiques et moléculaires qui régulent la différenciation de ces cellules ont été décrits, mais beaucoup reste à découvrir. Cultures organotypi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope