Mesure de l'anaphylaxie locaux chez la souris

Résumé

Les réponses allergiques, caractérisé par l'activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d'IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d'Evans pour suivre l'évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique.

Résumé

Les réactions allergiques sont le résultat de l'activation des mastocytes et les basophiles, et la libération subséquente de médiateurs pro-inflammatoires et vasoactifs. L'exposition à un allergène chez un individu sensibilisé peut entraîner des symptômes cliniques qui varient de l'érythème mineur à la vie en danger anaphylaxie. Au laboratoire, différents modèles animaux ont été mis au point pour comprendre les mécanismes d'entraînement des réactions allergiques. Nous décrivons ici un procédé détaillé destiné à mesurer les changements dans la perméabilité vasculaire de quantifier les réponses allergiques localisées. Le dosage de l'anaphylaxie locale a été signalée pour la première dans les années 1920, et a été adapté à partir de la technique publié par Kojima et al. en 2007 ^1. Dans cet essai, des souris sensibilisées à l'OVA sont contestées dans l'oreille gauche avec le véhicule et dans l'oreille droite avec l'OVA. Ceci est suivi par une injection intraveineuse de colorant bleu d'Evans. Dix minutes après l'injection de bleu d'Evans, l'animal est euthanasie et le colorant qui s'est épanché danspour les oreilles est extraite pendant une nuit dans du formamide. L'absorbance du colorant extraite est ensuite quantifiée avec un spectrophotomètre. Cette méthode permet de manière fiable une manifestation visuelle et quantifiée d'une réaction allergique locale.

Introduction

Je hypersensibilité de type est médiée par l'antigène induit la reticulation de l'IgE à la surface des mastocytes et des basophiles. Cela se traduit par une dégranulation cellulaire et la libération de médiateurs vasoactifs et pro-inflammatoires telles que l'histamine, la tryptase, et le facteur d'activation des plaquettes ^2. Après la libération de médiateurs préformés pendant la dégranulation, les mastocytes synthétisent et libèrent des prostaglandines et leucotriènes, qui augmentent encore la perméabilité vasculaire ^3. La réponse clinique initiale se produit rapidement et est appelé une "réaction immédiate". Dans la peau, une réponse papule et érythème est facilement visible à quelques minutes de provocation par l'antigène. En fonction de la dose de la difficulté, il est possible d'observer une "réaction en phase tardive" quelques heures plus tard. Fin gonflement de phase est due à un œdème localisé et le recrutement des leucocytes dans les tissus ^2. L'histamine, généralement considéré comme le principal médiateur de participer àréactions allergiques immédiates, agit sur des récepteurs de l'histamine 1 (HR1) exprimé sur les navires et les récepteurs de l'histamine 2 (HR2) exprimé sur le muscle lisse. L'effet combiné augmente le flux sanguin et de la perméabilité vasculaire au niveau du site d'inflammation ^4.

Une variété de modèles animaux d'allergie ont été développées pour étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation allergique, y compris des modèles d'asthme allergique, l'anaphylaxie systémique, et l'anaphylaxie locale. Administration intraveineuse de colorant a été utilisé pour mesurer les réactions allergiques localisées dans des modèles animaux pour près d'un siècle, avec des publications décrivant cette technique datant des années 1920 ^5. Les lapins et les cochons d'Inde ont été les premiers modèles animaux utilisés pour tester les réactions d'hypersensibilité immédiate, et les réponses les plus sensibles ont été généralement dans l'oreille ^5,6. Le test a été validé plus tard pour une utilisation chez les rats et les souris ^{7 8.}

Historiquement,une variété de méthodes expérimentales ont été utilisées, notamment par injection de l'antigène avant l'injection du colorant, du colorant injection avant l'injection de l'antigène, et l'injection simultanée de l'antigène et de colorant. Administration par voie intraveineuse de colorant comme un moyen pour mesurer les réponses allergiques est un dosage polyvalent car il peut être utilisé pour mesurer active, passive, et inverser les réactions passives ^5,9. De nombreux colorants ont été utilisés pour évaluer les réactions allergiques, y compris Bleu Trypan, Pontamine Blue Sky, Evans Bleu, Bleu Geigy 536, et l'encre de Chine ^5,6,9. Une solution de 0,5% de bleu d'Evans est actuellement le colorant de référence utilisé pour mesurer les réponses allergiques de la peau.

La réponse anaphylactique défi est transitoire; l'intensité maximum est atteint dans les 10 - 15 min après l'injection de colorant, et aucune réaction visible si colorant est administrée plus de 30 minutes après la provocation, quelle que soit l'espèce animale utilisées ^9. La quantification de l'extravasation de colorant d'origine étaitment obtenue par la mesure de la taille papule, comme indiqué par le colorant bleu ^9.7. En outre, les chiffres de mastocytes dégranulés peuvent être quantifiés par l'excision de tissus de la peau sur le site de la réaction et coloration au bleu de toluidine ^7. Dégranulation des mastocytes est souvent utilisé comme un marqueur pour cutanée, des réactions allergiques médiées par les IgE, comme les mastocytes sont la principale population de cellules exprimant locale de haute affinité des IgE récepteur FceRI. Techniques spectrophotométriques pour mesurer colorant extravasation dans les tissus ont été développés pour l'anaphylaxie cutanée passive (PCA) chez le rat et la souris ^{10 11} dans les années 1990.

Le protocole de test de l'anaphylaxie locale suivant a été adapté à partir de Kojima et al. ^1, et utilise l'ovalbumine d'oeuf de poulet (OVA) comme antigène pour induire des réponses allergiques. Cependant, les antigènes autres que l'OVA peuvent être utilisés si on le souhaite. Le test utilise ensuite colorant bleu Evans à surveiller les changements dans permeabilit vasculairey qui se produisent en raison de mastocytes IgE réticulation et la libération d'histamine.

Protocole

1. souris Sensibiliser

1. Préparer une solution stock OVA par dilution de l'OVA en 1x PBS à une concentration finale de 20 mg / ml. Congeler bas aliquotes dans des cryotubes et conserver à -80 ° C pour une utilisation future.
2. Apportez un ou plusieurs aliquotes de 20 mg / ml OVA actions à la température ambiante. Diluer OVA dans du PBS 1x à une concentration finale de 1 mg / ml dans un tube en polystyrène de 5 ml à fond rond avec un capuchon. Vortex brièvement pour mélanger.
3. Tout en maintenant le tube en polystyrène contenant 1 mg / ml OVA sur un vortex réglé à vitesse moyenne, ajouter un volume égal de bien homogénéisé Imject alun (40 mg / ml) goutte à goutte tout en continuant à vortex le tube pour produire un rapport de 1: 1 de L'alun de immunogène.
4. Placez bouchon sur le tube et la bande tube vortex. Tournez vortex sur le réglage le plus bas et permet OVA pour adsorber Alum pendant 30 min.
   1. Ne laissez pas une grande quantité de temps à passer entre la préparation OVA / alun et la sensibilisation des souris. Si la sensibilisation ne peut être effectuée directement après OVA / Alum preparation, magasin OVA / Alum à la température ambiante. Vortex pour 1 min avant de l'utiliser.
5. Charger un 1 ml seringue à insuline avec le mélange OVA / Alum. Boucher la seringue avec une aiguille de calibre 27.
6. Injecter 100 ul de OVA / alun dans le péritoine de souris BALB / c à une dose de 50 par souris pg d'OVA et 2 mg d'alun.
7. Pour un témoin négatif, sensibiliser un autre groupe de souris à PBS. Préparer un mélange 1: 1 de PBS et alun de la même manière que ci-dessus, en omettant l'OVA.
8. Sensibiliser toutes les souris (OVA et PBS contrôle) une fois par semaine pendant 3 semaines pour un total de 3 injections. Après injection final, attendre au moins 2 semaines avant l'analyse de l'anaphylaxie locale.

2. local anaphylaxie Assay

1. Apportez OVA solution stock à la température ambiante. Dans un tube de 1,5 ml, diluer 20 mg / ml OVA actions à une concentration finale de 5 mg / ml avec du PBS (dilution 1: 4 d'OVA dans du PBS 1X). Vortex brièvement pour mélanger.
2. Anesthésier la souris en utilisant RC ^{2 <}/ Sup> Système d'anesthésie rongeurs (ou système comparable de livraison vaporisé). Remplir le réservoir avec de l'isoflurane, et tourner sur O ₂ flux d'air. La place la souris dans la chambre induction et ajuster molette de commande isoflurane à 5% pour initier une anesthésie. Une fois les souris sont entièrement anesthésié, indiqué par manque de mobilité, ajuster molette de commande isoflurane à 3% pour maintenir l'anesthésie profonde. Le but de l'anesthésie dans cette procédure consiste à immobiliser l'animal. Les injections oreille et la queue veines ne causent pas de douleur importante ou une détresse à l'animal.
   NOTE: L'isoflurane peut avoir des effets négatifs sur le système reproductif humain. Veillez à utiliser dans une pièce bien aérée et joindre une cartouche de balayage de la chambre d'induction pour neutraliser le gaz des déchets. Si vous êtes enceinte pendant l'utilisation de l'isoflurane, porter un masque de filtre de carbone pour minimiser l'exposition.
3. Charge: 10 ul de 5 mg / ml d'OVA dans une seringue à insuline de 10.3 cc coiffé avec une aiguille 31 G. Charger une autre seringue à insuline 3/10 cc avec 10 ulde 1 x PBS.
4. En utilisant un microscope à dissection, injecter 10 pi de OVA dans l'oreille droite d'une souris anesthésiée pour une dose de 50 mg d'OVA de défi. D'autres doses, par exemple 20 ug, sont également acceptables.
   1. Pour stabiliser l'oreille pour injection, enrouler la bande de scotch (côté collant de haut) autour d'un tube de 15 ml conique. Fixer la face dorsale de l'oreille droite de la bande. Insérez le côté aiguille conique entre les deux feuilles de l'oreille. Injecter lentement OVA dans le centre du tissu de l'oreille, en prenant soin de ne pas frapper des vaisseaux sanguins.
5. En utilisant la même méthode décrite ci-dessus, l'injection de 10 ul de PBS dans l'oreille gauche comme témoin négatif.
6. Attendre 3 min.
   1. Pendant ce temps, placer la souris dans un dispositif de retenue et tenir la queue sous une lampe chauffante ou dans un bain d'eau chaude pendant 1 min à dilater les vaisseaux sanguins.
7. En utilisant une seringue de 1 ml d'insuline coiffé d'une aiguille 27 G, injecter lentement 200 pi de 0,5% colorant bleu Evans dans la queue vein de la souris. Une injection rapide peut détruire la structure du bateau avant tout le 200 pi est administré. Dans ce cas, la tentative d'injecter le volume restant de colorant dans la veine du côté opposé de la queue.
8. Attendez 10 min.
9. Euthanasier la souris et enlever les deux oreilles à l'aide de pinces et de ciseaux chirurgicaux.
   1. Saisir les bords de l'oreille avec une pince, en prenant soin qu'aucune pression n'est appliquée au site d'injection au centre de l'oreille. Eliminer le plus tissu de l'oreille que possible en coupant tout près de, mais pas à travers, la crête du cartilage présent à la base de l'oreille. De petites quantités de poils peuvent être présents sur l'oreille excisé; cela n'affecte pas le dosage.
10. Aliquote de 700 pi de formamide dans 1,5 ml microtubes. Préparer un tube par l'oreille (deux tubes par la souris).
    REMARQUE: Le formamide est tératogène, mutagène, et un irritant. Porter des gants, des lunettes de protection et un masque de protection. Les femmes enceintes devraient faire preuve de prudence lors de la manipulation d'uns formamide peut être foetotoxique.
11. Ajouter oreilles au formamide, boucher les tubes, et incuber pendant la nuit dans un bain de chaleur sèche réglé sur 63 ° C. Oreilles peuvent encore être légèrement bleu après incubation; Toutefois, la majorité de la teinture est extrait dans le formamide.
12. Ajouter 300 ul de chaque échantillon en double exemplaire, à une plaque à 96 puits. Éviter de transférer fourrure si elle est présente dans l'échantillon. S'assurer qu'il n'y a pas de bulles présentes dans les puits, car ils influeront sur la lecture de l'absorbance.
13. Ajouter 300 ul de formamide, en double exemplaire, à la plaque de 96 puits. Ces puits seront utilisés comme des blancs.
14. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l'absorbance à 620 nm. Soustraire les puits de formamide de chaque lecture de l'échantillon.
    NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Université services en uniforme.

Résultats

Les animaux qui ont subi le test avec succès auront la peau et les yeux qui apparaissent en bleu. PBS animaux sensibilisés ne doivent pas réagir à PBS ou le défi de l'OVA, donc les deux oreilles doivent rester blanc (figure 1A). Chez les animaux sensibilisés OVA, l'oreille recevoir le défi PBS (à gauche) doit être soit complètement blanc ou légèrement bleu de façon localisée au niveau du site d'injection. L'oreille recevoir le défi OVA (à droite) devrait devenir progressi...

Discussion

De nombreux marqueurs de la maladie allergique sont utilisés pour évaluer la force des réactions allergiques suivantes provocation allergénique, y compris les changements dans les niveaux d'histamine circulation, production de cytokines Th2, et le recrutement de cellules dans le liquide broncho dans le cadre de défi des voies respiratoires. Tout en surveillant les changements de ces paramètres est important pour l'étude des réactions allergiques, des marqueurs biologiques ne correspondent pas toujours à...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform