Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Résumé

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Résumé

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Introduction

La maladie cardiaque demeure la principale cause dans le monde d'aujourd'hui et les taux de mortalité sont restés pratiquement inchangés dans les deux dernières décennies (American Heart Association). Il ya un besoin critique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou inverser insuffisance cardiaque efficace. Une stratégie prometteuse est la thérapie à base de cellules suivant le développement rapide de cellules souches en biologie ^1. À cet égard, les CPC multipotentes peuvent être une excellente source de cellules pour la thérapie en raison de leur capacité à proliférer mais seulement engagé à la différenciation de la lignée cardiaque. Par conséquent, la méthode efficace et robuste pour générer et isoler CPC est d'une grande importance pour les études de thérapie cellulaire cardiaque.

Ce protocole met l'accent sur CPC embryonnaires identifiés lors de l'embryogenèse précoce et comment leur génération à partir de CES. Divers CPC ont été isolés à partir des cœurs embryonnaires et adultes, même à partir de moelle osseuse ^2. Au cours du développement de l'embryon, morphoge osseuseprotéines tromagnétiques (MPG), les membres de type ailes famille du site d'intégration de MMTV (Wnt) et des signaux nodales induisent l'engagement de la Mesp1 ⁺ mésoderme multipotentes ^3. Mesp1 ⁺ cellules se différencient ensuite dans les CPC, ⁴ embryonnaires. Ces CPC sont généralement marquées par HCN4, NK2 homeobox 5 (NKX2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), et facteur de myocytes activateur 2C (MEF2C), forment champs cardiaques primaires et secondaires, et contribuer à les principales parties du coeur pendant cardiogenèse ^5-10. Les deux NKX2-5 CPC ⁺ et Isl1 ⁺ / ⁺ MEF2C sont capables de se différencier en cardiomyocytes, des cellules musculaires lisses (SMC), et les cellules endotheliales ^8.5. Ainsi ces CPC donnera lieu à vasculaire cardiaque ainsi que les tissus cardiaques et sont une source de cellules idéal pour la thérapie cardiaque à base de cellules. Par conséquent, générer CPC in vitro a été une préoccupation majeure de la recherche dans les études cardiovasculaires. Depuis CES ont une expansion illimitée capacitése représentent les cellules de la MCI au stade de blastocyste, la différenciation des CES dans la suite de la CPC embryonnaires embryogenèse naturel est considéré comme une approche logique et efficace pour obtenir CPC.

Une approche largement appliquée pour obtenir CPC de CES est d'agréger les CES dans EB ^11. Pour améliorer l'efficacité de différenciation, les facteurs chimiques et de croissance définis sur la base de la connaissance du développement cardiaque ont été utilisés ^12-14. Cependant, il n'y a pas de marqueurs CPC définitives, en particulier pas de marqueurs de surface cellulaire, qui sont largement acceptées dans le domaine. Pour résoudre ce problème, les CES sont conçus pour marquer Isl1 ⁺ ou MEF2C CPC ⁺ et leurs dérivés avec les journalistes fluorescents à l'aide système Cre / loxP. La recombinase Cre est frappé dans le cadre du contrôle de Isl1 / MEF2C promoteur / amplificateur. DP modification de la protéine fluorescente ou un gène YFP entraînée par un promoteur constitutif peuvent être activés par excision de l'arrêt de flox codon par la recombinase Cre(ISL1: CRE; pCAG-flox-STOP-flox-GFP ou DP / Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Une fois que les CES sont différenciées en seconde CPC sur le terrain de coeur, Isl1 / MEF2C promoteur / amplificateur cre entraîné va activer les journalistes fluorescentes et les CPC peut être enrichi par FACS-purification. En bref, la méthode d'agrégation EB est utilisé pour initier la différenciation ESC. Pour améliorer l'efficacité de différenciation, les cellules différenciées sont traitées avec de l'acide ascorbique (AA) et des facteurs de croissance tels que Bmp4, activine A et le VEGF ^13,15. Ce protocole permet la différenciation PCC robuste et efficace en utilisant la souris et le CES de l'homme.

Protocole

1. Dérivation de souris embryonnaires CPC de Mouse CES

1. Préparer fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) couche nourricière.
   1. MEF milieu chaud (10% de FBS dans du DMEM) à 37 ° C.
   2. Préparer des plaques revêtues de gélatine.
      1. Ajouter 1 ml de 0,1% de gélatine dans de l'eau dans un puits d'une plaque à 6 puits ou 5 ml dans une boîte de 10 cm.
      2. Laisser les assiettes ou de plats à 37 ° C ou la température ambiante pendant au moins 30 min. Aspirer la gélatine avant de l'utiliser.
   3. Décongeler rapidement MEF irradiée dans un bain d'eau à 37 ° C, sous agitation douce.
   4. Transférer les cellules doucement pour un tube conique de 15 ml ou 50 ml. Ajouter 5 ml de milieu MEF préchauffé. Agiter les cellules lentement et centrifuger à 200 g pendant 5 min.
   5. Reprendre les cellules dans un milieu MEF et compter les cellules viables. Utiliser les volumes suivants de milieu MEF: 2 ml de cellules par puits d'une plaque à 6 puits et 10 ml pour les cellules à partir d'un plat de 10 cm.
   6. cellules de la plaque dans des plaques à 6 puits ou dans des boîtes de 10 cm 2/1x 10 ⁶ par plaque / plat.
   7. Incuber les plaques MEF / plats à 37 ° C, 5% de CO ₂ au moins 24 heures avant de les utiliser.
      NOTE: Jeter MEF assiettes / plats âgés d'une semaine.
2. Préparer CES de souris
   1. Culture du Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP souris CES sur MEF jusqu'à 90% de confluence. Un milieu de cellules ES Utilisation composé de 410 ml de DMEM, 75 ml de FBS, 0,1 mM de MEM NEAA, 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM de pyruvate, 100 UI Pen / Strep, et 0,1 mM de β-mercaptoéthanol.
   2. Préparer gélatine revêtu des plaques à 6 puits comme décrit au point 1.1.2.
   3. milieu de Aspirer à partir de plaques et rincer les cellules avec du DPBS.
      1. Aspirer DPBS et ajouter 0,4 ml 0,25% de trypsine dans un puits de la plaque de 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 5 min. Ajouter 1 ml de milieu ES préchauffé à cesser réaction trypsine.
   4. Récolte des cellules et des cellules de centrifugation à 200 xg et aspirer moyenne. Resuspendre les cellules dans 1 ml milieu ES cellulaire et compter les cellules.
   5. CES en plaques sur des plaques revêtues de gélatine à une densité de 3 x 10 ⁴ / cm ^2. Incuber à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant environ 2 jours où CES atteignent environ 90% de confluence. Changer le support de tous les jours.
   6. Lorsque CES sont 90% de confluence, répétez les étapes 1.2.2-1.2.5 pour supprimer complètement les mangeoires MEF.
3. Induire la différenciation PCC par la formation EB
   1. Préparer un milieu de différenciation comme suit: 36 ml d'IMDM, 12 ml F12 de Ham, 2 mM de L-glutamine, 0,34 ml de BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 pg / ml de AA, et 0,45 mM de 1-thioglycérol.
   2. milieu de Aspirer à partir de cellules et rincer avec du DPBS. Aspirer DPBS et ajouter 0,4 ml 0,25% de trypsine dans un puits de la plaque de 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 5 min.
   3. Ajouter 1 ml de milieu de différenciation pour cesser la réaction et la pipette de haut en bas pour disperser des agrégats de cellules en cellules individuelles.
   4. Centrifugeuse CES à 200 g pendant 5 min et rejeter le milieu.
      1. Remettre en suspension 1 x 10 ^{6 <}/ Sup> CES dans 1 ml milieu de différenciation. Compter les cellules, et les cellules dans la culture à faible détachement boîte de Petri à une concentration de 1 x 10 ⁵ cellules / ml dans un milieu de différenciation à 37 ° C pendant la première agrégation EB.
   5. Deux jours après la formation EB, EB transférer des plats à tubes de 50 ml. Spin à 200 g pendant 1 min. Éliminer le milieu et rincer avec 10 ml EB DPBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+.
   6. Aspirer DPBS et ajouter 1 ml 0,25% de trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 4,5 ml de milieu de différenciation pour arrêter la réaction. Pipet haut et en bas de dissocier EB en cellules individuelles.
   7. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. Moyennes et remettre Aspirer cellules dans 1 ml milieu de différenciation.
   8. Compter les cellules et dilué 2 x 10 ⁶ cellules à 1 x 10 ⁵ cellules / ml dans un milieu de différenciation. Ajouter VEGF, et Bmp4 activine A dans le milieu à une concentration finale de 5 ng / ml, 0,8 ng / ml et 5 ng / ml, respectivement. Culture les cellules en boîte de Pétri pour la deuxième formation EB à 37 ° C.
   9. 40 h après la deuxième formation EB, EB transférer à tubes de 50 ml. Rincer avec du DPBS fois, dissocier EB avec 1 ml de 0,25% de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. Pipet haut et en bas de dissocier EB en cellules individuelles.
   10. Resuspendre les cellules dans STEMPRO-34 milieu avec 5 ng / ml de VEGF, 10 ng / ml de bFGF et FGF10 12,5 ng / ml. Plaque les cellules à 2 x 10 ⁵ / cm ² dans des plaques revêtues de gélatine. Culture à 37 ° C incubateur pour environ 32 h avant PCC isolement.
4. Isoler mCPCs
   1. Aspirer à moyen et rincer avec du DPBS. Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,25% pour des plaques de culture à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 4,5 ml de milieu de différenciation pour arrêter la réaction. Pipet haut et en bas de dissocier EB en cellules individuelles. Recueillir les cellules par des cellules de centrifugation et remettre en suspension dans 2% de FBS / PBS pendant FACS-purification.
   2. Exécutez CES indifférenciées sur trieuse comme contrôle négatif. Changer tension à régler avant le scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC) pour sélectionner la population souhaitée. Utilisez Forward Scatter contre la diffusion latérale et avant hauteur de dispersion par rapport largeur d'exclure les débris et doublet. Dans la sous-population sélectionnée, selon la répartition des contrôles ESC, dessiner une porte de YFP positif sur histogramme pour éliminer autofluorescence cellulaire. Recueillir YFP ⁺ CPC de YFP ⁺ déclenchement.
   3. Plate CPC purifiés (cellules YFP ⁺⁾ dans des plaques 6 puits avec un milieu de différenciation (1.3.1). Culture 3-5 jours supplémentaires à 37 ° C pour la différenciation des CPC en cardiomyocytes et SMC.

2. Détermination du CPC embryonnaires humaines à partir CES humaines

1. Préparer Feeders
   1. Préparer des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en tant que couche d'alimentation décrit ci-dessus à une densité de 2 x 10 ⁴ / cm ^2.
2. Maintenir CES de l'homme
   1. Maintenir ISL1 humaine: CRE; pCAG-flox-STOP-flox-GFP ou DP CES régulièrement sur MEF utilisant le milieu ordinaire de CSEh (Knockout DMEM / F-12 385 ml, 100 ml SR Knockout, 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 10 ng / ml FGF de base). Avant de différenciation cardiaque, transférer CES de l'homme dans le chargeur condition libre pendant au moins deux passages.
3. Préparer CES de l'homme dans chargeur condition libre
   1. Préparer plaques revêtues pour la culture CES de l'homme.
      1. Décongeler matrigel à 4 ° C pendant la nuit. Mettez un tube de 50 ml sur de la glace et ajouter 30 ml froide moyen / F12 DMEM dans le tube.
      2. Ajouter 1 ml matrigel dans le milieu froid et bien mélanger. Ajouter 1 ml froide matrigel-DMEM / 12 milieu dans un puits d'une plaque à 6 puits ou 5 ml dans un plat de 10 cm.
      3. Laisser les assiettes / plats à 4 ° C durant la nuit ou la température ambiante pendant 2 heures. Aspirer le milieu avant de l'utiliser.
   2. Diviser CES de l'homme sur les plaques: Aspirer le milieu de la plaque MEF et rincer CES de l'homme avec du DPBS. Ensuite, ajoutez 1 ml dispase (1 mg / ml) à un puits de la plaque de 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° Cincubateur jusqu'à ce que les bords de colonies commencent à se détacher.
   3. Retirer solution dispase. Rincer avec du DPBS deux fois, puis ajouter 2,5 ml / par milieu ainsi mTeSR ou moyen MEF conditionné à la plaque.
   4. Grattez les cellules en utilisant un grattoir à cellules et soigneusement pipette de haut en bas pour briser colonies humaines ESC en petits bouquets.
   5. Transférer les touffes ESC et diluer 1: 3 dans les plaques revêtues.
   6. Ajouter 2 ml / puits moyen mTeSR ou moyen MEF climatisées et changer moyenne quotidienne.
   7. Culture CES de l'homme en milieu mTeSR ou moyen MEF-conditionné sur des plaques revêtues pendant au moins deux passages.
4. Induire la différenciation du PCC CES de l'homme
   1. Lorsque les cellules sont ~ 90% de confluence, aspirer le milieu et rincer avec du DPBS. Puis incuber les CSEh dans 0,5 mg / ml Dispase à 37 ° C pendant 20 min.
   2. Rincer les cellules hES deux fois avec du DPBS, éliminer les cellules à partir de plaques avec un dispositif de levage de pile, puis remettre en suspension colliers de cellules dans un milieu de différenciation (DMEM / F12 contenant 18% de FBS, 0,1 mM de NEAA, 2 mML-glutamine, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol et 50 ug / ml d'acide ascorbique).
   3. Transfert cellules dans six puits plaques ultra-faible attachement pour la formation EB.
   4. Changer milieu de différenciation lendemain.
   5. Remplacer milieu tous les 3 jours et maintenir EB dans une culture en suspension.
5. Isoler HCPCS
   1. Recueillir EB au plus tard neuf jours de différenciation pour l'isolement PCC humaine.
   2. Aspirer moyen et rincer avec du DPBS EB deux fois. Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,25% à chaque puits de plaques de culture à 6 puits à 37 ° C pendant 5 min.
   3. Ajouter un volume égal de milieu de différenciation pour arrêter la réaction. Pipet haut et en bas de dissocier EB en cellules individuelles. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min cellules et remettre en suspension dans 2% de FBS / DPBS. cellules de filtrage avec 40 um tamis cellulaire et FACS-purifié la DP ⁺ cellules CPC comme décrit dans 1.4.3.
   4. Plate triée HCPCS sur des plaques de geltin revêtu. HCPCS de culture en milieu de différenciation pour 7-9 Jours à se différencier en cellules de cardiomyocytes et le muscle lisse. 7 jours après l'étalement, la culture des cellules avec 5% Knockout SR dans du milieu DMEM / F12 différenciée.

Résultats

Le protocole montre dérivation de CPC à partir de plusieurs lignées de cellules ES. CES sont agrégées pour former EB à se différencier en CPC. CES sont maintenues en routine sur mangeoires MEF (figure 1A, F) et les mangeoires sont retirés avant la différenciation. Sur agrégation des CES en EB dans un milieu de différenciation (figure 1B, g), le deuxième EB formés sont traités avec Bmp4 activine A et pour améliorer la différenciation du mésoderme dans des lignées cellul...

Discussion

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life technology	10828028
Knockout DMEM	Life technology	10829018
DMEM	Life technology	11965118
NEAA	Life technology	11140050
GlutaMAX	Life technology	35050061
N2	Life technology	17502048
B27	Life technology	12587010
Ham’s F12	Life technology	11765062
IMDM	Life technology	12440061
Pen/Strep	Life technology	15140122
Pyruvate	Life technology	11360070
Dispase	Life technology	17105041
Stempro-34	Life technology	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	Life technology	15260037
Trypsin	Life technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277