Fond plat Plateforme Air-levée: Une nouvelle méthode pour combiner Comportement avec la microscopie ou électrophysiologie sur Awake Rongeurs déplacer librement

Résumé

Cette méthode crée un environnement familier tangible pour la souris pour naviguer et explorer pendant imagerie ou unicellulaires microscopiques enregistrements électrophysiologiques, qui exigent la fixation ferme de la tête de l'animal.

Résumé

Il est largement reconnu que l'utilisation d'anesthésiques généraux peut nuire à la pertinence des données électrophysiologiques ou microscopiques obtenues à partir du cerveau d'un animal vivant. En outre, la longue récupération de l'anesthésie limite la fréquence des épisodes répétés d'enregistrement / d'imagerie dans des études longitudinales. Par conséquent, de nouvelles méthodes qui permettraient enregistrements stables de souris Behaving non anesthésiés sont attendus pour faire avancer les domaines des neurosciences cellulaires et cognitives. Les solutions existantes vont de la simple contrainte physique à des approches plus sophistiquées, telles que les tapis roulants linéaires et sphériques utilisées en combinaison avec la réalité virtuelle générée par ordinateur. Ici, une nouvelle méthode est décrite où une souris de tête fixe peut se déplacer autour d'un homecage air mobile levé et explorer son environnement dans des conditions sans stress. Cette méthode permet aux chercheurs d'effectuer des tests de comportement (par exemple, l'apprentissage, l'accoutumance ou roman reconnaissance d'objet) en même temps quedeux photons imagerie microscopique et / ou des enregistrements de patch-clamp, toutes réunies en une seule expérience. Cette vidéo-article décrit l'utilisation de l'appareil de tête d'animal de fixation éveillé (de homecage mobile), démontre les procédures d'accoutumance des animaux, et illustre un certain nombre d'applications possibles de la méthode.

Introduction

Une tendance récente passionnante dans les neurosciences est de développer des approches expérimentales pour moléculaire et cellulaire de sondage des réseaux neuronaux dans le cerveau de dormir, de se comporter rongeurs. Ces approches prometteuses pour apporter un nouvel éclairage sur les processus neurophysiologiques qui sous-tendent la fonction motrice, l'intégration sensori-motrice, la perception, l'apprentissage, la mémoire, ainsi que la progression de la blessure, la neurodégénérescence et les maladies génétiques. En outre, l'enregistrement à partir du cerveau de l'animal éveillé prometteuse dans le développement de nouveaux agents thérapeutiques et les traitements.

Il ya une prise de conscience croissante que l'anesthésie, qui a été couramment utilisé dans les expériences neurophysiologiques, peut affecter les mécanismes de base du fonctionnement du cerveau, pouvant conduire à une interprétation erronée des résultats expérimentaux. Ainsi, la kétamine anesthésie largement utilisé augmente rapidement la formation de nouvelles épines dendritiques et améliore la fonction synaptique ^1; un autre anesthésique couramment utiliséic isoflurane à des niveaux d'anesthésie chirurgicale supprime complètement l'activité corticale spontanée chez les rats nouveau-nés et des blocs oscillations fuseau éclater chez les animaux adultes ^2. À l'heure actuelle, seul un nombre limité d'approches permettent des expériences chez la souris non anesthésiée à l'aide de deux photons imagerie microscopique ou enregistrements de patch-clamp. Ces approches peuvent être divisés en préparations se déplacer librement et tête fixe.

L'attrait unique de préparation des animaux se déplaçant librement, c'est qu'il permet une évaluation du comportement naturel, y compris les mouvements du corps entier pendant la navigation. Une façon de l'image à l'intérieur du cerveau d'un rongeur se déplacer librement est d'attacher un microscope ou fibroscope ^3-5 monté sur la tête miniaturisée. Cependant, les dispositifs miniaturisés ont tendance à avoir des performances optiques limitée en comparaison de microscopie à deux photons axé sur les objectifs, et ne peuvent être facilement combinés avec des enregistrements entiers cellule de patch-clamp ^6.

L'exisolutions de piqûre pour la tête de fixation d'un rongeur éveillé se sont appuyés principalement soit sur ​​la contention physique ou ^7,8 sur la formation de l'animal à présenter volontaire appuie-tête ^9. Une autre approche populaire est de permettre aux membres de l'animal de se déplacer en le plaçant sur, par exemple, un tapis roulant sphérique ^10; cette approche est souvent combiné avec la réalité virtuelle générée par ordinateur. Des expériences électrophysiologiques sur des souris de tête-fixe ont principalement utilisé des enregistrements extracellulaires et ont été utilisés pour étudier la régulation centrale de la fonction cardio-vasculaire ^11, les effets de l'anesthésie sur l'activité neuronale ^12, la réponse auditive du tronc cérébral ¹³ et traitement de l'information ^14. Les enregistrements entiers de cellules pionnières intracellulaires / des animaux de Behaving éveillés ont été réalisées dans les années 2000 et ont porté sur l'activité neuronale liée à la perception et le mouvement ^15-20. Vers la même époque, les premières études d'imagerie microscopique sur des souris ont été éveillés pubblis, où microscopie biphotonique a été utilisé dans le cortex sensoriel de rats retenus physiquement et ⁷ sur des souris en cours d'exécution sur un tapis roulant sphérique ^21.

Études in vivo de microscopie et d'électrophysiologie ultérieures ont démontré qu'une préparation tête de fixation peut être combiné avec succès avec paradigmes comportementaux basés sur les mouvements des membres antérieurs, reconnaissance d'odeurs, en fouettant, et lécher ^8,22-25. Souris placés sur le tapis roulant sphérique peuvent être formés pour naviguer dans l'environnement visuel virtuel généré par un ordinateur ^10,26. Des enregistrements intracellulaires / extracellulaires ont démontré que, chez un animal à tête fixe navigation tel environnement virtuel, l'activation des cellules de lieu de l'hippocampe peut être détectée ^27. Dans un environnement visuel virtuel, les souris démontrent rythme thêta relatif aux mouvements normaux du potentiel de champ local et en phase thêta précession pendant le mouvement actif ^27. Récemment, l'activit spatiale et temporelledes motifs y de populations neuronales ont été enregistrées optiquement dans des souris au cours du travail des tâches de décision de la mémoire dans un environnement virtuel ^28.

Malgré avoir permis recherche de pointe, la conception de tapis roulant sphérique a plusieurs limites inhérentes. Tout d'abord, l'animal est nécessaire pour déplacer sur une surface illimitée d'un ballon à air levé rotation, ce qui ne pose pas d'obstacles tangibles tels que des murs ou des barrières. Cette limitation est seulement en partie compensée par la «réalité virtuelle» généré par ordinateur, parce que l'entrée visuelle est sans doute moins efficace sur les souris et les rats par rapport à l'entrée sensorielle tactile (par exemple, favori-touch ou lécher), dont ces espèces dépendent naturellement sur. En second lieu, la courbure importante de la surface de la bille peut être inconfortable pour les souris de laboratoire utilisées pour la marche sur un plancher plat dans leurs cages. Enfin, le diamètre même de la balle (au moins 200 mm pour les souris et 300 mm pour les rats) rend la dimension verticale de la sphériqueDispositif de tapis roulant relativement importante. Il est donc difficile de combiner tapis roulant sphérique avec la majorité des configurations disponibles dans le commerce de microscopie, et nécessite souvent la construction d'une nouvelle installation dans le tapis roulant au moyen de cadres de microscope sur mesure.

Ici, une nouvelle méthode est décrite où une souris de tête fixe peut se déplacer autour d'un homecage air mobile levé qui dispose d'un plancher plat et les murs tangibles, et explorer l'environnement physique dans des conditions sans stress. Cet article explique les procédures de formation de la souris et de la tête de fixation, et fournit des exemples représentatifs où la microscopie à deux photons, imagerie optique intrinsèque et de patch-clamp enregistrements sont effectués dans le cerveau de souris Behaving éveillé.

Protocole

Toutes les procédures présentées ici ont été réalisées selon les recommandations locales pour les soins des animaux (La loi finlandaise sur l'expérimentation animale (62/2006)). La licence des animaux (ESAVI/2857/04.10.03/2012) a été obtenu de l'autorité locale (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Des souris adultes (âge 1-3 mois, le poids de 20-40 g) ont été gardés dans des cages de logement en groupe dans l'animalerie certifiée conforme de l'Université d'Helsinki et fournir de la nourriture et de l'eau ad libitum.

1. Crânienne Implantation de fenêtre

Fenêtre crânienne est implanté selon des protocoles publiés ^29-31 avec des modifications mineures, comme décrit brièvement ci-dessous:

1. Stériliser les instruments avant de commencer l'implantation fenêtre crânienne. Maintenir des conditions stériles au cours de la chirurgie pour réduire au minimum le risque de complications post-opératoires.
2. Administrer un analgésique (kétoprofène, de 2,5 mg / kg) 30 minutes avant la chirurgie et 24 heures après la chirurgie. Unesthetize la souris en utilisant un mélange de kétamine (80 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) injecté par voie intrapéritonéale. Surveiller régulièrement la profondeur de l'anesthésie par patte pincement. Utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température du corps de l'animal à 37,0 ° C. Pour réduire l'inflammation induite par chirurgie et l'oedème cérébral, d'administrer la dexaméthasone (2 mg / kg) par injection sous-cutanée.
3. Appliquer un lubrifiant oculaire afin de protéger les yeux de se sécher. Raser la tête de la souris et nettoyez la zone rasée. Coupez la peau avec des ciseaux et des pinces chirurgicales long de la ligne de la nuque au front. Retirez tout tissu conjonctif attaché au crâne.
4. Lentement et soigneusement percer un petit bien sur l'os frontal gauche à l'aide d'une perceuse chirurgicale à grande vitesse. Vissez un mini boulon (voir Matériaux) dans le puits foré. Effectuer au plus un an et demi tours complets de la vis.
   REMARQUE: Évitez les zones qui se trouvent directement au-dessus des navires corticales superficielles. La perturbation de ces vesSels peut conduire à une hémorragie massive.
5. Pour effectuer une craniotomie, percer une fenêtre circulaire (3-3,5 mm de diamètre) dans l'os pariétal droit. Appliquer une goutte de la mémoire tampon de cortex (mM NaCl 125 mM, KCl 5, 10 mM de glucose, 10 mM d'HEPES, 2 mM de CaCl _2, et 2 mM de MgSO _4, dans _H2O distillée additionné de pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml) et retirez la partie de l'os situé à l'intérieur de la fenêtre circulaire.
   REMARQUE: Pour exprimer une protéine fluorescente dans une sous-population spécifique de cellules, effectuer l'injection intracrânienne de viral adéno-associé (AAV) ou d'autres vecteurs viraux à ce stade de la procédure.
6. Placez une lamelle de verre ronde (# 1.5 Code de l'épaisseur) sur la fenêtre crânienne. Fixez la lamelle sur le crâne avec de la colle acrylique. Placez un support de métal sur le dessus de la lamelle et le fixer avec le mélange de ciment dentaire et de la colle acrylique.
   NOTE: La procédure décrite ci-dessus est optimisée pour les fenêtres crâniensutilisé dans des expériences d'imagerie optique. Pour préparer une "inversé" fenêtre crânienne approprié pour les expériences électrophysiologiques, utiliser une procédure différente. Tout d'abord, de la colle du support métallique au crâne. Percer une fenêtre circulaire à l'intérieur de l'ouverture de la porte comme illustré dans la vidéo. En variante, faire une craniotomie plus petite (moins de 0,5 mm de diamètre) au-dessus de la région d'intérêt afin d'éviter ou de minimiser le mouvement du cerveau ^32. Rafraîchir la mémoire tampon corticale ou déposer une goutte de colle silicone sur la fenêtre crânienne, puis fermez-le avec une lamelle de verre ronde.
7. Après avoir terminé l'opération, placer l'animal dans une cage réchauffé avec de la nourriture facilement accessible et l'eau. Retour à l'animal de la cage groupe boîtier uniquement après qu'il récupère pleinement de l'anesthésie. Re-administrer analgésique lors de la détection des signes de douleur, y compris réticence à se déplacer, manger ou boire, perte de poids, salivation, horripilation ou bruits respiratoires anormaux.

2. Animal Gestion

1. Prenez la souris de sa cage et simplement le maintenir pendant 5-10 min. Soyez calme lors de la manipulation de l'animal, éviter de faire des mouvements brusques et les bruits.
2. Après la manipulation, le retour de la souris dans sa cage.
3. Répétez la procédure de manipulation 2-3x avec des intervalles inégaux entre les épisodes de traitement, afin de rendre la souris à l'aise avec l'expérimentateur.
4. Prenez un petit chiffon doux et envelopper l'animal 2-3x avec des intervalles inégaux.
5. Animal doit rester calme et de s'habituer à être enveloppé. Si la souris est excité et nerveux, répétez les procédures de manutention et d'emballage.

3. Formation des animaux

1. Début de la formation de l'animal dans le homecage mobile, le lendemain de la habituation à la manutention et l'emballage est terminé.
2. Enregistrez l'animal de peser tous les jours, avant et pendant la formation.
   REMARQUE: Si, au cours de la formation, l'animal perd plus de 10% de son poids, il devrait être exclu de til expérimente.
3. Ajustez la position verticale du bras tête de fixation du dispositif de homecage mobile afin de correspondre à la taille de l'animal formé. Relier l'entrée d'air du dispositif à la prise de courant standard de laboratoire sous pression atmosphérique (typiquement, soit un réservoir de gaz ou une pompe à air qui fournit une pression suffisamment élevée et la vitesse de l'écoulement d'air, c'est à dire environ 5 bars et 300 l / min).
4. Enveloppez l'animal dans un chiffon.
5. Insérez le support de métal, qui est fixé à la tête de l'animal, dans le bras tête de fixation et fixer fermement en serrant les vis. Allumez le flux d'air et assurez-vous que le flux d'air est optimale pour le libre flottement de la homecage air levé. Relâchez l'animal dans le homecage mobiles en enlevant le chiffon.
6. Pour habituer l'animal aux bruits, fournir une exposition constante à des sons ambiants (en utilisant, par exemple, la radio ou de la musique enregistrée et de la parole) pendant toutes les sessions de formation ainsi que pendant les expériences.
7. Réu cours de la première session de formation, garder la lumière ambiante pour la première heure, puis éteignez la lumière jusqu'à la fin de la session de formation.
8. Après 2 heures de formation dans le homecage mobile, libérer l'animal de la tête de fixation et de retourner dans sa cage avec un approvisionnement en eau et de la nourriture. Laissez-le pendant au moins 2 heures dans des conditions de repos.
9. Nettoyez le homecage mobile après chaque session de formation à l'aide d'une solution d'éthanol à 70% et le rincer avec de l'eau du robinet. Imprégnez-vous de l'eau avec serviette en papier jetable et sécher le homecage mobile avant la prochaine utilisation.
10. Effectuer des séances de formation consécutifs pendant 2 heures, avec la lumière ambiante est désactivé alors que l'animal est en cours de formation.
11. Effectuer la session de formation deux fois par jour.
12. Après 8 à 12 sessions de formation, utiliser l'animal dans une session expérimentale jusqu'à 2 heures à la fois.

NOTE: Pendant les sessions de formation prolongées qui durent plus de 1-2 heures, envisager de fournir la souris with eau potable, qui peut être livré soit manuellement, soit au moyen d'un support de pipette attachée au cadre de homecage mobile. En variante, l'eau peut être fourni pour une utilisation à volonté de l'animal en le plaçant gouttes visqueuses de l'hydro-gel directement sur ​​les parois de la homecage mobile.

REMARQUE: N'oubliez pas de peser les animaux tous les jours avant la formation d'exclure les effets de stress chronique. Exclure un animal de l'expérience si, à aucun moment, il démontre des réactions de stress telles que le gel, la vocalisation, ou de la diarrhée induite par le stress.

4. Applications

1. Deux photons imagerie dans Réveillez-souris Se déplacer sur la Homecage mobile
   1. Assemblez le homecage mobile. Vérifier les positions du pont et le bras tête de fixation.
   2. Enveloppez l'animal formé dans un chiffon. Placer l'animal dans le homecage mobile. Fixer le support de métal dans la tête de fixation du bras. Retirer le papier.
   3. Nettoyez le couvercle en verre implanté de la poussière à l'aideune solution d'éthanol à 70% et laisser sécher.
   4. Placer une goutte du liquide d'immersion sur le type de couverture. De préférence, utiliser une solution visqueuse, parce que l'eau va s'évaporer rapidement.
   5. Placez le dispositif de homecage mobile avec l'animal formé sous le microscope (sauf si vous avez un second dispositif identique, qui est fixe dans la configuration de la microscopie).
   6. Effectuer imagerie utilisant un rendu ou un système à balayage laser microscope imagerie disponibles dans le commerce équipé d'un laser infrarouge pulsé femtoseconde.
   7. Trouver la région d'intérêt en utilisant le mode de fonctionnement du microscope à fluorescence à grand champ. Utilisez des filtres passe de longues afin d'évaluer vascularisation cérébrale et sélectionnez une zone cible appropriée après avoir examiné le modèle des vaisseaux sanguins.
   8. Pour l'image vasculaire cortical, injecter une solution à 1% du dextrane conjugué à du rouge Texas 70000 MW (ou son analogue), soit dans la veine de la queue tandis que l'animal est immobilisé dans le chiffon, ou rétro-orbitale tandis que l'l'animal est positionné dans la homecage mobile. Réglez le laser à deux photons à 860 nm et utiliser le filtre passe-bande (590-650 nm) pour collecter la lumière émise. Utilisez le filtre d'émission de 515 à 560 nm pour évaluer les petits détails de la morphologie neuronale ou l'activité neuronale en utilisant, par exemple, des souris transgéniques qui expriment YFP ou le Ca ^{2 +} - sensible GCaMP3 de protéine fluorescente dans une sous-population de neurones dans le cadre du promoteur Thy1.
   9. Utilisez un logiciel approprié pour l'acquisition de l'image.
   10. Après l'exposition, libérer l'animal du bras tête de fixation en dévissant les vis. Retour à l'animal de sa cage et laissez-le reposer pendant au moins 2 heures avant de commencer la prochaine session d'imagerie.
   11. Stocker les coordonnées de toutes les régions d'intérêt (ROI) pour réimagerie ultérieure. L'image de la même ROI cours du temps, et ajuster à chaque fois les coordonnées de maximiser le recouvrement de l'image.
   12. Analyser les images et faire des reconstructions tridimensionnelles en utilisant un softw appropriésont (par exemple, ImageJ, etc.)
2. L'imagerie optique intrinsèque dans Réveillez-souris Se déplacer sur la Homecage mobile
   1. Assembler le homecage mobile sous l'appareil d'une installation d'imagerie optique intrinsèque d'acquisition d'image.
   2. Enveloppez l'animal formé dans un chiffon. Placer l'animal dans le homecage mobile. Fixer le support métallique dans le bras tête de fixation.
   3. Nettoyez le couvercle en verre implanté de la poussière en utilisant une solution d'éthanol à 70% et laisser sécher.
   4. Déposer une goutte de glycérine sur le verre implanté et couvrir avec une lamelle ronde 8 mm.
   5. Placez un manipulateur avec le tube air-coup face à la vibrissa controlatéral.
   6. Ajustez la position de la caméra à haute vitesse et de se concentrer sur la vascularisation corticale.
   7. Utilisez feu vert (filtre 546BP30) sans filtre de la caméra pour acquérir la carte des navires.
   8. Concentrer plus profondément dans le cortex, environ 400 micromètres en dessous de la surface corticale.
   9. À l'image til oxygénation du sang (BOLD) signal optique en fonction du niveau, placez le filtre 590LP en face de la caméra et éclairer le cortex avec la lumière rouge (filtre 630BP30).
   10. Ajuster l'éclairement de la surface corticale de sorte qu'il est distribué uniformément à travers la région d'intérêt, en évitant la surexposition. Ajuster l'intensité de l'illumination de sorte que la région d'intérêt tombe dans le segment 70 à 90% de la plage dynamique de la caméra.
   11. Utilisez LongDaq logiciel d'acquisition d'image pour recueillir des images de l'appareil photo.
   12. Utiliser l'image fréquence d'acquisition de 1 à 10 Hz (par exemple, entre 1 et 10 trames par seconde) pour les expériences avec la stimulation à basse fréquence (0,05 Hz).
   13. Eteindre la lumière ambiante pour éviter toute interférence avec le signal optique intrinsèque.
   14. Attendre au moins 30 minutes pour la souris pour s'adapter à la homecage mobile.
   15. L'image, l'activité de base lors d'un épisode de 6 minutes sans stimulation.
   16. Pour enregistrer c évoquéactivité ortical, stimuler vibrisses dans un mode 10 sec ON/10 sec OFF (0,05 stimulation Hz) avec une haute fréquence (25 Hz) de train de bouffées d'air pour la durée totale de 6 min.
   17. Après l'acquisition de l'image, relâchez la souris du bras tête de fixation et de le retourner dans sa cage.
   18. Ne pas utiliser le filtrage de données supplémentaires pour la fréquence, car les amplitudes des réponses de stimulation ont tendance à être relativement élevée chez les animaux éveillés, résultant en un excellent rapport signal sur bruit.
   19. Convertir les ensembles obtenus d'images à * les fichiers de la pile. TIF et analyser plus en détails à l'aide, par exemple, l'open source du logiciel FIDJI (ImageJ). Soustraire l'activité spontanée de base des cadres obtenus lors de vibrisses stimulation aide de l'outil Calculatrice de l'image. En variante, les données de filtrage dans le domaine fréquentiel en utilisant un logiciel approprié.
3. Les enregistrements de patch-clamp dans Awake souris Se déplacer sur la Homecage mobile
   1. Assemblez le homecage mobile.
   2. Enveloppez l'animal formé dans un chiffon. Administrer triméthoprime (5 mg / kg) et la sulfadoxine (25 mg / kg) pour prévenir l'infection bactérienne. Placer l'animal dans le homecage mobile. Fixer le support métallique dans le bras tête de fixation.
   3. Nettoyez et stérilisez le ciment "bouchon" dentaire implanté et couvercle en verre en utilisant une solution d'éthanol à 70% ou 0,5% de digluconate de chlorhexidine et laisser sécher.
   4. Lentement et retirez le couvercle en verre de la porte métallique.
   5. Rafraîchir la mémoire tampon corticale additionné de pénicilline, la streptomycine et nettoyer la fenêtre crânienne de débris avec un tampon hémostatique stérile.
   6. Placer l'électrode de masse dans la mémoire tampon cortical.
   7. Placez le headstage d'électrophysiologie dans un micromanipulateur.
   8. Fabriquer des pipettes de verre borosilicate, visant à la résistance de pointe allant de 6,5 à 8.5MΩ. Remplir la pipette de patch avec une solution intracellulaire. La composition de la solution de correction est la pipettesuivante (en mM): 8 KCl, K-gluconate 111, CaCl ₂ 0,5, 2, NaOH, 10 glucose, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, 5 et BAPTA, le pH a été ajusté à 7,2 avec du KOH. Les valeurs de potentiel de la membrane doivent être corrigés pour un potentiel de jonction liquide calculée de -12 mV ^33.
   9. Cibler la zone d'intérêt en utilisant les coordonnées stéréotaxiques, et passer rapidement de l'électrode dans le cerveau, tout en maintenant une forte pression positive sur la pointe de la pipette. Après la pénétration de la dure-mère et le positionnement de la pipette, de mesurer la résistance de pointe et rejeter les électrodes qui montrent une augmentation de la résistance de plus de 10 à 15%, afin d'améliorer le taux de réussite des étapes ultérieures.
   10. Réduire la pression positive de moitié pour éviter le gonflement du tissu cérébral environnant. D'autres étapes sont similaires au protocole standard de «patch aveugle". Pour trouver un neurone à enregistrer à partir d', abaisser la pointe dans le cerveau de manière progressive jusqu'à un neurone est détectée dans une proximit proximitéy de la pointe de la pipette, comme indiqué par une séquence temporelle caractéristique de changements d'impédance d'électrode. L'indicateur de touche de la présence d'un neurone est une augmentation monotone de la résistance d'électrode à travers plusieurs étapes consécutives avant de la pipette (en général, une augmentation de 20% à la résistance à la pipette dans trois étapes à 2 um).
   11. Pour former un contact de gigaseal au neurone cible, appliquer une pression négative et une hyperpolarisation de la pipette.
   12. Appliquer une impulsion brève d'une pression négative plus importante à la cellule en vue d'établir la configuration de cellule entière. Retrait de l'électrode de 2-3 um de garder une bonne étanchéité.
   13. Fiche activité spontanée ou évoquée au cours d'une période de temps désirée, jusqu'à 20-40 min.
   14. Après l'enregistrement, retirer la pipette du cerveau.
   15. Rafraîchir la mémoire tampon corticale ou déposer une goutte de colle silicone sur la fenêtre crânienne, puis coller une lamelle de verre rond sur le dessus de la porte métallique.
   16. Relâchez la animal du bras tête de fixation en dévissant les vis. Retourner l'animal dans sa cage pendant au moins un jour avant l'enregistrement suivant.
   17. Analyser les données avec, par exemple, le logiciel de FitMaster.
4. Habituation-déshabituation olfactive test dans Réveillez-souris Se déplacer sur la Homecage mobile
   1. Fixer un morceau de coton propre (2 x 2 cm) trempé dans l'eau du robinet à la face intérieure de la paroi de la homecage mobile en utilisant un ruban adhésif double-face. Diviser la paroi homecage mobiles en quatre zones en plaçant des repères de couleur sur le côté extérieur de la paroi de sorte que le morceau de coton se situe dans le milieu de la "zone cible". Fixer l'animal dans le bras de headholder face du segment de mur opposé à la zone «cible» et lui permettre de s'adapter à la homecage mobile pour 30 min.
   2. Prenez un autre morceau de coton propre et humide avec quelques gouttes de l'extrait de vanille 1%. Remplacer le coton propre sur la paroi homecage mobile avec l'un portant le Vanilla odeur. Présenter l'odeur pendant 5 min. Suivre les mouvements de la homecage mobile pendant la période de présentation de l'odorat. Estimer le niveau d'intérêt à l'odeur, en mesurant le temps cumulé que l'animal passe en regard de la zone "cible" par rapport à la durée totale du mouvement de homecage mobile.
   3. Répétez la session d'application 5 min à trois reprises avec l'odeur de la vanille, avec un intervalle de 5 min inter-session. Utilisez un nouveau morceau de "vanille" coton dans chaque session.
   4. Présenter l'animal avec une odeur socialement importante au cours de la dernière, cinquième session. Humidifiez un morceau propre de coton avec quelques gouttes d'urine (obtenus la veille d'un animal de sexe opposé) et placez-le au milieu de la zone cible pendant 5 min.
5. La reconnaissance de l'odeur roman en déplacement de souris éveillé autour de la homecage mobiles
   1. Diviser la paroi en quatre zones en plaçant des repères de couleur sur le côté extérieur de la paroi de homecage mobile. Attach deux morceaux de coton propres (2 x 2 cm) plongées dans l'eau du robinet à la face intérieure de la paroi au milieu des zones opposées l'une à l'autre (désignée comme zone cible et une zone cible 2). Fixer l'animal dans le bras de headholder faisant face à un segment de paroi à l'extérieur des zones cibles et lui permettre de s'adapter à la homecage mobile pour 30 min.
   2. Remplacez les deux morceaux de coton avec les neuves:. Placez un morceau humide avec l'extrait de vanille 1% de coton de la zone 1 cibler et une autre humide avec de l'eau du robinet pour la zone 2 cibler enregistrer la vidéo des mouvements de homecage mobiles pour 10 min au cours de l'odeur session de présentation. Calculer l'odeur assister en tant que pourcentage du temps que l'animal passe face à la zone cible 1 par rapport à la durée cumulative de face les zones 1 et 2.
   3. Après un intervalle de 10 min, placer une autre paire d'applicateurs sur la paroi postérieure homecage pour la période de 10 min. Placez la "vanille" coton dans la zone cible 1 et un coton humide avec 1% banane extract dans la zone cible 2. Faites un enregistrement vidéo des mouvements de homecage mobiles. Calculer la préférence à nouveau odeur comme le pourcentage de temps que l'animal passe en regard du segment de paroi avec la nouvelle odeur (zone cible 2) par rapport au temps cumulé face les zones 1 et 2.

Résultats

La méthode présentée ici est destiné à l'imagerie microscopique ou unicellulaires enregistrements électrophysiologiques chez des souris éveillées, tête fixe mais sinon librement mobiles et se comportent. L'animal peut se déplacer dans deux dimensions en un réel (par opposition au virtuel), l'environnement matériel et familier, tandis que le crâne de l'animal est solidement fixé au bras tête de fixation. Habituant la souris à la homecage air mobile levé compose de 4-6 jours de séances biquotidiennes formation de 2 h (Figure 1). Les animaux formés peuvent ensuite être utilisés immédiatement dans les expériences. Une étude typique comprend un certain nombre de séances d'imagerie ou de sessions d'enregistrement patch-clamp qui sont espacées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. Surtout, les deux enregistrements optiques et électrophysiologiques peuvent être effectuées simultanément avec des stimuli et des indicateurs comportementaux ou cognitifs, dans une expérience unique.

Pour évaluer la stabilité mécanique detête de fixation de la souris dans la homecage mobile, les séquences d'images de navires corticales marqués avec dextran fluorescent conjugué et de dendrites corticaux exprimant YFP ont été recueillies alors que les animaux de laboratoire naviguaient le homecage mobile (figure 2). Les déplacements maximaux du cerveau au cours de la locomotion de l'animal ne dépassent pas généralement 1-1,5 micromètres. Ces déplacements se sont produites dans les directions horizontale et très rarement donné lieu à un changement détectable du plan d'imagerie, ce qui rend inutile toute correction d'artefacts de mouvement. Fixation stable de la tête dans homecage mobile permet la quantification des épines dendritiques individuelles chez les animaux éveillés avec la même fiabilité que dans des souris anesthésiées. Densité des épines dendritiques, la morphologie et le chiffre d'affaires peuvent être surveillés au cours des études longitudinales avec des séances d'imagerie multiples effectuées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines.

La facilité d'utilisation de la mobile homecage pour l'imagerie optique fonctionnelle a été testé dans le cortex somatosensoriel des souris éveillées en utilisant deux approches: i) la microscopie à deux photons sur les souris transgéniques Thy1-GCaMP3 et ii) intrinsèque imagerie de signal optique chez les souris de type sauvage. Ca ^{2 +} imagerie a été effectuée dans la couche 2/3, qui contient des corps cellulaires des neurones marqués par fluorescence nombreux, ainsi que leurs dendrites et des axones (figure 3). Les parcelles de fluorescence sur la durée de certaines régions d'intérêt (ROI) sont présentés dans la figure 3, montrant l'activité neuronale spontanée (mesurée par des augmentations transitoires de fluorescence de GCaMP3) pendant la navigation active de la souris dans la homecage mobile. L'imagerie optique basé sur des signaux intrinsèques permet de cartographier la distribution spatiale des domaines fonctionnels. Figure 4 illustre les changements de forme ondulée dans le niveau d'oxygénation du sang (reflétant l'activation neuronale régionale) qui propagent le long de cortex somatosensoriel en réponse à vibrissa stimulation à la fréquence de 0,05 Hz.

Pour tester la faisabilité de patch-clamp enregistrements avec homecage mobile, nous avons utilisé des souris C57BL/6J 2-3 mois vieux. Couche 2/3 de neurones dans le cortex somatosensoriel ont été enregistrés à partir de la configuration de cellules entières en utilisant le mode de blocage de courant. Enregistrement patch-clamp dans le cerveau de souris éveillé tête fixée sur homecage mobile était essentiellement similaire à aveugler patch-clamp dans des tranches de cerveau. Environ 50% des tentatives pour résultat la formation de gigaseal réussi, dont plus de 70% a produit stable enregistrement de configuration à cellules entières. Aucun événement de perdre le contact gigaseal par déplacement mécanique de cellules ont été observées. Figure 5 illustre un fragment de 60 secondes d'un représentant de 10 minutes de temps d'enregistrement actuel pince corrélée avec des épisodes de actif (marche) de la souris et (au repos) Etats passifs.

Figure 1. La méthode de fixation tête de souris éveillé dans la homecage mobile. A) Vue d'ensemble de la conception de homecage air mobile levé et illustrations du concept général. B) Schéma d'un calendrier expérimental typique. L'étude commence à l'implantation de la fenêtre crânienne deux semaines avant habituer la souris pour la manutention et de l'emballage, qui est suivi par huit formations deux fois par jour. L'étude typique comprend un certain nombre de séances d'imagerie ou de sessions d'enregistrement patch-clamp qui sont espacées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. Les deux mesures optiques et électrophysiologiques peuvent être faites en parallèle avec des stimuli et des indicateurs cognitifs ou comportementaux au sein d'une seule expérience. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Exemple de deux photons imagerie microscopique sur des souris éveillées en mouvement autour de la homecage mobile. A, B) du système vasculaire corticale, marqué avec le dextrane conjugué à du rouge Texas 70 kDa. Le diamètre des segments individuels de bateau est mesurée en traçant au fil du temps le profil des lignes à travers la lumière du vaisseau pendant les périodes de repos et de fonctionnement (A) de la souris. La vitesse d'écoulement du sang dans les artères et les veines est mesurée par la ligne de balayage le long des lignes tracées parallèlement à la paroi de la cuve (B). C, D) détails fins de la morphologie neuronale visualisée dans le cerveau de souris transgéniques qui expriment la YFP en sous-population de neurones dans le cadre du promoteur Thy1. Reconstruction tridimensionnelle des neurones pyramidaux du cortex somatosensoriel de la souris (C). Les images d'un b dendritiqueranch acquis, une souris se comporter éveillé sont suffisamment stables pour la quantification de personne épines dendritiques morphologie (D). E) Quantification du mouvement au cerveau causés par les mouvements de la souris. Des déplacements plus importants d'amplitude en corrélation avec les périodes de fonctionnement de la souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Exemple d'activité de la population neuronale dans éveillé Thy1-GCaMP3 souris se déplacer autour de la homecage mobile. A) l'image à deux photons de la couche corticale II / III neurones. ROI, par exemple les corps cellulaires neuronaux, dendrites et des axones sont indiqués en jaune. B) AF / F traces de la fluorescence de GCaMP3 de ROI indiquées dans A (temps depêches enregistré à 1.5 sec / image). C) zoomée en région imagée à 65 ms / cadre. D) Fluorescence de ROI jaunes dans C tracée au fil du temps, montre les augmentations transitoires (rouge) de la fluorescence de GCaMP3 qui correspondent à l'action Ca ^{2 +} épisodes potentiels induits par d'afflux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. L'exemple de cartographie de la répartition spatiale des réponses fonctionnelles dans le cortex d'une souris éveillés au moyen d'une image des signaux optiques intrinsèques. A) de Bright champ des vaisseaux sanguins superficiels par la fenêtre crânienne. B) carte Magnitude de l'activité de base dans ho mobilesmecage lors d'un épisode de 6 minutes. C) carte Magnitude de l'activité neuronale se propageant le long cortex somatosensoriel en réponse à la stimulation de vibrisses à une fréquence de 0,05 Hz. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Exemple de cellule entière d'enregistrement patch-clamp dans le cortex de souris éveillé un déplacement autour de la homecage mobile. A) l'enregistrement actuel-clamp d'un neurone dans la couche corticale de la souris 2/3. A 0,5 sec, injection de courant de 100 pA (indiqué ci-dessous la trace) se traduit par une salve de potentiels d'action. La cellule a montré la fréquence de pic adaptation caractéristique de neurones pyramidaux. B) continue l'enregistrement courant pincede la même neurone en corrélation avec l'activité souris »locomoteur (en rose ci-dessus la trace). Activité spontanée représentant de la couche 2/3 neurones pendant les périodes de la souris de repos (C) et le fonctionnement (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Perte de poids des animaux et de l'activité locomotrice des souris head-fixed/non-fixed au cours des sessions de formation dans le homecage mobile. A) poids de l'animal (moyenne + SD,%) avant les sessions de formation. Notez que la perte de poids est intégralement reprise par la session de formation 7-8 ^ème. B) de la trajectoire horizontale de locomotion rapport de la souris pour le homecage mobile,qui a été extrapolée à partir de la circulation suivi de la homecage mobile pendant 8 ^ème session de formation. C) des mouvements chenilles d'une souris non-tête fixe explorer la cage ronde pendant 8 ^ème session de formation. D) Durée de la tête fixe (cercle) et non-fixe (triangle) mouvement de la souris pendant 1-4 ^ème journée de formation (moyenne + SD,%). Notez que, le jour 4, les souris de tête-Correction de l'affichage ni gel (comme le jour 1), ni l'activité locomotrice excessive. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Pour mieux comprendre la physiologie du cerveau et de la pathologie, la recherche doit être effectuée sur une variété de niveaux de complexité de préparation, en utilisant les techniques les plus appropriées pour chaque préparation. À l'heure actuelle, un large éventail de méthodes de neurosciences (de tout le corps à la microscopie STED IRMf sous-organite) sont facilement appliqué aux animaux anesthésiés, tandis que des expériences sur des animaux éveillés et se comportent ont représenté un défi méthodologique important.

Ici, une nouvelle approche est décrite où un animal de laboratoire, en dépit d'être fermement la tête fixe, peut se déplacer autour d'un homecage air mobile levé et explorer son environnement tangible dans des conditions sans stress. La préparation des animaux tête fixe comporter présentée ici fournit un certain nombre d'avantages cruciaux. Premièrement, les données électrophysiologiques ou d'imagerie obtenus avec cette méthode sont sans compromis ni par l'anesthésie, ni par le stress induit par contrainte. Positionnement de la souris dans la maison mobilecage est rapide et ne nécessite pas d'anesthésier l'animal, même de manière transitoire. Deuxièmement, la homecage air levé assure la stabilité mécanique qui est nécessaire pour quantifier les changements dans la morphologie des neurones amende et d'enregistrer une seule cellule activité électrophysiologique chez les animaux éveillés. Enfin, la conception de la homecage mobile est plus compact par rapport au tapis roulant sphérique, permettant ainsi le positionnement de la homecage portable sous un microscope droit norme pour l'imagerie à deux photons ou d'enregistrement patch-clamp dans le cerveau de souris éveillé.

Cabinet fixation de la tête dans le homecage mobile requiert l'implantation d'un support métallique à quatre ailes spécialement conçu, avec une ouverture ronde dans le centre d'accès optique ou électrique à la région du cerveau sous-jacent. Ces supports métalliques sont fixés sur le crâne à l'aide d'une combinaison de la colle, un ciment dentaire et un petit boulon vissé dans l'os du crâne. Cette intervention chirurgicale a été développé sur la base d'un grand nombre de précédemmentprocédures publiées, et on a trouvé au résultat de la préparation dans une fenêtre crânienne stable et reproductible. Pour vivo expériences électrophysiologiques, une fenêtre en forme de lune ^34, une petite craniotomie de taille (moins de 0,5 mm) ^32, et une préparation vitré foré ³⁵ ont été utilisées. Ici, le "inversé" fenêtre crânienne a été implanté avec soit un grand (diamètre 3,5 mm) ou petites (diamètre inférieur à 0,5 mm) craniotomie. Minimisant ainsi les mouvements du cerveau est essentiel pour les enregistrements de cellules individuelles stables, c'est pourquoi il est conseillé d'effectuer de petits craniotomies de taille pour les expériences électrophysiologiques. Lors de l'implantation de la fenêtre crânienne pour des expériences d'imagerie optique, les animaux sont laissés récupérer pendant au moins 2 ou 3 semaines, période durant laquelle la première fenêtre de manière transitoire perd sa transparence et ensuite elle regagne (avec un rendement de 50-70%, en fonction de l'arrière-plan génétique de la souche de souris). Transparence de la fenêtre crânienne et la stabilitétion du ciment "bouchon" dentaire attaché au crâne peut être vérifiée au moyen d'un microscope binoculaire et l'inspection régulières physique lors de la manipulation des animaux. A la fin de la période de récupération de 2-3 semaines, les animaux qui présentent des signes d'inflammation post-opératoire résiduelle ou des défauts mécaniques dans le ciment dentaire devraient être exclus des expériences et fin.

L'âge optimal pour commencer la formation de la souris est de 2-4 mois (correspondant au poids corporel de 20-40 g). Chez les jeunes animaux, l'ancrage du ciment "bouchon" dentaire au crâne peut ne pas être fiable, ce qui peut diminuer sa capacité de résistance au stress mécanique imposé par la locomotion de la souris sur la tête fixe dans le homecage mobile. Bien que les souris mâles et femelles apparaissent tout aussi prêt à naviguer dans homecage mobile, il ya une tendance à une meilleure pourcentage de fenêtres crâniens retrouver leur transparence chez les souris femelles (données non présentées). Ainsi, dans l'ordre to assurer un équilibre entre les sexes dans la cohorte d'animaux sélectionnés pour l'imagerie, de l'implantation des fenêtres crâniens dans environ 30% des souris plus mâle est recommandé. Les interactions sociales sont connues pour améliorer le bien-être des animaux et de réduire le stress, il est donc souhaitable que la même portée sont exploités et formés en parallèle et maintenus ensemble dans des cages de logement en groupe.

A la différence des modes opératoires publiés pour la préparation de tapis roulant sphérique ^13, le procédé utilisant le homecage mobile ne nécessite pas d'anesthésier la souris au moment de la fixation de la tête. Cette différence est importante car elle permet d'éliminer les effets résiduels que même un bref épisode d'anesthésie et "lumière" est susceptible d'avoir sur les mesures physiologiques obtenus peu de temps après. En effet, même si dans les études où la tête de fixation a été fait sous anesthésie et les expériences réelles ont commencé après une période d'attente brève ^13, on ne peut pasexclure les éventuels effets à long terme de la brève épisode de l'anesthésie sur les données expérimentales. D'autres études se sont appuyés sur la privation d'eau pour l'accoutumance systématique des animaux à la tête de fixation et utilisé récompense de l'eau comme moyen de motiver l'animal à rester immobile ^36. Cependant, la méthode tête fixation récompense basée limite le choix des tests de comportement applicables et, surtout, occupe l'une des associations stimulus-récompense bien établies. En revanche, la méthode de la souris de l'accoutumance à la tête de fixation dans homecage mobile ne nécessite pas une privation d'eau et de rendement subséquent.

Complétant la homecage mobile avec un système de distribution d'eau est recommandée pour des expériences de longue durée. Les séances de dressage d'animaux et les expériences présentées ici ont été effectuées pendant la journée (8 heures-18 heures), ce qui correspond à la période physiologiquement passive pour les souris qui sont conservés selon le calendrier de la lumière de 12 heures standard (liSMTG sur à 6 heures et descendre à 18 heures). Depuis la prise d'eau est directement liée à l'activité de la souris, les souris pendant la période passives ne nécessitent pas de distribution de l'eau si la durée d'une session de formation / imagerie / d'enregistrement ne dépasse pas 2 heures. En plus de la date et la durée des sessions de formation, il faut aborder la question du nombre optimal de séances nécessaires pour habituer les animaux à homecage mobile. A cette fin, deux critères ont été utilisés pour évaluer le stress induit par des modes opératoires de la tête de fixation: i) la perte de poids, et ii) le niveau de l'activité locomotrice. Comme le montre la figure 6, la perte de poids atteint le niveau moyen de 6% sur deux jours de formation, et est complètement inversé par la formation de 4 jours (Figure 6A). En cohérence avec la dynamique de pesage, le niveau des animaux à tête fixe activité locomotrice est supprimée dans le premier jour de la formation, mais se stabilise par la formation le jour 4 (figure 6D). Sur la base de ces mesures, nous suggestionst que la durée minimale de la période de formation de la souris sur homecage mobile est de 4 jours, comme décrit dans le protocole par les présentes.

L'utilisation de l', homecage portable fond plat air-levée permet d'ajouter des tâches complexes (sensori-motrices, perceptives, cognitives et) les paradigmes de formation pour les souris à tête fixe. Dans la présente étude, deux protocoles de tests comportementaux sont présentés. Les deux protocoles utilisent odeur indices et peuvent être combinés avec longitudinales imagerie / enregistrements dans le cortex de la souris. Bien que le homecage mobile est fabriqué à partir de matériaux non absorbants, il faut encore tenir compte des interférences possibles entre l'odeur de l'appareil et l'odeur (s) d'essai. Un autre facteur qui peut interférer avec des repères visuels / tactiles d'une expérience comportementale est la jonction entre le mur et l'insert, ce qui n'est pas sans faille et peuvent, par conséquent, être perçu par l'animal comme un point de repère. Il convient de noter ici que, afin de minimiser la détresse de l'animal au cours de cette intégrationrventions que le placement d'un coton odeur présentant à la paroi homecage mobile, l'expérimentateur doit pratiquer pour effectuer ces interventions le plus rapidement possible et éviter toute manipulation prolongée de la cage de carbone. Stratégies alternatives pour roman présentation odeur / objet sont envisageables, par exemple, en plaçant solution hydrogel gouttes ou des objets (tels que les puces alimentaires) sur de petites étagères fixées à la surface interne de la paroi de la cage de carbone à la hauteur compatible avec la tête de positionnement de l'animal.

Homecage mobile permet aux animaux de la tête fixe pour effectuer un large éventail de mouvements à deux dimensions, y compris la locomotion horizontale, situp, toilettage, en fouettant, lécher, nez-piquer, les mouvements de la patte avant qualifiés, et le mur de toucher avec les pattes avant, comme illustré dans la présente étude . Utilisation homecage mobile et les protocoles présentés ici, les chercheurs peuvent étudier le système neuronal sensori-moteur avec un niveau élevé de contrôle sur à la fois la condition de stimulations et au dépouillement de comportement. En outre, des études de capacités cognitives chez des souris éveillées peuvent être effectuées pendant le conditionnement, la navigation spatiale et les tâches de prise de décision.

Il existe plusieurs limitations pratiques de ce procédé. Tout d'abord, une quantité importante d'air sous pression est nécessaire pour obtenir la puissance de homecage-levage et de réaliser des expériences de longue durée. En second lieu, la homecage mobile dans sa mise en oeuvre est présente seulement 18 cm de diamètre, et par conséquent fournit un relativement petit et simple par rapport à l'espace de réalité virtuelle, où un environnement expérimental complexe peut être conçu sans aucune restriction spatiales. Troisièmement, lors de la stimulation des moustaches et des expériences à base de récompense-présentés ici, un dispositif a été utilisé qui limite la possibilité de la paroi contact pour la souris. L'addition d'un canal de stimulation sensorielle visuelle ou externe (comme un projecteur de lumière dirigée œil), il faudrait concevoir un dispositif plus compact et ergonomique, par rapport àles solutions à écran multiple ou d'un dôme de projection qui ont été utilisés dans les expériences de tapis roulant sphériques.

En résumé, l'utilisation de la souris à la tête fixe se déplaçant dans la homecage air mobile levée facilite grandement les études qui combinent les niveaux cellulaires, moléculaires et comportementaux d'observation et de manipulation dans une expérience unique. Applications spécifiques illustrés ici comprennent deux photons imagerie microscopique, intrinsèque imagerie de signal optique et les enregistrements de patch-clamp chez les souris Behaving non anesthésiés. Il est prévu que cette approche va ouvrir de nouveaux horizons dans l'expérimentation sur éveillé, la souris se comporter et de servir comme un outil utile à la fois pour le développement de médicaments et la recherche fondamentale de la fonction cérébrale.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tweezers, Stainless Steel, 115 mm	XYtronic	XY-2A-SA
Animal trimmer, shaving machine	Aesculap	Isis GT420
Binocular Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad	Supertech	TMP-5b
Blunt microsurgical blade	BD	REF 374769
Borosilicate tube with filament	Sutter Instruments	BF120-69-10	For patch pipette production
Camera	Foscam	FI8903W	Night visibility
Carprofen	Pfizer	Rimadyl vet
Dental cement	DrguDent, Dentsply	REF 640 200 271
Dexamethasone	FaunaPharma	Rapidexon vet
Disposable drills	Meisinger	HP 310104001001008
Dulbeco’s PBS 10x	Sigma	D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm	FST	91150-20
Eyes-lubricant	Novartis	Viscotears	For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion
Foredom drill control	Foredom	FM3545
Foredom micro motor handpiece	Foredom	MH-145
Four-winged metal holder	Neurotar
Head Holder for Mice	Narishige	SG-4N	Assembled on stereotaxic instrument
Hemostasis Collagen Sponge	Avitene, Ultrafoam BARD	Ref 1050050
Imaris	Bitplane
Ketamine	Intervet	Ketaminol vet
Kwik-Sil	WPI
Mai Tai DeepSee laser	Spectra-Physics
Micro dressing forceps, 105 mm	Aesculap	BD302R
Microelectrode puller	Narishige	PC-10H	Vertical puller for glass pipette production
Micromanipulator	Sensapex
Mini bolt	Centrostyle	Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5
Mobile Homecage	Neurotar
Multiphoton Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1000MPE
Nonwoven swabs, 5 x 5	Molnlycke Health Care	Mesoft	Surgical tampons
Polyacrylic glue	Henkel	Loctite 401
Round glass coverslip	Electron Microscopy Sciences		1.5 thickness
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900
Student iris scissors, straight 11.5 cm	FST	91460-11
Xylazine	Bayer Health Care	Rompun vet