Une méthode pour micro-injection de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zygotes

Résumé

Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L'étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d'embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce.

Résumé

Échinodermes ont longtemps été un système de modèle de prédilection pour les études de reproduction et le développement, et plus récemment pour l'étude de la régulation des gènes et de l'évolution des processus de développement. L'étoile de mer, Patiria miniata, gagne prévalence comme un système modèle pour ces types d'études qui ont déjà été effectuées presque exclusivement dans les oursins, Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus. Un avantage de ces systèmes de modèles est la facilité de produire des embryons modifiés dans laquelle un gène donné est vers le haut ou régulée à la baisse, le marquage d'un groupe de cellules, ou l'introduction d'un gène rapporteur. Procédé de micro-injection unique est capable de créer une grande variété de ces embryons modifiés. Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des gamètes à partir de P. miniata, la production de zygotes, et l'introduction de réactifs perturbateurs par micro-injection. Embryons sains morphant sont ensuite isolés pour des études quantitatives et qualitatives de gefonction ne. La disponibilité de données sur le génome et du transcriptome pour cet organisme a augmenté les types d'études qui sont effectuées et la facilité de leur exécution.

Introduction

L'étoile de mer, Patiria miniata, (communément appelé l'étoile de chauve-souris) est en train de devenir un système de modèle intéressant et polyvalent pour une variété de cellules ^{1 à 3,} de développement ^{de 4,5,} l'évolution ^{de 6 à 8,} et des études écologiques ^{9- 11.} Adulte P. miniata sont répartis le long de la côte pacifique de Sitka, en Alaska à Baja, en Californie et ¹² sont facilement maintenu dans les aquariums marins. Les ovocytes sont ronds obtenus l'année et chaque femelle peut perdre des dizaines de milliers d'œufs. Les ovocytes sont facilement maturation et fécondés à l'extérieur ^13. Les embryons obtenus sont transparents permettant une observation facile; ils se développent de façon synchrone, et n'ont besoin que d'eau de mer pour le développement. Assemblage du génome entier et plusieurs transcriptomes sont également disponibles pour P. miniata ( Echinobase.org ). Ces avantages font la solution idéale pour un éventail de rechercheset à des fins d'enseignement.

Au cours des dernières années, P. miniata est devenu un système de modèle pour le réseau de régulation de gènes du développement des analyses ^{du 14 au 16.} Le but de ces études est d'identifier l'ensemble compliment de gènes régulateurs et de déterminer le réseau de leurs interactions. Une grande partie de ce travail implique l'expression des gènes perturbation par l'introduction d'oligonucléotides antisens ou en ARNm synthétisé in vitro. En outre, les analyses réglementaires cis sont utilisés pour caractériser la fonction de l'ADN réglementaire ^15. Ces analyses nécessitent l'introduction de réactifs de perturbation et / ou de l'ADN reporter construit dans des embryons. En outre, afin de caractériser les effets en aval de ces perturbations, il faut doser de nombreux embryons pour les changements dans l'expression du gène de cibles potentielles. Les techniques de micro-injection de plusieurs centaines de zygotes sont au centre de ce travail.

Échinodermes, y compris P. miniata , nécessitent plusieurs mois pour atteindre la maturité sexuelle. De ce fait, il n'est généralement pas pratique pour développer et maintenir des lignées transgéniques de ces animaux d'expérimentation. Par conséquent, la reproduction des adultes transgéniques ne peut pas efficacement créer des embryons modifiés. Au lieu de cela, la perturbation doit se produire de novo à travers la micro-injection. Microinjection offre la possibilité de modifier les embryons avec des réactifs qui ne sont pas des cellules perméables. Le protocole suivant décrit un procédé pour introduire de l'ADN, de l'ARNm, des traceurs de cellules, et des oligonucleotides morpholino antisens dans des centaines d'oeufs fécondés dans une séance 2-3 h à travers la micro-injection. Ce produit suffisamment de matériau pour une série d'expériences en aval, y compris, mais sans s'y limiter, qPCR, hybridation in situ, l'ARN-Seq, et un transfert de Western en.

Protocole

Gardez toute l'eau de mer ou eau de mer artificielle (SW), les animaux adultes, et les cultures à 15 ° C autant que possible. Veiller à ce que les œufs et les zygotes sont maintenus immergés dans le sud ouest.

Sels de mer préparés commercialement reconstituées avec de l'eau distillée ou d'osmose inverse sert bien comme une source de SW. Vérifiez la salinité aide d'un densimètre et ajuster sels ou d'eau pour obtenir un niveau optimal. Maintenir le niveau de densité entre 1,020 à 1,025. Gardez tout verre et en plastique distinct de tous les autres appareils de laboratoire pour éviter toute contamination par des produits chimiques. Clean embryon qualité du matériel de laboratoire d'un rinçage à l'eau désionisée ou de temps en temps de trempage dans de l'hypochlorite de sodium dilué suivi d'un rinçage à l'eau plusieurs fois.

1 Obtention et de maturation des gamètes de Patiria miniata adultes

1. Sélectionner un animal pour exciser les gonades. Déterminer le sexe après l'excision par la recherche de la présence d'ovaires ou testicules car P. miniata ne sont pas en soixually dimorphisme.
2. Couper une petite ouverture, ne dépassant pas 1 cm, le long du côté d'un bras de l'étoile de mer avec une lame de scalpel (Figure 1A). En utilisant de petites pinces à bouts ronds Tirez bords de l'incision pour accéder au tissu des gonades et tirez tissus des gonades à travers l'incision.
   REMARQUE: Évitez de tirer sur le tissu intestinal, qui est un tissu gris ou brun lâche (figure 1B). Les ovaires sont généralement orange, jaune ou brun clair (figure 1C), tandis que les testicules sont de couleur blanche ou beige et quand perturbés provoquera l'eau de mer devienne laiteuse ou trouble en apparence (figure 1D).
3. Femelles Retour aux aquariums. Isoler les hommes pour une heure ou deux dans un conteneur de SW depuis le stress de manipulation peut provoquer la ponte. Animaux guérissent le long du site de l'incision et continuent de fournir des gamètes pendant plusieurs mois.
4. Recueillir les testicules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec aussi peu que possible SW et stocker sur la glace jusqu'à utilisation. Magasin des testicules ne noused sur le jour du prélèvement à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.
5. Recueillir des ovaires dans une petite boîte de culture de verre dans un plusieurs millilitres de SW. Pour libérer les ovocytes à partir du tissu des ovaires, démêler le tissu avec deux paires de pinces jusqu'à ce qu'il ne reste de gros morceaux.
   REMARQUE: Dans l'idéal, la majorité des ovocytes sont pleinement développé. Ces ovocytes sont grands, ronds, et clair jaune ou brun clair avec une vésicule germinative distincte dans l'ovocyte (figure 2A), par rapport au sous-ensemble d'ovocytes sous-développés qui sont plus petits, brun, granuleux et opaque (figure 2B). Si plus de 25% des ovocytes sont de la variété développée, sélectionnez une femme différente pour obtenir des ovocytes.
6. Verser les ovocytes et le reste du tissu au moyen d'une cuvette de filtre à mailles avec une taille de pores de 200 um et recueillir s'écouler à travers. Celui-ci contiendra toutes les variétés d'ovocytes mais enlever le tissu ovarien. Déloger ovocytes restants du tissu pris par le filtre par pulvérisation wvec SW à partir d'un vaporisateur. Filtrer les coupes sont faites au moyen d'un tube conique de 50 ml (figure 3A-A ').
7. Verser le débit à travers l'étape 1.6 par 100 um filtre à tamis tasse. Jetez les ovocytes dans l'écoulement à travers. Ovocytes grandes pleinement développés qui sont prêts pour la maturation va rester sur le filtre. Rincer les ovocytes dans un récipient propre bécher de 200 ml.
8. Ajouter 95 ml de SW à 200 ml verre bécher d'ovocytes. Ajouter 5 ml de 200 uM de 1-méthyladénine pour une concentration finale de 10 uM.
9. Transférer les ovocytes à un grand plat peu profond de la culture et le lieu à 15 ° C. Une grande aire de surface au volume boîte de culture permettant l'échange d'oxygène. Les ovocytes ne mûrissent pas ou ne peuvent pas bien se développer si elles sont surpeuplées pendant cette phase de maturation. Partagé en plusieurs plats du Sud-Ouest, plus de 10 uM 1-methlyadenine jusqu'à la culture est à moins de 200 ovocytes / ml.
10. Autoriser les ovocytes de mûrir pour 45-90 min, mais pas plus que cela rendra les ovocytes sont incapables d'être fertilized. Pour déterminer si la maturation est terminée, regardez les ovocytes sous un microscope à dissection. Les mouvements de vésicules germinales vers et fusionne avec la membrane cellulaire pendant la maturation. Il se décompose alors et n'est plus visible dans les ovocytes matures (figure 2C) donc.

2. fécondation des ovocytes matures

1. Choisissez un petit groupe de tissu testiculaire, à peu près la taille de pois, et la viande hachée dans une petite boîte de culture en verre avec environ 1 ml de SW.
2. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer 2-3 gouttes de l'eau de mer laiteuse résultante à environ 100 ml des ovocytes matures et agiter la boîte de culture à mélanger. Éviter de transférer des morceaux de tissu testiculaire. Évitez d'ajouter une plus grande quantité de sperme, car cela pourrait entraîner des Polyspermie du faible développement ultérieur.
3. Après plusieurs minutes d'observer les ovocytes sous un microscope à dissection. Les œufs fécondés, ou zygotes, ont une enveloppe de fertilisation, qui est une bulle transparente qui se lève au large de la cell membrane (figure 2D).
   REMARQUE: Ne pas procéder à la culture si moins de 90% des œufs féconder puisque les taux de fécondation pauvres sont une indication d'une culture malsaine qui peut aussi ne pas bien se développer.
4. Après la fécondation est terminée, modifiez le SW sur les zygotes en versant à travers un filtre de maille de 100 um et de rinçage dans une boîte de culture avec SW frais. Il est important d'enlever l'excès de sperme pour éviter la privation d'oxygène. Placer la boîte de culture à 15 ° C pendant 15 à 30 min.

3.-De gélifiant et d'aviron des ovocytes fécondés

1. Préparer des plats d'injection en prenant le couvercle d'une boîte de Pétri de 60 x 15 mm de polystyrène.
   1. Tracez une ligne permanente de marqueur sur le dos de la boîte, autour de la zone qui correspond au champ de vue sur le microscope de la micro-injection. Cela garantit que tous les embryons sont ramé dans le champ de vision du microscope.
   2. Utiliser une pipette Pasteur en verre pour marquer une ligne à travers le cercle, preferably sur un côté du cercle (figure 3B). Utilisez cette ligne plus tard à casser les aiguilles d'injection (étape 4.5).
      NOTE: Les réactifs couramment utilisés pour respecter les embryons d'oursins, par exemple, le sulfate de protamine ou poly-L lysine, sont inutiles. De-gelée P. zygotes miniata collent très bien au plastique non. Notez qu'ils ne collent pas bien à plats en verre.
2. Ajouter environ 10 ml SW à chaque plat de sorte que la surface est couverte, mais l'eau ne sera pas éclabousser de façon excessive dans le plat, car cela pourrait perturber embryons Rama.
3. Retirez le P. manteau zygote miniata de gelée avec SW acide avant l'aviron. Cette couche de gelée est plus étendu que celui observé pour les espèces d'oursins de mer modèle.
   1. Préparer l'acide SW dans la gamme de pH 4,0-4,2. Le pH est essentielle pour permettre l'élimination efficace de la couche de gelée tout en permettant un développement normal.
   2. Ajouter quelques gouttes uniques de 1 N (1 M) HCl dans SW à 1 L stocks de SW. Permettre à chaque goutte de mélanger complètementet contrôler le pH avant d'ajouter plus d'HCl.
      REMARQUE: Une à plusieurs ml de résultats HCl de pH approprié, mais ne pas ajouter la totalité du volume à la fois.
      NOTE: Préparer HCl 1 N dans une hotte avec SW et 12 N (12 M) HCl.
   3. Retirer SW sur zygotes en les versant sur un filtre de maille de 100 um. Rincer dans un bécher de 200 ml dans la plus petite quantité de SW possible (environ 10 ml). Remplir le bécher de 150 ml avec SW acide (pH 4,0) et permettent les zygotes de s'asseoir dans le sud-ouest de l'acide pendant 3 min.
4. Bande de revêtement de gelée des zygotes en versant, dans les deux sens entre deux béchers de 200 ml, à chaque fois le passage des zygotes à travers un filtre de maille de 200 um. Verser les zygotes à travers le filtre autour 5-10x plus sur une fenêtre de temps de 2 min.
5. Retirer SW acide en versant les zygotes sur un filtre de maille de 100 um. Rincer les zygotes dans une petite boîte de culture en verre avec SW. Zygotes de-gelée peuvent s'en tenir à des plats en plastique. embryons de rang immédiatement; ils commencent à produire plus jmanteau elly qui conduit à une mauvaise adhérence à des plats en plastique dans le temps.
6. Utilisez une bouche pipette (figure 3C-C ') pour ramasser les zygotes de la boîte de culture de verre et les placer dans les lignes droites sur les plats d'injection. Faire fondre le centre du côté mince d'une pipette Pasteur à la flamme jusqu'à ce que le verre est mou. Rapidement tirer les extrémités du verre en dehors de produire une très fine bande de verre. Une fois le verre est cool, rompre le petit bout de la pipette Pasteur (pour plus d'informations sur la préparation d'une pipette de bouche voir Wessel et al., 2004 ¹⁷ ou Sweet et al., 2004 ^18).
   1. Faire une pipette à rames tel que le diamètre est juste plus grand que le diamètre des embryons de sorte que seulement un seul zygote va entrer et sortir de la pipette à la fois. Cela permettra à une seule ligne à la forme. Pipettes de plus petit diamètre peuvent dépouiller l'enveloppe de fertilisation et de perturber les zygotes que P. zygotes miniata n'ont pas de membrane hyaline une sont assez doux.
   2. Si les zygotes ne collent pas à la boîte de plastique, gardez-les pour plus de temps dans le sud ouest de l'acide (jusqu'à plusieurs minutes). Alternativement, une pipette de plus petit diamètre peut aider à enlever couche de gelée pour permettre les zygotes de coller plus efficacement.
   3. Les zygotes sont légèrement flottabilité positive et ont tendance à flotter ou planer juste au-dessus du fond du plat. Dans ce cas, la position de la pipette de telle sorte que les rames zygotes sont pressées en douceur sur la surface du plat à leur sortie de la pipette (figure 3D).
      REMARQUE:. C'est permis de monter le nombre de lignes sur ces plats P. membranes embryonnaires miniata ne deviennent pas plus difficile à pénétrer au fil du temps et par conséquent on peut injecter des centaines de zygotes sur un plat unique.

4. injection de zygotes

1. Préparer des solutions d'injection avec des concentrations appropriées d'oligonucléotides antisens morpholino (MASO), ARNm, ou ADN dans une concentration finalentration de KCl 200 mM. 400-800 uM MASO et 2,5 ng / pl d'ADN ont tendance à produire des phénotypes morphant tout en minimisant la toxicité. La concentration finale dans l'oeuf 1/125 ^ème sera la concentration de départ ^14. Pour les solutions injectables contenant Masos, de la chaleur à 65 ° C pendant 5 min immédiatement avant d'utiliser et de stocker à la température ambiante.
   1. Pour la facilité de tri embryons injectés, ajouter rhodamine dextrane traceur à la solution d'injection pour obtenir une concentration de 0,1%.
2. Préparer des aiguilles d'injection en tirant un tube capillaire en verre (1,0 mm de diamètre extérieur x 0,75 mm ID, longueur de 100 mm) à une aiguille de traction instrument selon les instructions du fabricant. Aiguilles convenant à l'injection dans les oursins travaillent aussi bien pour les étoiles de mer, afin d'utiliser les mêmes paramètres ^19.
3. Veuillez environ 2 ul de solution d'injection dans une aiguille d'injection à l'aide d'une pointe de pipette microloader.
4. Insérez le bout de l'aiguille dans la manipulator. Réglez Picospritzer à 100 ms impulsion et une pression d'air de 40 psi.
5. Placer un plat d'embryons ramé sur la platine du microscope et ont tous les embryons dans le champ de vue. Orienter l'antenne de telle sorte que la ligne de prédécoupe se trouve du côté le plus proche de l'aiguille. Positionner l'aiguille à un angle d'environ 60 ° de sorte que la pointe se trouve à proximité du centre de la ligne et juste au-dessus de la surface de l'eau.
6. Concentrez-vous sur la ligne pointillée et abaisser l'aiguille jusqu'à ce que la pointe est au point. Abaissez la pointe un peu plus et de le briser ouvert en exécutant doucement dans les crêtes de la ligne pointillée. Soulever le nez hors de la surface du plat et le placer au sommet de la première rangée de zygotes et se concentrer sur les zygotes.
7. Abaissez la pointe de telle sorte qu'il empaler le centre de zygote provenant de partout dans un angle de 60 °. L'aiguille pénètre facilement P. zygotes miniata. Appuyez sur la pédale au pied (ou d'autres moyens de forçage de la matière de l'aiguille d'injection) pour introduire un bolus d'injesolution ction dans l'embryon.
8. Objectif pour un bolus qui est de 20 à 30% du diamètre de l'embryon, ou entre 25 et 80 pl. Si le bolus est plus grande ou plus petite que cela, ajuster la durée de l'injection sur la Picospritzer et injecter la prochaine embryon. Continuer à ajuster la durée pour obtenir la taille souhaitée de bolus. Commencez à 100 msec. Re-casser l'aiguille si elle est supérieure à 200 ms est nécessaire d'introduire le bol approprié. Jetez l'aiguille et de préparer un nouveau si moins de 15-20 ms est nécessaire pour obtenir cette taille de bolus que la taille de l'aiguille est trop grande et peut perturber le développement normal.
9. Passez à injecter les zygotes restants sur le plat d'injection. Les embryons peuvent être facilement injecté jusqu'à ce clivage commence et en blastomères simples après la première division. Soulever périodiquement l'aiguille au-dessus de la surface de l'eau pour éliminer les zygotes qui se collent sur l'aiguille. Si nécessaire ré-briser la pointe de l'aiguille ou de charger une nouvelle aiguille si un blocage se produit.

5. La collecte injecté embryons pour l'analyse en aval

1. Autoriser les embryons de se développer à 15 ° C dans le sud ouest. Maintenir une surface spécifique élevée de volume dans les cultures de permettre l'échange d'oxygène. Assurez embryons ne sont pas bondé; garder cultures égal ou inférieur à 200 embryons / ml. Selon le stade souhaité de l'embryon, prévoir de recueillir les embryons injectés aux alentours de 20-24 heures après la fécondation.
   NOTE: C'est souvent le moment idéal pour trier et collecter et parce que les embryons se développent normalement se distinguent facilement morphologiquement, mais ne sont pas encore nager.
2. Si les embryons sont éclos, saler légèrement choc pour empêcher la natation. Ajouter 200 ul de 5 M de NaCl à 10 ml de SW dans le plat d'injection tout en remuant doucement la SW. Après quelques minutes, les embryons tomberont au fond de la boîte. Ces informations et de les déplacer à la salinité SW normale.
3. Recueillir embryons injectés sous une source de lumière fluorescente approprié compatible avec le traceur utilisé dans le INJECTIsur la solution. Si aucun traceur a été utilisé, sorte d'embryons de sélectionner pour une morphologie normale.
4. Avec une pipette bouche, tirer fluorescent embryons avec une quantité minimale de SW et de faire sauter les dans une petite boîte de culture rempli de SW. Pipettes de bouche idéales ont une ouverture suffisamment grande pour les embryons d'être tiré et sortir sans les endommager, mais pas si grand que les embryons non désirés et SW étrangère sont également tirés vers le haut.
5. Une fois que tous les embryons désirés ont été recueillies dans le nouveau plat, observer les embryons sous la lumière fluorescente et supprimer tous les embryons de l'ONU à injection ou des embryons peu développés.
6. Culture triée embryons à étapes désirées dans un incubateur et procéder à l'imagerie ou d'autres protocoles souhaités.

Résultats

L'objectif de ce protocole est d'introduire les réactifs dans des embryons. Nous démontrons l'efficacité du protocole en injectant un journaliste construction d'ADN qui entraîne l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP). Embryons injectés expriment la GFP dans des parcelles de clones (figure 4A-B) que l'ADN incorpore lors du clivage précoce. Beaucoup de réactifs qui sont souhaitable d'introduire dans les embryons sont toxiques en grande quantité et à des ...

Discussion

Il ya deux étapes essentielles qui sont difficiles pour les utilisateurs novices de cette technique mais qui sont essentielles pour réussir à créer des embryons morphant. Le premier est la sélection des ovocytes sains qui viendront à échéance et fertiliser correctement. Le pourcentage d'évolution normale dans une culture dépend de la saison, de la santé de l'animal, et le nombre de fois que les ovocytes ont été récoltées à partir d'un seul individu. Les ovocytes ont tendance à être de meill...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003