Embolique Artère cérébrale moyenne occlusion (MCAO) pour AVC ischémique avec homologues caillots sanguins chez les rats

Résumé

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Résumé

Cliniquement, la thérapie thrombolytique avec l'utilisation de l'activateur du plasminogène tissulaire recombinant (tPA) reste le traitement le plus efficace pour l'AVC ischémique aigu. Cependant, l'utilisation de tPA est limitée par la fenêtre thérapeutique étroite et par un risque accru de transformation hémorragique. Il est urgent de développer des modèles de temps appropriés pour étudier de nouveaux agents thrombolytiques et des stratégies pour le traitement de l'AVC ischémique. À l'heure actuelle, deux grands types de modèles d'AVC ischémiques ont été développés chez les rats et les souris: intraluminale suture OACM et embolique OACM. Bien que les modèles MCAO via la technique de suture intraluminale ont été largement utilisés dans la recherche de la course mécanisme axé, ces modèles de suture n'imitent pas la situation clinique et ne sont pas adaptés pour les études thrombolytiques. Parmi ces modèles, le modèle OACM embolique imite étroitement AVC ischémique humaine et est adapté pour enquête préclinique d'un traitement thrombolytique. Ce modèle embolique été d'abord développé chez le rat par Overgaard et al. ¹ en 1992 et caractérisé en outre par Zhang et al., en 1997 ^2. Bien embolique OACM a gagné plus d'attention, il ya des problèmes techniques rencontrés par de nombreux laboratoires. Pour répondre aux besoins croissants en matière de recherche thrombolytique, nous présentons un modèle hautement reproductible de embolique OACM chez le rat, qui peut se développer un volume de l'infarctus prévisible dans le territoire de l'ACM. En bref, un tube de PE-50 modifié est doucement avancé à partir de l'artère carotide externe (ECA) dans la lumière de l'artère carotide interne (ICA) jusqu'à ce que la pointe du cathéter atteigne l'origine de la MCA. Par le cathéter, un seul caillot de sang homologue est placé à l'origine de la MCA. Pour déterminer le succès d'occlusion de la MCA, le débit sanguin cérébral régional a été contrôlée, des déficits neurologiques et des volumes d'infarctus ont été mesurées. Les techniques présentées dans le présent document devraient aider les chercheurs à surmonter les problèmes techniques pour la création de ce modèle pour la recherche de la course. </ P>

Introduction

L'AVC est la troisième cause de décès aux États-Unis, mais les options de traitement de l'AVC aigu reste limitée. À l'heure actuelle, l'injection intraveineuse de l'activateur du plasminogène tissulaire recombinant (tPA) à dissoudre les caillots de sang est le traitement le plus efficace pour un AVC ischémique aigu. Cependant, l'utilisation de tPA est limitée par la fenêtre thérapeutique étroite et par un risque accru d'hémorragie intracérébrale. Par conséquent, un modèle de course adapté à la recherche thrombolytique est urgent.

L'artère cérébrale moyenne (MCA) est l'artère occluse le plus souvent dans la course chez les humains. Axé sur cette artère, de nombreux modèles animaux d'AVC ischémique ont été mis en place. À l'heure actuelle, deux grands types de rongeurs focal modèles d'ischémie par occlusion MCA ont été développés: suture modèle OACM et embolique OACM modèle. Bien que les modèles MCAO via la technique de suture intraluminale ont été largement utilisés dans la recherche de la course mécanisme axé, ces modèles de suture ne le font pasaccident vasculaire cérébral humain imiter, car jusqu'à 80% des AVC sont causés par des droits de thrombose ou d'embolie. Cependant, le modèle de embolie utilisant des caillots de sang imite étroitement course humaine et est considéré comme approprié pour l'étude thrombolytique. Ce modèle embolique a été d'abord développé chez le rat par Overgaard et al. ¹ en 1992 et caractérisé en outre par Zhang et al., En 1997 ² et par Dinapoli et al., En 2006 ^3. Bien embolique OACM a attiré l'attention de plus en plus, il ya des problèmes techniques rencontrés par de nombreux laboratoires.

Dans cet article, nous démontrons une méthode standard pour la production embolique OACM avec des caillots de sang homologue chez le rat adulte, qui peuvent se développer un infarctus prévisible dans le territoire de l'ACM. Les techniques présentées dans cet article devraient aider les chercheurs à surmonter les problèmes techniques pour la création de ce modèle pour la recherche de la course.

Protocole

Déclaration éthique: adultes rats Sprague-Dawley mâles (pesant 330-380 g) ont été utilisés dans ce protocole. Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à la LSU Health Science Centre-Shreveport et est en conformité avec le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de (huitième édition, National Academy of Sciences, 2011 ).

1 Préparation de modification PE-50 Tube

1. Tenir un long tube PE-50 de 30 cm au-dessus d'un feu de gaz par les mains, adoucir progressivement le tube. Étirez délicatement le tube.
2. Sélectionnez un point sur ​​le tube étiré en utilisant un compas numérique (Figure 1), marquer et couper le PE-tube de 50 modifié en un segment de 25 cm avec une longue pointe de 1 cm (diamètre extérieur: 0,30 à 0,34 mm).

2 Préparation des homologues caillots sanguins

1. Anesthésier le rat avec de l'isoflurane (5% pour l'induction, l'entretien de 2-3%) dans 70% de N ₂ O et 30% O _{2 par un masque avant la collecte de sang. Confirmez l'anesthésie par une pincée de pointe.}
2. Effectuer fémorale cathétérisme artériel d'un rat des bailleurs de fonds avec la méthode publiée le ⁴ et le transfert de sang de l'artère fémorale directement dans un 20 cm de long PE-50 tube. Placer le tube pendant 2 heures à la température ambiante à un caillot de sang, puis conserver le tube pendant 22 heures à 4 ° C. Remarque: Le cathétérisme est réalisée en utilisant une technique aseptique, comme décrit dans l'étape 3.1. Le rat des bailleurs de fonds est récupérée pour d'autres échantillonnages.
3. Couper le tube PE-50 en 50 mm segments et débusquer le caillot du tube dans une boîte de Pétri stérile contenant une solution saline normale.
4. Transférer les 50 mm de long dans un caillot de 60 mm de long 10 PE-tube et connecter chaque extrémité de tube PE-10 à 20 cm de long PE-50 tube relié à une seringue ml contenant une solution saline normale avec aiguille 23 G (figure 2) .
5. Déplacer le caillot par mouvement alternatif continu d'une seringue à l'autre pendant 5 minutes, ce qui peut éliminer les cellules sanguines à partir dele caillot et de réduire la fragilité du caillot coagulé extravasculaire, sans perturber le noyau de fibrine.
6. Couper le caillot dans un long segment de 40 mm et de transférer le segment de caillot dans un PE-50 cathéter modifié comme décrit dans l'étape 1.2 dans des conditions aseptiques. Note: Tous les tubes de PE est stérilisé à l'oxyde d'éthylène.

3. embolique Artère cérébrale moyenne occlusion (figure 3A, B)

1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage (minimum 121 ° C, 15 PSI, pendant 15 min). Désinfectez la table d'opération et du matériel chirurgical associé en utilisant 70% d'éthanol.
2. Anesthésier le rat avec de l'isoflurane comme décrit dans l'étape 2.1. Testez la profondeur de l'anesthésie en effectuant une pincée de pointe sur les deux pieds arrière, et tout mouvement observé (retrait de la patte) indique que l'animal n'est pas suffisamment anesthésié à faire de la chirurgie. Appliquez une petite quantité de pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie. Raser la fourrure sur le col et la tête re ventralerégions avec une tondeuse électrique pour exposer les zones de la peau.
3. Placez le rat en position couchée sur un coussin chauffant. Insérer une sonde rectale, de contrôle et de maintenir la température du corps entre 36,5 à 37,5 ° C en utilisant une unité de commande de couverture homéotherme.
4. Désinfectez la peau rasée et fourrure de 10% povidone-iode, suivie par 70% d'éthanol.
5. Faire une incision médiane de 2 cm de long sur le col sous un microscope à dissection. Utilisez écarteurs pour exposer le champ opératoire et disséquer le droit commun artère carotide (CCA), l'artère carotide externe (CEA), l'artère carotide interne (ACI), et ptérygopalatine artère (PPA) gratuit de nerfs environnants et le fascia (figure 3A). Remarque: Avant la chirurgie, changer de gants stériles si aucun assistant aide à préparer l'animal.
6. Disséquer le CCA libre des nerfs environnants (sans nuire à l'nerf vague) et placer une suture de soie 5-0 stérile dans l'artère. Faire un nœud coulant (n ° 1) et de saisir le fil de suture à l'aide d'un petit hemostat et tirez enseigné vers le corps.
7. Disséquer le CEA et ses deux branches, l'artère occipitale (OA) et l'artère thyroïdienne supérieure (STA). Coaguler deux branches à l'aide d'une unité électrique de vétérinaire. Placez deux morceaux de stériles 6-0 sutures de soie sous la CEA.
8. Séparer les deux soies placées sous l'artère, une pièce de direction de la tête (extrémité distale) et l'autre vers le corps. Attachez une ligature serrée (n ° 2) sur le côté le plus proche de la tête, saisir la soie avec de petites pinces hémostatiques et tirer enseigné vers la tête. Préparer un noeud lâche (n ° 3) avec l'autre soie pour une utilisation ultérieure.
9. Disséquer la CIA et du PPA les nerfs environnants (sans nuire à l'nerf vagal). Attachez le PPA avec une suture 6-0 (# 4). Faire un nœud coulant avec 6-0 suture autour de l'ICA (n ° 5). Alternativement, couper le ICA à l'aide d'un clip microvasculaire.
10. Découpez un petit trou (moitié à travers) dans le CEA entre le serré (# 2) et en vrac (# 3) ligatures avec des ciseaux à ressort Vannas de style. Insérez le PE-50 modifié baignoiree contenant un caillot de sang dans l'incision et l'avance à la bifurcation de la CCA. Serrer la ligature lâche (n ° 3) autour de la lumière juste assez pour obtenir préserver la mobilité du tube à demeure.
11. Coupez le CEA sur le site de petit trou pour libérer le moignon et la position de la souche en dessous de la bifurcation de la CEA et de l'ICA; ce qui permettra le tube modifié glisser facilement dans l'ACI. Ouvrez la CIA et de faire avancer doucement le tube de la lumière de la CEA dans le ICA jusqu'à la pointe du cathéter atteint l'origine de la MCA (~ 17 mm de la bifurcation). Remarque: Avant d'insérer le bout de tube dans le CEA, stérile la surface extérieure du tube avec 70% d'éthanol, puis laver avec du sérum physiologique stérile.
12. Injecter le caillot à travers le cathéter PE-50 modifié avec 10 ul de solution saline plus de 10 secondes en utilisant une seringue Hamilton de 100 pi (figure 3B).
13. Retirer le cathéter de la CEA 5 minutes plus tard. Attachez le CEA et rouvrir CCA. Suturer l'incision dans le cou.

4. surveillance régionale du débit sanguin cérébral (DSCr)

1. Avant l'occlusion de la MCA, faire une longue incision de 1,2 cm de la ligne médiane dans le cuir chevelu afin d'exposer l'os du crâne. Retirez les tissus sur l'os du crâne avec un grattoir dentaire et les swaps de coton stérile. Remarque: Avant la chirurgie, la zone du cuir chevelu exposé et fourrure de sont désinfectés avec 10% de povidone-iode, suivie par 70% d'éthanol.
2. Percer un trou de diamètre de fraise de 1,5 mm située à 2 mm et 5 mm postérieur au bregma latérale en utilisant une fraise sphérique en acier inoxydable de 0,7 mm (figure 4).
   REMARQUE: Gardez la dure-mère intacte.
3. Placer la sonde de 0,5 mm au-dessus de la surface de la dure-mère. Surveiller le débit sanguin cérébral à 0 (niveau de référence), 5, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après l'embolisation et continuer à 5, 15, 30, 45, et 60 minutes après l'administration intraveineuse de tPA. Après la dernière mesure du débit sanguin cérébral, l'incision du cuir chevelu est fermée par suture. Remarque: Avant de cou incision nous mesurer DSCr comme base avant MCA Occlusion. Poster MCA occlusion nous mesurer DSCr après la fermeture de suture de l'incision du cou. Ainsi, l'incision du cou est maintenu stérile.

Soins 5. post-opératoire

1. Injecter 2,5 ml de solution saline sous-cutanée pour prévenir la déshydratation et injecter Buprenex (0,05 mg / kg, SC) immédiatement après la chirurgie et tous les 6-12 heures comme nécessaire pour soulager la douleur.
2. Arrêtez l'isoflurane. Placez le rat dans une chambre de récupération vétérinaire 37 ° C (garder au chaud des animaux) et de garder observation. Il faut généralement 10 min pour le rat de récupérer de l'anesthésie. Ensuite, mettre l'animal dans une cage stérilisé, placer un peu de nourriture mouillée dans une boîte de Petri dans la cage, et retourner la cage à la salle de stérilisation des animaux.
3. 24 heures après l'accident vasculaire cérébral, euthanasier le rat avec une overdose de pentobarbital de sodium (100 mg / kg de poids corporel, IP).

6. neurologique déficit Score

1. Effectuer le score Bederson avant et à 2 heures après l'embolisation. Utilisez un classement scale de 0-3 comme décrit précédemment ^5: 0, augmenter le rat par la queue, l'animal étendant les deux pattes avant sur ​​le sol et ne présentant pas d'autres déficits (mouvement normal); 1, portant le rat par la queue, fléchir la patte antérieure controlatérale; 2, diminution de la résistance à poussoir latéral (et des membres antérieurs flexion) sans indirecte; 3, le même comportement que de grade 2 avec des cercles.
   NOTE: Les rats montrant Bederson score = 0 (pas de déficit) à 2 h après l'embolisation sont exclus de l'étude.

Résultats

Laser Doppler (LDF) a été utilisé pour surveiller DSCr pendant l'induction de l'ischémie cérébrale ^6,7. Beaucoup de laboratoires, y compris notre laboratoire ont utilisé DSCr pour identifier les animaux avec succès occlusion MCA, mais les seuils de référence varient entre les laboratoires qui sont liés au site de mesure. La sonde de la LDF est positionné à 2 mm en arrière et latéralement par rapport à 5 mm du bregma, comme décrit précédemment ^6. DSCr a été contrôlée ?...

Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré un procédé standard pour exécuter un modèle d'AVC embolique MCAO chez le rat, dans lequel l'origine de la MCA est occluse par un caillot de fibrine riche. Le principal avantage de ce modèle est: l'occlusion de la tige de MCA avec un caillot de sang fibrine riche est semblable à un coup de thromboembolique chez les humains, le modèle de course embolique est apte à effectuer une enquête préclinique de la thérapie fibrinolytique, et que ce modèle peut se dév...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607