Acquisition de haute qualité vidéo numérique de<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportements larvaire et adulte à partir d&#39;un point de vue latéral

Résumé

Nous décrivons ici une technique simple et largement accessible microscopie à acquérir la vidéo numérique de haute qualité de la drosophile adulte et phénotypes mutants larvaires dans une perspective latérale.

Résumé

Drosophila melanogaster est un système de modèle expérimental puissant pour étudier la fonction du système nerveux. Les mutations génétiques qui provoquent un dysfonctionnement du système nerveux produisent souvent des larves viables et les adultes qui ont locomotion phénotypes défectueux qui sont difficiles à décrire de manière adéquate avec le texte ou représenter complètement avec une seule image photographique. Les formes actuelles de l'édition scientifique, cependant, soutiennent la présentation de supports vidéo numérique comme documentation supplémentaire pour accompagner un manuscrit. Nous décrivons ici une technique simple et largement accessible microscopie pour l'acquisition vidéo numérique de haute qualité des deux phénotypes larves et les adultes de Drosophila du point de vue latérale. Vidéo de la locomotion des larves et des adultes dans une vue de côté est avantageuse car elle permet l'observation et l'analyse des distinctions et de subtiles variations dans les comportements aberrants des locomotives. Nous avons utilisé avec succès la technique de visualiser et de quantifier aberrant rampant comportements en troisième stade larvaire, en plus de phénotypes mutants et les comportements des adultes, y compris le toilettage.

Introduction

Le fruit mouche Drosophila melanogaster commun est un système de modèle expérimental puissant pour étudier la fonction du système nerveux ^1-3. Conservation évolutive de la structure et la fonction du système nerveux chez les humains, ainsi que la facilité de la manipulation génétique et une vaste gamme d'outils génétiques chez la drosophile fait l'organisme de première pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines ^4. Les mutations génétiques qui provoquent un dysfonctionnement du système nerveux entraînent souvent des larves mutant viable et adultes de Drosophila avec une altération de la locomotion. Phénotypes observés dans le système nerveux mutants défectueux, notamment le taux de locomotion, coordination anormale, et les mouvements spasmodiques chez les adultes, ainsi que les déficits de la contraction péristaltique de la paroi musculature du corps, et une paralysie partielle des larves réduits. Ces phénotypes ont été exploités dans le développement à haut débit de cribles génétiques et des dosages de la locomotion des larves mutant ⁵, 6 et ^{7 à 10} adultes de Drosophila visant à quantifier l'altération de la locomotion et l'identification de gènes nécessaire pour la fonction du système nerveux. Bien que ces approches sont extrêmement utiles pour quantifier les comportements locomotive larves et les adultes, ils ne parviennent pas à transmettre des informations qualitatives sur chaque comportement aberrant spécifique. Par exemple, alors que la troisième stade larvaire mutant peut présenter des paramètres de locomotion modifiées dans un test de comportement, il peut être difficile de savoir si cela est le résultat des altérations de contractions péristaltiques rythmiques pendant le cycle de ramper, manque général de coordination, ou une paralysie partielle du corps postérieur musculature de la paroi. Nous décrivons ici une technique simple et largement accessible microscopie pour l'acquisition vidéo numérique de haute qualité de la drosophile adulte et phénotypes de locomotives larvaires dans une perspective latérale. Vidéo numérique acquise à partir d'un point de vue latérale permet l'observation directe et l'analyse des distinctions subtiles dans locomotivcomportements e d'une plus informative vue latérale orientation.

Protocole

1 Le système de Microscope stéréo

Remarque: Bien que ce protocole est facilement adaptable à n'importe quel système de microscope stéréo couplé à un appareil photo numérique avec la possibilité d'acquérir la vidéo, les détails sont fournis sur le système utilisé dans notre laboratoire (Table des Matières / Équipement).

1. Acquisition vidéo numérique en utilisant un microscope stéréoscopique trinoculaire couplé à un appareil photo numérique commercial.
2. Afin de coupler l'appareil photo numérique commerciale au port trinoculaire du microscope stéréo, retirez le ½x monture C du port de Phototube du microscope stéréo et le remplacer par un 1X C-mount.
3. Monter un coupleur d'appareil photo numérique (43 mm de fil) à la 1X C-mount.
4. Montez deux anneaux abaisseurs, 58 mm à 48 mm, et 48 mm à 43 mm, à l'attelage de la caméra pour combler la connexion du coupleur d'appareil photo numérique à un kit adaptateur d'objectif pour l'appareil photo numérique.
5. Monter l'appareil photo numérique le kit d'adaptateur de lentille.
6. Acquérir vidéo avec le grossissement du microscope et un zoom optique de l'ensemble de l'appareil photo numérique pour un grossissement combinée d'environ 12X (30 images par seconde, 640 x 480 pixels). Remarque: Le grossissement du microscope stéréo doit être rémunéré conformément à la 1X C-mount nouvellement reconfiguré du port trinoculaire.

2. imagerie Drosophila troisième stade larvaire

1. Ruban d'un marqueur permanent pour la plaque de platine noir d'un microscope stéréo couplé à un appareil photo numérique de sorte que le côté du capuchon de marqueur occupe environ ¼ à ⅓ du champ de vision vertical observé sur l'écran LCD de l'appareil. Utilisation des dessus de marqueurs comme l'étape d'effectuer une imagerie des larves car elles sont dans un assortiment de couleurs qui peut être utilisée pour le code de couleur et de différencier les génotypes des larves est imagé.
2. Délimiter le champ de vision observé sur l'écran LCD de l'appareil numérique sur la surface de la partie supérieure de marqueur à pointe finemarqueur.
3. Sélectionnez un troisième stade larvaire à l'image. Les critères de sélection des larves au troisième stade larvaire est la longueur du corps, l'émergence de la source d'alimentation au cours de la phase larvaire du cycle de vie, la présence de antérieures et postérieures stigmates, et la structure des crochets mandibulaires de l'appareil de la bouche ^11. S'assurer que la larve est propre en le lavant soigneusement à l'eau.
4. Illuminer l'étage de haut marqueur permanent d'en haut avec de la lumière à partir d'un système d'éclairage à fibres optiques. Ajustez l'angle de la lumière incidente pour fournir un éclairage optimal.
5. Concentrer le microscope sur le bord de la partie supérieure de marqueur permanent. Commencez acquisition vidéo numérique.
6. Placer la chenille sur le côté du capuchon de marqueur d'environ 75 ° par rapport à l'axe vertical, à l'extérieur du champ de vision, avec la partie antérieure de la larve, tournée vers le champ de vue (figure 1). Note: Placement de la larve sur le côté de la casquette de marqueur permet à la caméra d'enregistrer le mouvement de ee larve d'un point de vue latérale. Il aide à garder la larve humide avec de l'eau afin qu'ils ne tombent pas sur le côté de la casquette de marqueur. Il faut être prudent, cependant, de ne pas utiliser trop d'eau que des quantités excessives adhèrent à la larve comme il rampe sur le terrain.
7. Pousser doucement et pousser la larve d'un petit pinceau pour contraindre à ramper à travers le champ de vision. Soyez patient car les larves coopérer rarement et doivent souvent être revenu au point de départ de nombreuses fois avant qu'ils rampent directement dans le champ.
8. Fiche d'environ 10-15 minutes de séquences vidéo numériques sans interruption et culture et enlever toutes les séquences inutiles post-acquisition avec le logiciel de montage vidéo numérique.

3. Imaging adultes Drosophila

1. Placez une seule drosophile adulte dans un jetable de 1,5 ml spectroscopique polystyrène cuvette.
   Remarque: CO ₂ anesthésie de la drosophile adulte immédiatement avant un comporioral protocole d'analyse peut compromettre les résultats ^12. Il est recommandé que la drosophile adulte d'un délai de 24 heures pour se remettre de CO ₂ anesthésie avant d'effectuer un test de comportement ^13.
2. Branchez l'autre extrémité de la cuvette avec une petite boule de coton. S'assurer que la boule de coton est emballé assez serré pour occuper le grand espace de la PAC et confine à la volée dans le compartiment de réduction du volume de la cuve.
3. Placer la cuvette sur la plaque de platine blanc d'un microscope stéréo et aligner correctement le compartiment à volume réduit de la cuvette avec le champ de vision observé sur l'écran LCD de l'appareil numérique.
4. Éclairer la cuvette au-dessus de la lumière d'un système d'éclairage à fibres optiques. Ajustez l'angle de la lumière incidente pour fournir un éclairage optimal.
5. La mise au microscope et commencer à acquérir la vidéo numérique.
6. Fiche d'environ 30-45 min de séquences vidéo numériques sans interruption et cultures et retirez tous les inutilesimages post-acquisition avec le logiciel de montage vidéo numérique.

Résultats

Nous avons utilisé avec succès cette technique pour acquérir et quantifier le phénotype comportemental larvaire associée à la perte de fonction du gène de la stathmine (figure 2) ^14. Le gène code pour une protéine stathmine réglementaire microtubules qui partitionne la tubuline des pools de tubuline soluble, et se lie microtubules et favorise leur démontage ^15,16. Stathmin fonction est nécessaire pour maintenir l'intégrité des m...

Discussion

La force de Drosophila melanogaster comme un système modèle pour l'étude de la fonction du système nerveux provient en grande partie de la convergence des outils génétiques puissants disponibles et la large gamme de tests comportementaux robustes développé. Nous présentons ici une technique simple et largement accessible microscopie pour l'acquisition vidéo numérique de haute qualité de la drosophile adulte et phénotypes de locomotives larvaires dans une perspective latérale. Nous...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trinocular Stereozoom Microscope	Olympus Corporation	SZ6145TR	½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mount	Leeds Precision Instruments	LSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)	Qioptiq Imaging Solutions	25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10	LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital Camera	Canon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette	Denville Scientific	U8650-4