Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l'enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

Résumé

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Résumé

La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide. potentiel d'action entraînée afflux de Ca2 ⁺ dans la terminaison présynaptique, à travers les canaux calciques voltage-dépendants (VGCCs) situés dans la membrane de la face de sortie, est le déclencheur de la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs. Cruciale pour la rapidité de la transmission synaptique est la synchronisation spatiale et temporelle entre l'arrivée du potentiel d'action, VGCCs et le mécanisme de libération de neurotransmetteur. La possibilité d'enregistrer directement des courants ^{Ca2 +} de la membrane de presse du visage de terminaux présynaptiques individuels est indispensable pour une compréhension précise de la relation entre présynaptique Ca2 ⁺ et la libération de neurotransmetteurs. L'accès à la membrane libération présynaptique visage pour l'enregistrement électrophysiologique n'est pas disponible dans la plupart des préparations et Ca ^{2 +} présynaptique entrée a été caractérisé en utilisant des techniques d'imagerie et MeasureMe courant macroscopiquents - techniques qui n'ont pas une résolution temporelle suffisante pour visualiser ^Ca l'entrée. La caractérisation de VGCCs directement à terminaisons présynaptiques simples n'a pas été possible dans les synapses centrales et a jusqu'ici été atteint avec succès que dans la synapse de type calice du ganglion ciliaire poussin et dans les calices de rat. Nous avons abordé ce problème avec succès dans la synapse réticulo géant de la lamproie de la moelle épinière par le développement d'une préparation très dissociés de la moelle épinière qui donne axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de structures post-synaptiques. Nous pouvons fluorescence étiqueter et identifier les terminaux présynaptiques individuels et les cibler pour l'enregistrement. Utilisation de cette préparation, nous avons caractérisé VGCCs directement à la face de sortie de terminaux présynaptiques individuels en utilisant l'immunohistochimie et d'électrophysiologie approches. Ca2 ⁺ courants ont été enregistrés directement à la libération visage membrane oterminaisons présynaptiques individuels f, le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.

Introduction

La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide et précise. Action éventuelle invasion de la terminaison présynaptique conduit à l'ouverture de VGCCs situés dans la membrane de presse du visage, l'augmentation résultante présynaptique Ca2 ⁺ agissant comme déclencheur pour la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs ^1. Toutes ces étapes se produisent dans des centaines de microsecondes ^2, et donc nécessitent un couplage spatial serré de VGCCs à la fusion des vésicules machines ^3. Présynaptiques flux de ^{Ca2 +} ont été caractérisées principalement par imagerie approches utilisant des colorants sensibles ^{4 de} Ca. L'incorporation de ^{Ca2 +} tampons qui modulent Ca2 ⁺ dans les neurones présynaptiques a été utilisée pour caractériser la relation entre indirectement calcium présynaptique et la neurotransmission ^3. En outre, la modulation de la concentration de Ca2 ⁺ libre présynaptique par uncaging Ca2 ^{+ 5} ou enregistrement macroscopic courants de ^{Ca2 +} ont été utilisés en conjonction avec les mesures de fusion et / ou la libération des vésicules; telles que les mesures de capacité ⁶ ou post-synaptiques réponses ² pour répondre à la même question. Cependant, la caractérisation de ^{Ca2 +} courants directement à la face de sortie, la section spécialisée de la membrane présynaptique où dépolarisation de la membrane est traduit en ^{Ca2 +} courants de déclenchement fusion des vésicules synaptiques et la libération de neurotransmetteurs, fait partie intégrante de l'obtention d'une mesure précise de la Ca2 ⁺ exigence de fusion des vésicules synaptiques. En outre, la capacité à caractériser directement Ca2 ⁺ courants à terminaisons présynaptiques individuels, couplé permet avec des mesures simultanées précises de la fusion des vésicules et la libération d'une explication précise de la relation de synchronisation entre l'évolution dans le temps du potentiel d'action, présynaptique ^Ca2 courant, la fusion des vésicules et la libération. L'accès à la membrane de presse de visagen'est pas disponible dans la plupart des terminaisons présynaptiques en raison de fermer l'apposition par les dendrites post-synaptiques. Cette inaccessibilité a été un obstacle majeur dans la caractérisation des VGCCs car elle empêche des mesures directes de courant dans les terminaux présynaptiques individuels. La caractérisation directe de présynaptiques Ca2 ⁺ courants dans les terminaux présynaptiques individuels a donc pas été possible dans les synapses centrales et n'a été atteint que dans deux terminaux présynaptiques de type calyceal; calice de type synaptique des poussin ganglion ciliaire ^7-10 et rat calices ^11,12. Dans tous les autres terminaux présynaptiques dont la synapse réticulo géant dans la lamproie moelle épinière ^13, le manque d'accès à la membrane libération présynaptique visage a nécessité l'utilisation d'approches indirectes telles que Ca ^de l'imagerie pour étudier présynaptiques flux de ^{Ca2 +.}

Figure 1 lamproie géante synapse réticulo. (A) Section de la lamproie de la moelle épinière pour indiquer l'orientation dorso-ventral. Axones réticulospinaux sont marqués avec astérisque vert. (B) la reconstruction 3-D de la synapse réticulo dans la lamproie moelle épinière montrant axone présynaptique réticulo faire de nombreux contacts en d'Passant (indiqués par des flèches vertes) sur le neurone post-synaptique ^13. Terminaisons présynaptiques ont été marquées avec Alexa Fluor 488 hydrazide phalloïdine conjuguée (vert), alors que le neurone post-synaptique a été rempli avec Alexa Fluor 568 hydrazide (rouge).

Lamproie géants axones réticulospinaux, situés dans la région ventrale de la moelle épinière parallèle à la rostrale-caudale axe Figure 1a, forme multiple en contacts synaptiques sur les neurones Passant de lacorne ventrale de la moelle ¹⁴ Figure 1b ^13. Cellules entières macroscopique ^{Ca2 +} courants ont été enregistrés à partir des axones réticulospinaux dans la moelle épinière intacte ^13,15. Cependant, les tentatives précédentes aveugles à la mesure directe de ^{Ca2 +} courants dans les axones réticulospinaux à la lamproie moelle épinière intacte en utilisant la technique de patch-clamp cellule attachée se sont révélées inefficaces ¹³ en raison du manque d'accès à la membrane libération présynaptique de visage grâce à des processus post-synaptiques opposées Figure 1b. La membrane de la face de presse a été préalablement rendu accessible en enlevant le neurone post-synaptique ^11, la perturbation mécanique de la synapse ¹² avant l'enregistrement ou le traitement enzymatique associée à la dissociation mécanique ^16. Compte tenu de l'organisation complexe de la moelle épinière, il s'avérerait extrêmement difficile d'identifier le neurone post-synaptique et retirer mécaniquement ou perturber ee synapse. Par conséquent, nous avons décidé d'utiliser un traitement enzymatique ¹⁷ suivie par dissociation mécanique.

En utilisant cette approche, nous avons développé une préparation très dissociés de la lamproie de la moelle épinière qui donne viables axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de tout processus post-synaptiques, fournissant ainsi un accès illimité aux terminaisons présynaptiques individuels. En collaboration avec un microscope standard inversé et l'imagerie de fluorescence, il nous permet d'identifier et de cibler les terminaux présynaptiques par fluorescence identifié individuels, avec une pipette de patch contenant une solution d'enregistrement qui isole ^{Ca2 +} courants figure 4C et la figure 4d, pour l'enregistrement en utilisant Cell- attaché technique voltage-clamp. ^{Ca2 +} courants ont été enregistrés directement sur ​​la membrane de presse du visage présynaptique des terminaisons présynaptiques individu Figure 4f. Il s'agit d'une significant percée dans le domaine de la transmission synaptique, car il est le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.

Protocole

1 Préparation de la poly-D-lysine de bromhydrate

1. Préparer 1 mg / ml de bromhydrate de poly-D-lysine dans 0,1 M de tampon borate (pH 8,5).
2. Aliquote et conserver à -20 ° C.

Revêtement 2 Poly-lysine de Lamelles

Remarque: effectuer toutes les étapes de nettoyage et de revêtement dans une chambre à flux laminaire.

1. La place des lamelles dans une boîte de Pétri contenant acide chlorhydrique 1 N (HCl) pendant 2 heures.
2. Aspirer HCl et rincer à l'éthanol à 70% (EtOH) 2-3x.
3. Laisser EtOH à 70% pendant 1 heure.
4. Aspirer EtOH à 70% et rincer à 100% EtOH 2-3x.
5. Laisser EtOH à 100% pendant 2 heures. Aspirer tout EtOH.
6. Sécher avec du papier filtre et l'air sec pendant quelques secondes.
7. Lieu O N en 1 mg ml de solution / / poly-lysine.
8. Rincer lamelles de lendemain avec Millipore 4-5x de l'eau.
9. Air poly-lysine sec revêtu lamelles sur des rouleaux de verre dans une boîte de Petri propre.
10. Pour immunohistochemistry, utiliser 35 x 10 mm boîte de Petri couvercles. Préparer Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) bordée plats en versant PDMS (élastomère et de l'agent de durcissement 10: 1 en poids) dans le plat à une épaisseur de 0,3 cm et laisser reposer à 30 ° CO / N. Une fois que cela a pris, coupez les en 2 cm par 1 cm incrustés dans les PDMS. Nettoyer et enduire le médaillon de poly-lysine suivant les mêmes étapes comme mentionné ci-dessus pour lamelles.
11. Magasin lamelles et des plats revêtus de poly-lysine couverts à l'intérieur de la chambre à flux laminaire jusqu'à utilisation (jusqu'à 2 semaines, mais d'atteindre de meilleurs résultats adhésives en préparant régulièrement tous les 3-4 jours).
12. Préparer un bloc de PDMS, de la broche de la moelle épinière dans le trancheur de tissu vibrant. Mélange élastomère et un élastomère B de 1: 1 en poids. Verser dans un plat de 100 x 15 mm Petri et laisser reposer O / N à 30 ° C. Coupez un morceau rectangulaire des PMDS et il colle à la plaque de base de tranchage en utilisant de la colle époxy. Laisser sécher la colle fixant les PDMS en place et couper plusieurs sections minces à la surface pour obtenir un platsurface à la broche sur le tissu.

3. aiguë dissociation de la lamproie de la moelle épinière à un rendement isolé axones réticulo

1. Anesthésier un ammoecoete ou adulte lamproie (Petromyzon marinus) avec tricaïne méthanesulfonate (MS-222; 100 mg / L). Ajouter anesthésique dans l'eau, dans un gobelet en plastique recouvert par un couvercle, contenant la lamproie à être sacrifié.
2. Décapiter lamproie dans le froid (4 ° C) de la solution de Ringer de la composition suivante (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 _CaCl2, 1,8 MgCl _2, 4 HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, l'osmolarité de 270 mOsm) et retirer le corps muscles de la paroi afin d'exposer la surface dorsale de la moelle épinière.
3. Retirer méninges primitiva de la face dorsale de la moelle épinière à l'aide de pinces fines. Ne retirez pas ventrale méninges primitiva à ce stade.
4. Couper la moelle épinière dans 1 cm de long morceaux.
5. Epingler un morceau de la moelle épinière à l'aide de fines broches insectes, face dorsale vers le haut, sur un PDMS bordée trancher pla de basete (voir 2.12) dans une chambre de trancheuse de tissu vibrant contenant la solution de Ringer glacée.
6. Retirer une partie centrale de la colonne dorsale de la moelle épinière par découpage le long de l'axe rostro-caudal de la lame, laissant les sections intactes de la colonne dorsale de la rostrale et caudale extrémités pour servir de poignées pendant le processus de dissociation figure 2a et la figure 2b. Utilisez le plus lent réglage de la vitesse qui permet le découpage et un réglage de la profondeur qui élimine seulement la colonne dorsale de quitter le sous-jacent colonne axone réticulo Figure 2b en bon état.
7. Incuber tranches pièces de la moelle épinière à la température ambiante pendant 45 min dans un cocktail de 1 mg / protéase ml (type XIV de Streptomyces griseus) et 1 mg / ml de collagénase préparé (type IA de Clostridium histolyticum) dans la solution de Ringer (adapté de El Manira & Bussières 1997 17).
8. Pièces de la moelle épinière Pin enzyme traitée à l'aide de broches fines dans un PDMS alignés boîte de Petri containing froid (4 ° C) la solution de Ringer.
9. Retirer ventrale méninges primitiva avec des pinces fines.
10. Couper les secteurs latéraux de la moelle épinière avec une lame de scalpel au milieu de la partie dorsale en tranches quittant la colonne centrale des axones intacts réticulo dans la moelle épinière figure 2d.
11. Déposer une goutte d'huile d'immersion sur la lentille.
12. Placer la lamelle de poly-lysine recouvert (figure 3a, la pièce supérieure, rectangle rouge) dans la fente de la chambre d'enregistrement Figure 3 et appliquer de la graisse à vide à tous les bords (espace entre les rectangles rouge et bleu sur la figure 3a, pour faciliter un joint d'étanchéité. Vis le haut en place. Placer la chambre dans l'encart sur la plate-forme d'enregistrement.
13. Ajouter la solution de Ringer dans la chambre d'enregistrement en utilisant une pipette Pasteur.
14. Raccorder le tuyau d'écoulement de sortie de la bouteille sous pression contenant une solution antigel à la tubulure d'entrée du dispositif de refroidissement thermoélectrique. Connectez le output tube du dispositif de refroidissement thermoélectrique à l'extrémité d'entrée de la chemise de refroidissement externe et l'extrémité de sortie du réservoir de la figure 3b.
15. Placer un morceau de la moelle épinière à la fois dans la chambre d'enregistrement et séparer en douceur le maintien de la moelle épinière le long de la lamelle couvre-objet à tout moment à l'aide de pinces recouvertes de téflon sont isolés jusqu'à ce que les axones figure 2e et 2f figure.
16. Amener la température de la solution d'enregistrement à 10 ° C par passage de la pression (de l'azote gazeux est repoussé dans le flacon) solution antigel (par déplacement), par l'intermédiaire du dispositif de refroidissement thermoélectrique, à travers la chemise de refroidissement externe de la chambre d'enregistrement figure 3b.
17. Autoriser les axones de récupérer pendant 1 heure après la dissociation à 10 ° C.

Figure 2: Représentation schématique de protocole de dissociation pour l'isolation des axones réticulospinaux. (A) Retrait de la colonne dorsale. La flèche indique la direction de découpe du tissu. Les cornes dorsales sont marquées par l'alphabet D (couleur de police rouge), tandis que les cornes ventrales de l'alphabet V (couleur de police rouge). (B) la colonne dorsale enlevé dans la partie centrale de la moelle épinière exposer les axones réticulospinaux (lignes vertes ). Les cornes ventrales, qui restent intactes après le processus de découpage, sont marqués par l'alphabet V (couleur de police rouge). (C) de traitement de 45 min avec la protéase et de la collagénase enzymes de cocktail (1 mg / ml). (D) Le découpage des voies latérales de la moelle épinière; indiquant la position, la direction et l'ampleur de coupe latérale. (e) de dissociation mécanique de la moelle épinière. Les flèches indiquent la position de la pince et la direction de la force de séparation lors de la dissociation. (F) Representatiexemple de préparation de l'axone réticulo dissocié ve. Les flèches vertes marquent régions d'axones réticulospinaux très dissociés sans processus post-synaptiques.

Figure 3 Schéma de la chambre pour des expériences d'électrophysiologie de l'enregistrement. Dimensions fournies sont en pouces. Rectangle rouge montre la basepiece schéma (a) indique le positionnement de la lamelle dans la rainure de la lamelle dans la basepiece. La région entre le rectangle rouge et bleu, représenté sur le schéma de basepiece (a) est l'endroit où la graisse à vide élevé est appliqué. (B) représente la chambre d'enregistrement assemblée.

4. étiquetage et d'identification des terminaux présynaptiques avec FM 1-43

1. Étiqueter terminaisons présynaptiques, en incorporant FM 1-43 en vesicles pendant synaptique exo-endocytose en haute dépolarisation K +. Perfuser préparation avec 5 uM FM 1-43 (dans 5 ml de solution de Ringer contenant mM KCl 30).
2. Perfuser préparation avec 1 mg / ml Advasep-7 (dans 5 ml de solution de Ringer) pour éliminer le colorant FM excès) ^18.
3. Perfuser préparation avec la solution de Ringer pendant 15 min au lavage de colorant Remant et la Advasep.
4. Image avec 100 X lentille à immersion d'huile (NA 1,25) sur un microscope inversé à fluorescence, en conjonction avec une caméra CCD numérique et l'acquisition d'images microgestionnaire de logiciel, en utilisant des protocoles d'imagerie de fluorescence standard.
5. Identifier les terminaisons présynaptiques marquées par fluorescence à cibler pour l'enregistrement de la figure 4c et figure 4d.

5. immunohistochimie de isolés axones réticulo

1. Remplissez plat encadré (section Protocole 2.10.) Avec bivalent-ion (Ca2 ⁺ et Mg ^{2 +)} libreLa solution de Ringer.
2. Fabriquer pipettes de patch dans une micropipette extracteur P-87. Placer une petite quantité de suture de la colle à une extrémité de l'insert de poly-lysine à l'aide d'une pipette de patch (1,5 mm de verre de diamètre externe) et d'aspiration (en utilisant un tube de silicone 0,89 mm de diamètre intérieur avec une pointe de la micropipette fixé à l'extrémité d'aspiration).
3. Effectuer dissociations en utilisant la même procédure que mentionné dans la section du protocole 3 de la figure 2. Placez une extrémité de la moelle épinière sur la colle de suture et appuyez doucement avec une pince pour la faire adhérer fortement à la surface. Placer une goutte de colle suture à l'autre extrémité de l'insert et étirer doucement jusqu'à ce que la moelle épinière et les axones sont dissociés adhérer l'extrémité libre de la moelle épinière en le faisant glisser doucement sur la colle de suture. Fixer en place par un pressurage doux vers le bas avec la pince.
4. Bourse bivalent libérer la solution de Ringer avec la solution de Ringer régulière par perfusion.
5. Autoriser les axones de récupérer pendant 20 min après dissociation à 10 ° C.
6. Fixer les axones dissociés dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) {préparé dans le tampon phosphate salin (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na ₂ HPO ₄ 10, KH ₂ PO ₄ 1,8, pH 7,4)} pendant 20 min. Filtre PFA solution avant l'utilisation par passage à travers un filtre seringue de 0,2 uM.
7. Laver le PFA en perfusant 0,1 M de glycine (dans du PBS) pendant 10 min.
8. Incuber à 0,1% de Triton-X (dans du PBS) pendant 10 min.
9. Laver en perfusant du PBS pendant 20 min.
10. Bloc avec 5% de lait écrémé (dans du PBS) pendant 6 heures à 4 ° C.
11. Ajouter à anticorps primaire à CCAGV d'intérêt (dilution 1: 200 dans du PBS) et incuber pendant 20 heures à 4 ° C.
12. Laver en perfusant du PBS pendant 20 min.
13. Bloc avec 5% de lait écrémé (dans du PBS) pendant 10 min à 4 ° C.
14. Ajouter à un anticorps secondaire (1: 400 de dilution en PBS) et incuber dans l'obscurité pendant 2 heures à 4 ° C.
15. Laver par perfusion avec du PBS pendant 20 min.
16. Bloquer avec 1% de sérum bovin Albumin (dans du PBS) pendant 20 min.
17. Ajouter à Alexa Fluor 488 phalloïdine (5 unités / ul concentration de travail; mère préparée dans du méthanol 200 unités / ml).
18. Laver par perfusion avec du PBS pendant 20 min.
19. Image à l'aide 100X eau lentille à immersion sur microscope confocal.

6. électrophysiologique d'enregistrement

1. Fabriquer pipettes de patch en verre aluminosilicate (résistance à la pipette 2-5 MQ) dans un extracteur micropipette P-87. Conception pipette en patch de telle sorte que la pointe de pipette comprend diamètre de terminaison présynaptique entier.
2. PDMS patch manteau pipettes par trempage de la pipette de patch sous 50-60 psi de pression dans PDMS ²³ (joindre un tube en silicone, 0,89 mm de diamètre intérieur, relié à une bouteille de gaz d'azote, à l'extrémité arrière de la pipette de patch) et séchez-les avec une chaleur pistolet. Alternativement, manteau manuellement la pipette avec PDMS, l'application de revêtement à proximité de la pointe que possible, sous un microscope composé.
3. Feu pipettes de patch vernis à l'aide d'un microforge (un filament de platine sur mesure monté sur la scène d'un microscope composé).
4. Identifier les axones isolés montrant terminaisons présynaptiques marqués par microscopie de fluorescence.
5. Remplir solution d'enregistrement (conçu pour isoler des courants de ^{Ca2 +,} 10 mM de CaCl ₂ ou BaCl ₂ 90 mM en tant que porteur de charge, tampon HEPES pH 7,6, osmolarité de 270 mOsm) dans la pipette de patch à l'aide d'une seringue.
6. Insérez la pipette en patch dans le porte-pipette et position au-dessus de bain en utilisant un manipulateur MP225 motorisé. Abaissez doucement la pipette de patch dans le bain et la position contre la face d'un terminal présynaptique fluorescence identifié.
7. Avancer la pipette de patch lentement jusqu'à ce que le contact est établi avec la membrane. A ce stade, de réaliser un joint d'étanchéité par gigaohm douce bouche d'aspiration à travers un tube relié au support de pipette.
8. Pour atteindre les niveaux de bruit de fond extrêmement bas requises pour l'enregistrement monocanal Ca2 ⁺ courants, utiliser un Axopatch 200B avec un headstage refroidi pour les enregistrements. Les données d'échantillon à 20-50 kHz et le filtre à l'aide d'un filtre de Bessel 5 kHz. Effectuer l'acquisition de données en utilisant un Axograph X.
9. Utilisez un protocole étape standard, par incréments de 10 mV comme stimulus. Intégrer une pré-impulsion dans le protocole précédant le protocole de l'étape, pour assurer activation maximale des canaux ^de Ca. Intégrer une mV étape 10 de fuite dans le protocole de l'étape de post-analyse soustraction des courants de fuite.

Résultats

Ce protocole donne de dissociation sains et fonctionnels axones réticulospinaux isolés dépourvus de post-synaptique projections Figure 2f, mais qui conservent néanmoins des terminaisons présynaptiques fonctionnels capables de vésicule synaptique évoquée exo-endocytose et la figure 4c et figure 4d. Les articles des régions isolées des axones réticulospinaux peuvent être clairement identifiés en microscopie optique d'être clair, d'autres procé...

Discussion

Notre protocole de dissociation est importante en cédant axones réticulospinaux isolés dépourvus de post-synaptique projections Figure 2f, mais qui conservent néanmoins fonctionnelle présynaptique bornes Figure 4c et figure 4d. L'absence de processus post-synaptiques qui s'opposent à la terminaison présynaptique permet l'accès de l'enregistrement direct sur la membrane libération présynaptique visage dans les terminaux présynaptiques simples,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300,000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodies R-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Pressure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	14046230132
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon