Préparation d'une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Résumé

Une préparation de culot bactérien rapide à partir d'une culture de sang positif peut être utilisé comme échantillon pour des applications telles que l'identification par MALDI-TOF, la coloration de Gram, les tests de sensibilité aux antibiotiques et le test basé sur la PCR. Les résultats peuvent être transmis rapidement aux cliniciens pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections du courant sanguin.

Résumé

Les bactériémies et septicémie sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Le succès des patients atteints de bactériémie dépend de l'identification rapide de l'agent infectieux pour guider le traitement antibiotique optimal. L'analyse de la coloration de Gram de la culture de sang positive peut être réalisée rapidement et déjà d'impact significatif sur le traitement antibiotique. Cependant, l'identification précise de l'agent infectieux est toujours nécessaire pour établir le traitement optimal ciblée. Nous présentons ici une préparation de culot bactérien simple et rapide à partir d'une hémoculture positive qui peut être utilisé comme un échantillon de plusieurs applications essentielles en aval telles que l'identification par MALDI-TOF MS, les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) par méthode de diffusion sur disque ou systèmes AST automatisés et par PCR automatisé à base de tests de diagnostic. La performance de ces systèmes d'identification et AST différentes appliquées directement sur les culots bactériens d'hémoculture est très similar à la performance s'obtient normalement à partir des colonies isolées cultivées sur des plaques d'agar-agar. Par rapport aux approches conventionnelles, l'acquisition rapide d'un culot bactérien réduit considérablement le temps de signaler la fois l'identification et AST. Ainsi, suite à sang positivité de la culture, de l'identification par MALDI-TOF peut être signalée en moins de 1 heure alors que les résultats d'AST par des systèmes AST automatisés ou des essais de diffusion de disque dans les 8 à 18 heures, respectivement. De même, les résultats d'un test rapide basé sur la PCR peuvent être communiqués aux cliniciens moins de 2 heures suivant le rapport d'une bactériémie. Ensemble, ces résultats démontrent que la préparation rapide d'un culot bactérien de la culture du sang a un impact significatif sur le temps d'identification et AST redressement et donc sur le succès de patients souffrant d'infections de la circulation sanguine.

Introduction

Les bactériémies et septicémie chez les patients hospitalisés sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Ainsi, la mortalité liée à la circulation sanguine infections est observée chez environ 14% à 37% des patients hospitalisés et peut augmenter de 35% en unités de soins intensifs des patients ^1-3. L'identification rapide de l'agent infectieux est essentiel pour guider le traitement optimal des antimicrobiens et à accroître le succès de la thérapie antimicrobienne ^4,5. L'analyse rapide de la coloration de Gram de hémoculture positive a déjà un impact significatif sur l'adaptation de la thérapie antimicrobienne ^6,7 mais l'identification précise de l'agent infectieux est nécessaire pour fournir le traitement antibiotique le mieux adapté aux patients. Par exemple, les différents régimes de traitement antibiotique doivent être mis en œuvre suivant une bactériémie avec les entérocoques et les streptocoques qui sont difficiles à distinguer par la coloration de Gram. De même, l'identification à l'espèce Level est nécessaire pour détecter les entérobactéries Gram négatif ampC codant pour un gène chromosomique qui confère une résistance accrue aux β-lactames ^8.

Avec une hémoculture positive, l'approche diagnostique classique consiste à repiquer l'agent infectieux sur différentes plaques d'agar, qui nécessite plusieurs heures d'incubation supplémentaire identification préalable avec diverses approches, y compris des tests biochimiques, la croissance sur différents milieux sélectifs et les systèmes d'identification microbienne automatisés. Le temps les résultats d'une approche diagnostique classique est d'environ 1 à 3 jours.

L'émergence de la technologie désorption laser assistée par matrice / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF) pour l'identification rapide des micro-organismes a fourni un nouvel outil pour identifier rapidement les micro-organismes de colonies cultivées sur des plaques d'agar-agar, mais aussi directement à partir de sang positif cultures (Figure 1) ^9-12. Thl'utilisation de l'e de MALDI-TOF d'identifier un agent infectieux à partir d'hémocultures a considérablement réduit le temps aux résultats de quelques minutes au lieu des heures et des jours requis par les méthodes traditionnelles. Comme on le verra par Croxatto et al. ^13, l'efficacité de l'identification MALDI-TOF repose sur différents paramètres, y compris la pureté et la quantité du micro-organisme. Ces deux critères sont facilement obtenus à partir des colonies distinctes cultivées sur des plaques d'agar mais nécessaire un traitement pré-analytique pour l'enrichissement bactérienne et purification à partir d'échantillons complexes tels que la culture de sang, qui contiennent plusieurs composants cellulaires et des protéines qui peuvent interférer avec identification MALDI-TOF.

Les méthodes d'isolement de divers micro-organismes de culture de sang ont été utilisés dans un certain nombre d'études, y compris la saponine ou une autre méthode de détergents doux pour l'extraction bactérienne ^9,14, méthode de séparation de sérum ^10, la lyse des méthodes de centrifugation ¹² et solutions commercialement tels que le kit de sepsityper. Notre laboratoire de diagnostic bactériologique a mis au point un sang-culture simple préparation de culot bactérien à base de chlorure d'ammonium érythrocytes-lyse qui permettent une identification rapide de bactéries et de levures par MALDI-TOF et des systèmes d'identification automatisés (figure 2) ^15. Cette préparation de pastilles hémoculture également fournir un échantillon pour d'autres applications directes en aval tels que la coloration de Gram, tests de diagnostic basés sur la PCR automatisées telles que POCT-PCR pour la détection rapide de résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM) et les tests de sensibilité aux antibiotiques des Les systèmes automatisés d'AST et / ou par des essais de diffusion de disque sur plaques d'agar-agar (figure 3).

Dans ce travail, nous décrivons les différentes étapes de la préparation du culot bactérien sang-culture, comme expliqué par Prod'hom et al. ¹⁵ (figure 4). Nous allons également déscribe les protocoles pour trois des principales applications qui peuvent être exécutées sur le culot de la culture de sang: Identification par MALDI-TOF ^15, l'identification (ID) et les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) avec les systèmes automatisés ¹⁶ pour les entérobactéries et les staphylocoques et PCR automatisé test diagnostique pour la détection du SARM ^17.

Protocole

Ce protocole a été développé et validé en suivant les processus de recherche et développement et les règles éthiques de notre institution avant d'être mis en œuvre comme un outil de routine.

1 Préparation d'une culture bactérienne du sang Pellet par ammonium procédure chlorure érythrocytes-lyse

1. Préparation d'une hémoculture positive pour la centrifugation ultérieure.
   1. Stériliser le bouchon de culture de sang. Ajouter 70% d'éthanol sur le bouchon de la bouteille et de le brûler.
      NOTE: Ne pas effectuer cette étape sous une hotte à flux laminaire.
   2. Déplacer la bouteille à une hotte à flux laminaire. Recueillir 5 ml de la culture de sang avec une seringue de 20 G.
   3. Ajouter 5 ml de la culture de sang dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 45 ml d'eau stérile (H ₂ O) et de mélanger l'échantillon.
2. Préparation d'une culture de sang par lyse culot bactérien centrifugation.
   1. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min à température ambiante.
   2. Remove du surnageant (qui contient principalement du H ₂ O et de cellules sanguines) avec une pompe à vide de laboratoire.
   3. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de chlorure d'ammonium artisanale solution (0,15 M de NH ₄ Cl, 1 mM KHCO ₃₎ de lyse. Décomposer le culot par grattage et au vortex et centrifuger le tube de l'échantillon à 140 xg pendant 10 min à température ambiante.
   4. Jeter le surnageant qui contient principalement les globules rouges débris.
      1. Si la pastille est restée hémorragique, remettre en suspension le culot dans 2 ml d'eau stérile distillée et ₂ 0 en outre à lyser les globules rouges résiduels et laver le culot. Centrifuger l'échantillon à 140 g pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
   5. Remettre en suspension le culot dans 200 pl de H ₂ O
3. Subculture de culture de sang sur divers milieux de gélose sélective et non sélective.
   1. Prélever 1 ml de la culture de sang avec une seringue de 20 G.
   2. Inoculer une goutte de culture de sang into quatre quadrants sur gélose au sang, une gélose au chocolat, de l'agar agar et Schaedler McConkey.
   3. Incuber à 37 ° C, la gélose au sang et des plaques d'agar au chocolat dans une atmosphère _de CO2 à 5%, la gélose de McConkey dans une atmosphère normale, et la plaque de gélose Schaedler dans des conditions anaérobies.
   4. Suivez la croissance bactérienne sur les différents médias.
   5. Vérifier la pureté bactérienne.

2 Identification par MALDI-TOF MS

1. L'identification directe à partir du culot de sang.
   1. Transfert 1 pl de la pastille de sang sur une plaque cible MALDI et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C.
   2. Superposer l'échantillon avec de l'acide formique 1 ul de 70% et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C.
   3. Superposer l'échantillon avec 1 pl de matrice MALDI et laisser sécher sur une plate-forme C 42 ° chauffage (solution de α-cyano-4-hydroxycinnamique dans 50% d'acétonitrile-2.5% d'acide trifluoroacétique saturé).
   4. Passez à la MALDI-TOF MS avec un système MALDI-TOF MS comme décrit par les fabricants.
   5. Si le score d'identification est valide au niveau de l'espèce (par exemple, avec un score <2), effectuer une extraction de protéines de l'échantillon de granulés dans le sang.
2. Identification de la protéine après extraction du culot de la culture de sang.
   1. Mélanger 20 ul de la pastille avec 1 ml d'éthanol à 70% et centrifugation à 13 000 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
   2. Jeter le surnageant et ajouter 25 ul d'acide formique à 70% et 25 ul de 100% d'acétonitrile à la pastille. Vortex vigoureusement pour remettre en suspension les culots. Remettre en suspension granulés difficiles en les décomposant avec des embouts de pipette avant vortex.
   3. Centrifuger à 13 000 g pendant 2 min à température ambiante. Transfert 1 pi du surnageant (qui contiennent des protéines extraites) sur une plaque cible MALDI et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C. Procédez comme décrit dans le paragraphe 2.1.2.

3. bactérienne Identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques avec un système automatisé microbienne

1. Préparation d'une suspension bactérienne d'identification bactérienne et AST avec un système automatisé microbienne.
   1. Préparer un tube en matière plastique contenant 3 ml de solution stérile de NaCl à 0,45% compatible avec le système automatisé microbienne.
   2. Ajouter une quantité suffisante de la culture de culot de sang dans la solution de NaCl à 0,45% pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8. Mesure de la turbidité en utilisant un appareil à densitomètre.
      NOTE: Le volume du culot bactérien de la culture de sang varie de 50 à 200 pl pour obtenir une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8.
2. Inoculer les bactéries Gram-positif (GP) ou Gram-négatif (GN) cartes automatisés d'identification et les cartes AST automatisés pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens des Cocci Gram-positives et Gram-négatives bactéries comme décrit par le fabricant.
   REMARQUE: identification avec GP ou cartes GN n'est pas appliquée si MALDI-TOF MS valeur du score d'identification est> 2. Vérifier la pureté de la suspension bactérienne par repiquage la suspension bactérienne sur gélose au sang (GP et GN) et la gélose Mac Conkey (GN) plaques.

4 essais de sensibilité aux antibiotiques par disque Diffusion Assay

Le test de diffusion sur disque est décrit par le Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST, Version 3.0, Avril 2013, www.eucast.org).

1. Préparation d'une suspension bactérienne à effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens par un essai de diffusion de disques.
   1. Préparer un tube en verre contenant 3 ml de solution stérile de NaCl à 0,9%.
   2. Ajouter une quantité suffisante de la culture de culot de sang dans la solution de NaCl à 0,9% pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité de 0,5 McFarland. Mesure de la turbidité en utilisant un appareil à densitomètre.
      REMARQUE: Le volume de la culture de sangculot bactérien varie de 50 à 200 pl pour obtenir une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8.
   3. Vortex la suspension bactérienne.
2. L'inoculation de la suspension bactérienne sur de la gélose de Mueller-Hinton (MH) ou Mueller-Hinton agar agar organismes-fastidieuse (MHF) (MH supplémenté avec 5% de sang de cheval défibriné et 20 mg / L de β-nicotinamide adénine dinucléotide).
   1. Trempez un coton-tige stérile dans la suspension bactérienne et retirez délicatement l'excès de liquide en tournant la tige sur la paroi interne du tube de verre.
   2. Etaler la suspension bactérienne de façon égale sur toute la surface de la plaque de gélose MH / MHF par écouvillonnage ou dans trois directions à l'aide d'un rotateur de plaque automatisé.
3. Application des disques antimicrobiens sur des plaques de gélose ensemencées.
   1. Appliquer près les disques sur la surface des plaques de gélose ensemencées séchées manuellement ou à l'aide d'un distributeur de sensibilité sur disque.
   2. Incuber la plaque à la tempe appropriérature et de l'atmosphère, comme décrit dans la méthode de diffusion EUCAST disque de test de sensibilité aux antimicrobiens (Version 3.0, Avril 2013, www.eucast.org).

5. automatisé PCR à base de test de diagnostic pour la détection de SARM

1. Utilisation d'une micro-pipette, transférer 50 pi de la pastille de culture de sang dans le flacon de réactif d'échantillon fourni avec le kit SARM automatisé de test de diagnostic basé sur la PCR et vortex pendant 20 s.
2. L'utilisation d'une micropipette de 1 ml, distribuer l'échantillon dans l'orifice d'échantillon de la cartouche. Insérez la cartouche dans le système PCR automatisé et commencer le dosage comme décrit par le fabricant.

Résultats

Dans l'étude effectuée par Prod'hom et al. ^15, culots bactériens obtenus par lyse de chlorure d'ammonium centrifugation de 122 hémoculture positive à partir de 78 patients ont été analysés par MALDI-TOF MS. Sur 122 hémoculture positive, 95 (77,9%) ont été correctement identifiés au niveau de l'espèce et un (0,8%) au niveau du genre. Les 26 (21,3%) des pastilles d'hémoculture restants n'ont donné aucune identification fiable par MALDI-TOF. Parmi ceux-ci, 21 sont ...

Discussion

Par rapport aux approches diagnostiques d'hémoculture positifs classiques, l'acquisition rapide d'un culot bactérien en utilisant le chlorure lyse approche de centrifugation d'ammonium réduire le temps de signaler l'identification de 16 à 24 heures et le temps de signaler AST de 24 à 48 h (figures 1 et 3).

Introduction rapide d'une antibiothérapie appropriée est essentielle pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G needle	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar