Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Résumé

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the Apc^Min/+ colorectal cancer model.

Résumé

Les cellules myéloïdes sont des cellules immunitaires les plus abondants dans les tumeurs et il a été démontré pour favoriser la progression de la tumeur. Techniques d'imagerie intravitale modernes permettent l'observation du comportement cellulaire vivent à l'intérieur de l'organe, mais peut être difficile dans certains types de cancer dû à l'accessibilité d'organes et de la tumeur tels que l'intestin. L'observation directe des tumeurs de l'intestin n'a pas été rapportée précédemment. Une intervention chirurgicale décrite ici permet l'observation directe de la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales chez des souris vivantes en utilisant des souris transgéniques rapporteurs fluorescent et traceurs injectables ou des anticorps. A cet effet, un quatre couleurs, multi-région, micro-lensed disque filature microscope confocal qui permet l'imagerie continue à long terme avec l'acquisition rapide d'images a été utilisé. Apc ^{Min / +} souris qui développent de multiples adénomes de l'intestin grêle sont croisés avec des souris c-fms-EGFP pour visualiser les cellules myéloïdes et des souris ACTB-ECFPà visualiser les cellules épithéliales de l'intestin des cryptes. Les procédures pour le marquage de composantes de tumeurs, tels que les neutrophiles et les vaisseaux sanguins, et la procédure de positionnement de la tumeur pour l'imagerie à travers la surface séreuse sont également décrits. Films time-lapse compilées à partir de plusieurs heures de l'imagerie permettent l'analyse du comportement des cellules myéloïdes in situ dans le microenvironnement intestinal.

Introduction

Des preuves irréfutables démontrent maintenant que le microenvironnement de la tumeur, constitué de populations cellulaires hétérogènes, y compris les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et inflammatoires, la matrice extracellulaire et les facteurs solubles, joue un rôle crucial dans l'initiation et la progression des tumeurs solides, en contribuant à la quasi-totalité caractéristiques du cancer ^1. En effet, au cours de la progression de la tumeur, il existe des interactions dynamiques constants entre les cellules cancéreuses et les cellules transformées stromales qui évoluent à générer un micro-environnement favorable à la malignité ^2. Parmi les cellules immunitaires infiltrant la micro-environnement de la tumeur, les cellules myéloïdes sont les plus abondants ^3. Composé de macrophages associés aux tumeurs (TAM), les cellules suppressives myéloïdes dérivées (MDSC), les cellules dendritiques (DC) et les neutrophiles (PMN), les cellules myéloïdes sont recrutés dans la moelle osseuse et infiltrent progressivement les tumeurs, en libérant des cytokines, des facteurs de croissance et des protéases qui peut favoriserla croissance de la tumeur et la propagation ^4. La diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules myéloïdes est complexe mais dynamique. Ainsi, la compréhension de la nature de leurs interactions est cruciale pour déterminer pourquoi ces cellules favorisent la progression du cancer au lieu de participer à une réponse immunitaire anti-tumorale, et peut aider à trouver de nouvelles cibles pour le contrôler.

L'observation directe par microscopie intravitale fournit des informations sur la dynamique des cellules dans les tissus de souris vivantes ^5. A quatre couleurs, multi-région, micro-lensed filature disque système confocal a été conçu pour étudier les cellules stromales dans les tumeurs mammaires ^6. Cette approche permet une imagerie continue à long terme et comprend plusieurs avantages tels que (a) l'acquisition des images rapides afin de minimiser les artéfacts de mouvement, (b) l'anesthésie à long terme, (c) quatre d'acquisition de couleur pour suivre différents types de cellules, (d) marquage fluorescent des différentes composantes tumorales, et (e) l'observation de différents micro-environnements tumoraux esprithin la même souris pour éviter la souris à la variabilité de la souris ^7-9. Avec cette technologie, les comportements cellulaires différentes ont été rapportées dans le virus de la tumeur mammaire de modèle (MMTV) polyome milieu de promoteur-oncogène T entraînée (PyMT) qui affiche les étapes progressives de la tumorigenèse. Lymphocytes T régulateurs (Treg, visualisées par le transgène Foxp3 ^EGFP) migrer préférentiellement à proximité des vaisseaux sanguins que DCs (CD11c-DTR-EGFP), des fibroblastes de carcinome associé (FSP1 ^{+ / +} -EGFP) et des cellules myéloïdes (c-fms -EGFP) présentent une motilité supérieure à la périphérie de la tumeur à l'intérieur de la masse tumorale. Dans la condition d'hypoxie systémique aiguë, les cellules ont migré différemment: Tregs arrêter la migration contrairement aux cellules myéloïdes qui continuent à se déplacer ^6. En outre, dans le même modèle de la souris, il a été montré que la sensibilité de la doxorubicine change avec le stade tumoral, la distribution du médicament est lié à la réponse aux médicaments, et de la doxorubicinetraitement conduit au recrutement de CCR2-dépendant des cellules myéloïdes à des tumeurs. Ainsi, l'imagerie en direct peut également être utilisé pour mieux comprendre la réponse aux médicaments in situ et la biologie de la chimiorésistance ^10,11.

Polypose adénomateuse familiale (Apc) des mutations génétiques se produisent généralement dans les adénomes colorectaux humains et les carcinomes ¹² et mutation d'une seule copie des résultats de gène APC dans la polypose adénomateuse familiale (FAP), qui confère un risque extrêmement élevé de cancer du côlon ^13. La souche de souris Apc ^{Min / +} porte une mutation de troncature au niveau du codon 850 du gène APC et développe spontanément plusieurs adénomes intestinaux à travers l'intestin grêle, ^{du 14 au 16.} Imagerie intravitale à long terme de l'intestin est difficile en raison de l'envahissement de la procédure, depuis l'ouverture de la cavité péritonéale est nécessaire pour accéder à l'intestin. Imagerie en temps réel à court terme studies ont déjà été publiés sur l'intestin sain ^17,18, mais l'observation directe à long terme des tumeurs intestinales n'a pas été signalée. Une intervention chirurgicale a été conçu et raffiné pour visualiser des tumeurs à travers la surface séreuse de l'intestin, en utilisant le système de microscopie intravitale disque rotatif utilisé auparavant à l'image des tumeurs mammaires ^6,10. Dans cet article, un protocole est décrit qui permet de suivre le comportement des cellules myéloïdes dans les tumeurs dans l'intestin grêle en utilisant Apc ^{Min / +} souris.

Protocole

NOTE: Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC), UCSF. Toutes les expériences d'imagerie sont des procédures non-survie et les animaux ont été euthanasiés immédiatement après la fin de l'acquisition de l'image.

1. génération de souris

REMARQUE: Apc ^{Min / +} souris, porteuses d'une mutation sur le gène Apc, développent spontanément 50-100 adénomes dans l'intestin grêle.

1. Cross Apc ^{Min / +} souris avec la ligne ACTB-ECFP, qui exprime ECFP sous le promoteur de l'actine, et en outre avec la ligne c-fms-EGFP, qui exprime EGFP sous le promoteur c-fms pour détecter les cellules myéloïdes. Animaux hétérozygotes pour ACTB-ECFP et c-fms-EGFP sont utilisés pour détecter la fluorescence.
2. Utilisez la souris à 3-4 mois d'âge à l'image adénomes clairement détectables.

2 Préparation de Matières avant la chirurgie

REMARQUE: Les détails du microscope set-up ont été décrites précédemment ^6,7.

1. Microscope
   1. Allumez la couverture chauffante. Allumez le laser à l'argon pour excitation à 488 nm et à l'état solide 405 nm, 561 nm et 640 nm lasers. Allumer le microscope, l'unité de commande de disque en rotation, l'AOTF, l'unité de commande de laser, et l'unité de commande de caméra.
   2. Ouvrez le volet de microscope, qui transforme la LED rouge. Mettez le logiciel de l'ordinateur et l'appareil photo.
2. Plate-forme d'imagerie
   1. Assurez-vous que la pièce de théâtre est propre. Sinon, nettoyer à l'eau et au savon puis séchez.
   2. Prenez deux lamelles et utiliser du ruban de laboratoire pour les fixer sur l'insert. Placer l'insert sur la scène et le nettoyer avec des lingettes alcoolisées.
   3. Avec du ruban de laboratoire, fixez la couverture chauffante sur le côté droit de la scène.
   4. Vérifier l'intégrité de la membrane de caoutchouc sur le cône de nez et la changer si nécessay. Positionner et fixer le cône de nez pour la livraison de l'isoflurane à l'animal à l'aide d'une gaze et bande de laboratoire.
3. L'isoflurane système anesthésie
   1. Remplir le réservoir de l'isoflurane.
   2. Allumez le vide et ajuster à 1,2 L / min.
   3. Ajouter de l'eau distillée pour le nébuliseur et connecter le nébuliseur au système isoflurane.
   4. Mettez l'analyseur d'oxygène et le connecter au système de l'isoflurane. Mettez le réservoir d'oxygène et de s'assurer que l'analyseur d'oxygène montre 100%. Réglez le débit O ₂ à 0,2 L / min.
   5. Mettez le réservoir d'azote et régler le débit à 0,8 L / min. Assurez-vous que l'analyseur d'oxygène montre 21%.
4. Préparation des outils de chirurgie et la plate-forme
   1. Nettoyer les 2 paires de pinces à dissection et ciseaux avec de l'eau et du savon.
   2. Allumez le stérilisateur à billes chaude et laisser atteindre 250 ° C. Stériliser les outils de chirurgie pendant 30 sec. Laissez-les refroidir.
   3. Placez un maturateur de laboratoire sur le banc de la chirurgie.
   4. Utilisez un couvercle en polystyrène comme une plate-forme chirurgicale. Couvrir avec un morceau de laboratoire suintant. Préparer un deuxième morceau de laboratoire suintant changer après le rasage de la souris.
   5. Placez le cône de nez à la ligne de l'anesthésie sur le couvercle en polystyrène recouvert, et fixez-le sur le couvercle en polystyrène (pas sur le maturateur de laboratoire) avec un peu de ruban et utiliser deux aiguilles des deux côtés du cône de nez à la maintenir en place.
   6. Assemblez la bétadine, des tampons d'alcool, gaze stérile, super colle, lames de microscope, rasoir électrique, et 4 morceaux de ruban de laboratoire.

3 Préparation des injections

1. Sous le capot, préparer une seringue à insuline (28 G x ½ po) avec 7 pi de Ly-6G (Gr1) anticorps actions AF647 conjugué (1 mg / ml) dans 100 ul de 2000 kDa rhodamine-dextran (4 mg / ml ) pour l'injection de rétro-orbital. Injection rétro-orbitaire est recommandé ^{Min / +} souris Apc depuis l'anémie qui se développe dans ces animaux fait la queue veines difficult pour détecter à travers la peau.
2. Préparer une seconde seringue d'insuline de 1 mg / kg d'atropine dilué dans 150 ul de PBS par voie sous-cutanée (sc), injection avant l'imagerie pour amortir les mouvements péristaltiques de l'intestin.

4 Préparation de l'intestin pour l'imagerie

1. Vérifiez que la ligne de l'anesthésie à la chambre d'admission est ouverte, et les lignes de la table d'opération et microscope sont fermés.
2. Transfert de l'animal à la chambre d'anesthésie. Fermer la chambre d'anesthésie et tourner sur la isoflurane à 4% (avec 21% d'O _2).
3. Lorsque la souris respire profondément et lentement (après 5-6 min), la transférer à l'étape chirurgicale sur son flanc et injecter la solution d'anticorps Gr1 et / ou une solution de dextrane rétro-orbitale.
4. Ouvrez la ligne de l'anesthésie liée à la plate-forme chirurgicale. Fermer la ligne de la chambre d'anesthésie et de mettre la souris sur le dos avec son nez dans le cône de l'anesthésie.
5. Réduire le isofluraneconcentration de 4% à 2,5%.
6. Vérifiez que la souris est bien anesthésié en pinçant sa patte et tester le réflexe cornéen.
7. Ajouter ophtalmique lubrifiante pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie.
8. Fixez les membres de la souris à l'étape chirurgicale en ajoutant bande de laboratoire.
9. Enlever les poils de la surface ventrale en utilisant un rasoir électrique. Également supprimer les cheveux de la patte arrière gauche pour positionner l'oxymètre avant l'acquisition. Retirer le maturateur de laboratoire de l'étape chirurgicale et le remplacer par un propre pour éviter la contamination de cheveux.
10. Désinfecter la surface ventrale avec des lingettes d'alcool et de la bétadine.
11. Injecter la solution d'atropine (de 3,2) ms dans un flanc de la souris.
12. Faire une incision ventrale de 1 cm de la ligne médiane à travers la peau et le péritoine à l'aide de ciseaux et une paire de forceps. Retirez doucement 3-4 cm de l'intestin et d'identifier un ou plusieurs tumeurs à l'image.
13. Prenez un micr de verretoboggan oscope et la position d'une boucle de l'intestin sur elle avec une tumeur dans la partie supérieure.
14. Ajoutez un peu de super glue à quelques endroits le long de l'intestin pour le fixer à la diapositive. Attendez une minute pour que la colle sèche. Utilisez un marqueur pour dessiner une ligne sur la diapositive montrant la tumeur afin de faciliter sa localisation avec le confocale.

5. positionnant la souris sur la scène et préparation pour l'acquisition de l'image

1. Retirer le ruban de laboratoire de membres.
2. Ouvrez la ligne de l'anesthésie à la platine du microscope et de fermer celui de la plate-forme chirurgicale.
3. Transférer la souris avec soin à la platine du microscope avec son côté ventral vers le bas et son nez dans le cône de nez. Fixer la ligne d'anesthésie avec du ruban laboratoire.
4. Re-positionner la souris et / ou le chariot afin d'avoir l'intestin dans le centre de l'une des fenêtres de couverture-glissé. Collez doucement la lame avec du ruban de laboratoire.
5. Fixer la sonde d'oxymètre à la branche gauche de la souris poursuivre son taux et la saturation artérielle en oxygène niveaux respiratoires et cardiaques.
6. Couvrir la souris avec la couverture chauffante pour éviter l'hypothermie.
7. Réduire la concentration d'isoflurane de 2,5% à 1-1,5% pour l'imagerie.

6 Acquisition d'images à l'aide du logiciel μManager

1. Augmenter la vitesse de CSUX à 2500 rpm pour améliorer la qualité d'image dans les paramètres de configuration.
2. Utilisez le menu déroulant pour choisir Objectif 10X 0,5 NA NA ou 20X 0,75 Fluar objectif de l'objectif.
3. Choisissez le laser 405 nm de couleur menu déroulant.
4. Cliquez sur le Live et la mise au point avec le microscope.
5. Cliquer sur automatique pour ajuster automatiquement les intensités maximale et minimale de pixel de l'image d'affichage sur la base des valeurs des pixels extrêmes de l'image. Un histogramme des intensités des pixels de l'image d'affichage est présenté dans le graphique de la partie inférieure de la fenêtre principale.
6. Réglez l'exposition de l'appareil photo dans la fenêtre Panneau de configuration Piper parla modification du nombre d'impulsions d'horloge (horloge est une 33,333 ms).
7. Si le signal est trop lumineuse à l'exposition la plus faible, diminuer l'intensité du laser à l'aide de l'unité de commande du microscope.
8. Vérifiez l'intensité du signal pour 488 nm, 561 nm et 640 nm lignes laser. Ajuster l'intensité du laser avec sa propre unité de contrôle du laser (488 nm et 561 nm) ou de l'unité de commande du microscope.
9. Dans la fenêtre multi D Acquisition, cochez la case points de temps et entrez dans nombre de points dans le temps et l'intervalle de temps souhaité.
10. Cochez la case Z-piles, choisissez "Z relative» et de définir Z-start et Z-end par rapport à la position actuelle.
    REMARQUE: Pour 10X ou 20X objectif, commencez par 3 avions de Z, 8 pm ou 4 um part respectivement.
11. Cochez la case multiples positions (XY) pour l'imagerie de plusieurs endroits, puis cliquez sur Modifier la liste de position, marquer 4 à 6 positions différentes.
12. Cochez la case Canaux et ajouter des canaux de Nouveau et sélectionnez lasers lignes dans le menu déroulant et type de l'exposition pour chaque canal (par multiples de 33,333 ms).
13. Sélectionnez l'option Enregistrer les images dans la fenêtre "d'acquisition multi D".
14. Sélectionnez un dossier et toutes les images acquises seront automatiquement enregistrés dans ce dossier avec le préfixe donné.
    REMARQUE: Chaque acquisition continue sera enregistré dans un sous-dossier séparé sous forme de fichiers TIFF individuels pour chaque tranche de Z dans chaque couleur à chaque point de temps.
15. Enregistrer tous les paramètres en cliquant sur Enregistrer les paramètres dans la fenêtre multi D acquisition.
16. Cliquez sur Acquérir dans la fenêtre Acquisition multi-dimensionnelle pour lancer l'acquisition.
17. Si la sonde de l'oxymètre n'est pas utilisé ou bien cesse de travailler (quand le pouls n'est pas stable ou difficiles à détecter), vérifier l'efficacité de l'anesthésie toutes les 15 minutes au cours de la procédure d'imagerie en pinçant la patte et de vérifier le réflexe cornéen. Réglez l'anesthésie si la souris est sensible à ces stimuli.
18. Après l'acquisition, euthanasier la souris en augmentant la concent isofluraneration à 5%. En l'absence de mouvements respiratoires sont détectables, retirez la souris de la scène et effectuer une dislocation cervicale.

7 Analyse des images à l'aide du logiciel Imaris

1. Conversion de fichiers .ims (complémentaire figure 1A)
   1. Ouvrez le logiciel de la caméra, cliquez sur Fichier, puis sur Batch Converter.
   2. Cliquez sur Ajouter des fichiers et sélectionnez le premier fichier de la première position. Répétez l'opération pour chaque position.
   3. Pour chaque fichier téléchargé, cliquez sur Paramètres, puis vérifiez que les paramètres "t" pour l'heure, "c" pour les canaux et "z" pour Z-piles apparaissent dans cet ordre.
   4. Enregistrer dans le dossier souhaité. Parcourir et créer un nouveau fichier converti.
   5. Cliquez sur Set pour tous et Lancer.
2. Ajustements (complémentaire figure 1B)
   1. Allez dans le dossier Converted spécifique et ouvrez le premier fichier.
   2. Dans la fenêtre de réglage de l'affichage, régler le fondcoupure de signal en modifiant le nombre minimal pour chaque canal si nécessaire.
   3. Si nécessaire, ajuster l'intensité du signal en modifiant le nombre Max (plus le nombre de Max, plus l'intensité du signal).
      REMARQUE: Les ajustements de l'intensité du signal / contraste permettent le point culminant d'un comportement de la cellule ou un compartiment afin d'avoir une visualisation plus agréable. Il ne change pas le résultat lui-même.
   4. Cliquez sur Modifier et Propriétés de l'image.
   5. Modifiez les x, y et z des valeurs (pour un objectif 10x, x et y = 0,712, z = 8 pm; d'un objectif 20X: x et y = 0,36, z = 4 pm).
   6. Cliquez sur Tous équidistante à ajuster les points de temps. Ajouter la date de début et l'heure de début de l'acquisition. Ajouter la date de fin et l'heure de fin de l'acquisition (complémentaire figure 1C).
   7. Cliquez sur le bouton Play pour regarder le film.
   8. Cliquez sur Modifier et supprimer des points de temps pour supprimer les images floues.
   9. Pour joindre deux acquisitions séparées together dans un film, aller au dernier point du premier film de temps et cliquez sur Modifier> Ajouter des points de temps pour ajouter le second fichier.
3. Enregistrement comme un film (complémentaire figure 1D)
   1. Cliquez sur Enregistrer, choisissez l'extension mov et un facteur de compression de 0.
   2. Cliquez sur Enregistrer.

Résultats

En utilisant la microscopie confocale disque filage, de tissus non tumoraux et tumorales dans l'intestin grêle de Apc ^{Min / +;} ACTB-ECFP; souris c-fms-ECFP peuvent être visualisées à partir de la surface séreuse. Après l'exposition, le logiciel de l'appareil photo est utilisé pour analyser et ajuster l'acquisition (Figure 1 supplémentaire). Après l'administration intraveineuse (iv) l'injection de 2000 kDa fluorescent rhodamine-dextra...

Discussion

Dans cet article, un protocole détaillé est décrit pour la filature disque imagerie confocale de la dynamique des cellules myéloïdes in tumeurs intestinales pendant plusieurs heures dans un animal vivant, imagé du côté de la séreuse de l'intestin.

Pour éviter l'inflammation et d'avoir des conditions physiologiques optimales, l'imagerie de l'intestin qui doit être fait sur l'organe intact. Cependant, l'imagerie de la face séreuse de l'intestin est d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ApcMin/+ mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
μManager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b