Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d'auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Résumé

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Résumé

Lésions de la moelle épinière (SCI) provoquent des troubles neurologiques graves et les conséquences psychologiques, économiques et sociales pour les patients et leurs familles. Cliniquement, plus de 50% de la SCI affecte la colonne cervicale ^1. En conséquence de la lésion primaire, une cascade de mécanismes secondaires, y compris l'inflammation, l'apoptose et la démyélinisation se produisent finalement conduit à la cicatrisation des tissus et du développement de cavités intramédullaires ^2,3. Tous deux représentent des barrières physiques et chimiques à la transplantation de cellules, l'intégration et la régénération. Par conséquent, l'environnement de mise en forme et d'inhibition de pontage cavités pour créer un milieu propice à la transplantation de cellules et de régénération est une cible thérapeutique prometteuse ^4. Ici, un modèle contusion / compression du col de l'utérus SCI en utilisant un clip à anévrisme est décrite. Ce modèle est plus cliniquement pertinent que d'autres modèles expérimentaux, puisque section complète ou ruptures du cordon sont rares. Toujours dans COMPARAISOn au modèle de perte de poids, ce qui en particulier les dommages colonnes de dos, la compression circonférentielle de la moelle épinière apparaît avantageux. force de fermeture Clip et la durée peuvent être ajustées pour obtenir différente gravité des blessures. Un ressort annulaire facilite étalonnage précis et la constance de pince vigueur. Dans des conditions physiologiques, les peptides d'auto-assemblage synthétiques (SAP) auto-assembler en nanofibres et donc, lancent un appel pour l'application de la SCI ^5. Ils peuvent être injectés directement dans la lésion en minimisant les dommages au cordon. PAS sont des structures biocompatibles ériger des échafaudages pour combler les cavités médullaires et donc, équiper le cordon endommagé pour des traitements régénérateurs. K2 (QL) 6K2 (NQ6) est un roman de SAP introduit par Dong et un l. ⁶ En comparaison à d'autres peptides, NQ6 auto-assemble en β-feuilles à pH neutre ⁶ 0,14 jours après la SCI, après la phase aiguë, PAS sont injectés dans le centre de la lésion et les cellules précurseurs neurales (NPC) sont injeDECT dans les colonnes dorsales adjacentes. Afin de soutenir la survie des cellules, la transplantation est combinée avec l'administration sous-dural continue de facteurs de croissance de micro-pompes osmotiques pendant 7 jours.

Introduction

Plus de 50% des lésions de la moelle épinière sont liés à la colonne cervicale. Dans la mise en clinique deux mécanismes physiopathologiques principaux sont décrits: le premier contusion de la moelle épinière et ensuite, la compression permanente causée par des fractures osseuses, des hémorragies ou de gonflement des tissus.

Les mimétiques contusion / modèle de compression du clip d'anévrisme deux mécanismes physiopathologiques: encliquetage du clip produit une contusion et la durée de coupure correspond à la composante de compression, en admettant que la compression dans les milieux cliniques causés par des fractures osseuses, des hémorragies ou de gonflement des tissus dernière étape de plus. Le clip d'anévrisme utilisé est modifié par un ressort annulaire garantissant force de pincement exacte et reproductible. Surtout en comparaison avec l'hémi-transection ou le modèle de contusion, ce clip d'anévrisme imite modèle meilleurs paramètres cliniques. Bien que les patients souffrant de lésions thoraciques souffrent de paraplégie, la plupart des patients avec inj col de l'utérusuries sont tétraplégique et complètement dépendante. La structure anatomique de la moelle cervicale, cependant, montre des différences significatives par rapport à la thoracique ou lombaire, et donc, se adresse en particulier dans ce protocole.

Le développement des cavités médullaires et des cicatrices de tissus sont des obstacles pour la récupération et la régénération. Pour surmonter ces obstacles à l'utilisation de matériel d'échafaudage est une approche prometteuse. peptides auto-assemblage peuvent être injectés directement dans l'épicentre de la lésion. Là, ils se assemblent en échafaudages nano-fibres de transition de la cavité et à améliorer l'environnement en réduisant l'inflammation inhibitrice et effarouchement des tissus. Bien que les matériaux rigides provoquent des dommages considérables de la moelle épinière lors de l'implantation, les peptides peuvent être injectés de fluide en toute sécurité et sans dommage sévère supplémentaire.

Amélioration de l'environnement d'inhibition avec des peptides d'auto-assemblage avant la transplantation de cellules souches, par conséquent, supporte la cellule iNTÉGRATION, la différenciation et, enfin, la récupération fonctionnelle après lésion de la moelle épinière cervicale.

Protocole

NOTE: Le protocole expérimental suivant a été approuvé par le comité de protection des animaux de l'University Health Network (Toronto, Canada) et est conforme aux politiques établies dans le guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire préparés par le Conseil canadien de protection des animaux .

1. cervicale anévrisme clip Contusion / Compression Modèle

1. Avant d'instruments et de chirurgie de l'autoclave maintenir des conditions stériles au cours de la procédure surgcial ensemble en mettant les instruments dans un bain d'alcool à 70%.
2. Anesthésier rats Wistar (250-270 g) avec une combinaison de l'oxygène (O _2), l'oxyde nitreux (N ₂ O) (1: 1), et de 1.8 à 2.2% isoflurane et soutenir la respiration spontanée via un masque d'anesthésie de gaz. Pour l'induction de l'anesthésie commencer avec 5% d'isoflurane pendant 1 minute et réduire par la suite. Avant de commencer la chirurgie, la profondeur de l'anesthésie de contrôle en donnant un stimulus douloureux (par ex. Dans les pattes). Appliquer pommades grassesdans les yeux pour éviter la sécheresse et pour prévenir les infections ultérieures.
3. Mettez les rats sur un coussin de chauffage (37 ° C) et fixer la tête dans un cadre stéréotaxique.
4. Rasez la région chirurgicale autour de la colonne cervicale et désinfecter avec povidone iode et 70% d'alcool.
5. Faire une incision médiane au-dessus de la colonne vertébrale de la vertèbre cervicale (C2) atteignant au Processus de premier plan du corps vertébral thoracique 2 (T2).
6. Couper à travers la couche extérieure des muscles vertébraux directement sur la ligne médiane (pour éviter les saignements) dans une direction cranio-caudale et encore disséquer les couches musculaires profondes carrément jusqu'à ce que vous atteignez le apophyses épineuses et les lames. Insérez écarteurs.
7. Orienter l'apophyse épineuse de premier plan du T2 de corps vertébral d'observer les niveaux ciblés pour laminectomie. Après identification et micro-chirurgicale préparation des lames sélectionné, couper à travers la flavae ligamenti pour desserrer les lames et l'apophyse épineuse. Enfin, cut travers les lames avec un latéral clipper os à la moelle épinière et enlever ceux doucement, en évitant toute compression de la moelle épinière elle-même.
   NOTE: La plupart niveaux communs sont C5 / 6, C6 / 7, ou C7 / T1. Le taux de mortalité périopératoire augmente plus rostrale la gravité des blessures. Saignement du sinus veineux paravertebral est commun et peuvent être traitées par la compression prudent avec éponge.
8. Avant d'insérer le clip de traumatiser le cordon, identifier les nouvelles racines nerveuses de leur épargner l'écrêtage (en particulier au niveau C5 / 6).
9. Afin d'assurer le bon pince à induction, desserrer la dure-ventrale de la face dorsale des corps vertébraux avec un crochet et préparer un couloir pour le clip.
10. Enfin, insérer le clip ouvert et laissez-le se referment (fermeture rapide) pour atteindre une blessure contusion. force de fermeture du plan-séquence et la durée de fermeture de clip à déterminer l'intensité du traumatisme et de l'ampleur de la compression. Couramment utilisés sont des forces clip comprises entre 15-35 g et un clipping durée de 1 min, par exemple. (Figure 1).
11. Après le retrait du clip, adapter muscles en deux couches et fermer la plaie.
12. Arrêtez l'anesthésie et de laisser le sillage des animaux sous votre observation continue jusqu'à ce qu'il reprenne conscience suffisante pour décubitus sternal. Enfin, mettre le rat dans une seule cage et suivez les directives de traitement post-opératoires.
13. Puisque les animaux se débattent avec la gravité de ce type de blessure, vous devez payer une attention particulière à des traitements post-opératoires:
    1. Administrer des analgésiques (buprénorphine et Meloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement et selon les symptômes cliniques).
    2. Donnez solution saline supplémentaire sous-cutanée pendant trois jours (deux fois par jour, 5 à 10 millilitres (ml)).
    3. Fournir des antibiotiques dans l'eau potable 2 jours avant et jusqu'à ce que la chirurgie de poste sept jours (par exemple, moxifloxacine)
    4. Pressez la vessie 2-3 fois par jour jusqu'à la récupération de la fonction de la vessie est constantely apparente.
    5. Respecter les déficits neurologiques et état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour.

2. Injection PAS et PNJ (14 jours après la lésion)

1. Induire une anesthésie comme décrit dans 1.1. à 1,3, fixer la tête du rat dans un cadre stéréotaxique, enlever les points de suture ou clips plaies, et désinfecter la plaie et la zone chirurgicale avec de la povidone iode et 70% d'alcool.
2. Disséquer soigneusement les muscles paravertébraux, insérez rétracteurs, enlever le tissu cicatriciel au microscope de la dure-mère, et ré-exposer le site de la lésion.
3. Préparer SAP à une concentration de 1% (p / v) pour effectuer un gel de matrice extracellulaire. PAS NQ6 ont un pH physiologiquement compatible et ne ont pas besoin d'être tamponnée avant l'injection. Pour la visualisation de programmes d'ajustement structurel de la moelle épinière, utiliser un dérivé fluorescent de NQ6 (NQ6-FITC).
4. Injecter PAS (5 microlitres (ul) dans le centre de la lésion, répartis en deux portions, chacune2,5 ul bilatéral de la ligne médiane. Utiliser une seringue Hamilton relié au cadre stéréotaxique avec un micro-capillaire de verre (100 micromètres (um) de diamètre externe (OD)). Ouvrez la dure attentivement avec la pointe d'une aiguille, et insérez le capillaire en verre stéréotaxique 2 millimètres (mm) dans la moelle épinière traumatisé.
5. Après l'injection tiers du volume, retirez l'aiguille à 1,5 mm de profondeur, et après un nouveau tiers-1 mm. Après l'injection de la totalité du volume, et avant le retrait de la seringue, attendre 5 minutes afin de stabiliser la formation de gel.
6. Pour générer PNJ, utilisez la souris adulte DsRed (ou souris positives YFP, vert) et isoler et les cultiver de la zone paraventrical ^4,18,21.
7. Évaluer la viabilité de NPC par coloration au bleu Trypan indiquant la présence de ~ 90% de cellules vivantes dans la suspension de cellules. Diluer les cellules dans un milieu de croissance (50 x 103 cellules vivantes / ul), puis les utiliser pour une transplantation de cellules.
8. Assurez-quatre 2 pi (8 pi vo totalelume, contenant 4 x 10 ⁵ PNJ) injections intraspinales bilatéralement à 2 mm rostrale et caudale du site de la lésion. Après ouverture de la dure-mère, à insérer le micro-capillaire de Hamilton verre 1,5 mm sous la surface dorsale de la moelle épinière et injecter 2 ul de la suspension cellulaire. Choisissez un taux d'injection à environ 0,5 pl / min (min).
9. A la fin de chaque injection et avant le retrait du capillaire sur le cordon, attendre au moins une minute tissu étirage permettant d'accueillir le nouveau volume de la cellule. (Figure 2)

3. Implantation de sous-dural Pompes pour Growth Factor application

1. Afin d'enrichir le liquide céphalo-rachidien (LCR) avec des facteurs de croissance soutenir la survie cellulaire, utiliser des micro-osmotique pompes dilution des facteurs de croissance sous-durally tout au long de 7 à 14 jours, avec un taux de dilution de 0,5 ul / h, un diamètre de cathéter de 0,04 OD cm, et un volume de réservoir de 100 ul.
2. Choisissez facteurs de croissance préférés(Par exemple, le cerveau facteur de croissance dérivé (BDGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance des fibroblastes (FGF)), à remplir les pompes 10.06 h implantation avant, et équilibrer pompes dans un bain d'eau à 37 ° C.
3. Immédiatement après injections NPC, préparer une cavité sous-cutanée de placer la pompe. Endroits préférés sont les flancs latéraux de thoraco région abdominale en évitant l'inconfort local majeur causé par la pompe elle-même.
4. Pour obtenir la plus forte concentration de facteurs de croissance, se assurer que la pointe ouverte du cathéter se termine à proximité du site de la lésion. Par conséquent, effectuer un saut-laminectomie du niveau supérieur ou inférieur adjacent. Par exemple, si la SCI est au C7 / T1, effectuer une petite laminectomie C5.
5. Mettez la pompe dans la cavité sous-cutanée, de raccourcir le cathéter à la longueur nécessaire, et le fixer avec plusieurs sutures (6,0) sur les muscles paravertébraux évitant toute dislocation mouvement associé.
6. Après l'ouverture de la dure-mère (par exemple, à C5) avec le bout pointud'une aiguille, introduire le cathéter dans l'espace sous-dural et laissez-le glisser dans une direction caudale sans résistance et sans blesser le cordon. La lame de sautée par exemple C6 sert point de fixation et la stabilisation du cathéter supplémentaire.
7. Assurez-vous que le cathéter fonctionne bien et ne plie pas.
8. Fermer muscles par couche, et la peau, avec des sutures ou des clips. (Figure 3)
9. Arrêtez l'anesthésie et de laisser le sillage des animaux sous votre observation continue jusqu'à ce qu'il reprenne conscience suffisante pour décubitus sternal. Enfin, les remettre dans une seule cage et suivez les directives de traitement post-opératoires.
10. Fournir un traitement postopératoire spécial, même si, les animaux auraient récupéré en partie à ce point dans le temps:
    1. Administrer des analgésiques (Buprenorthine et Meloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement et selon les symptômes cliniques).
    2. Fournir des antibiotiques dans des bouteilles d'eau jusqu'à 2 jours avant7 jours après la chirurgie (par exemple moxifloxacine).
    3. Continuez à comprimer la vessie, se il est encore nécessaire.
    4. Donnez fluides sous-cutanés supplémentaires, si les rats apparaissent déshydraté.
    5. Gardez observant la fonction neurologique et l'état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour.
    6. Administrer un traitement immunosuppresseur deux jours injection PNJ préalable et jusqu'à sept jours après transplanation (minocycline) et jusqu'au sacrifice (Sandimmune), respectivement.

4. évaluation de tissus

1. Sacrifice des animaux à la fin de la période d'observation (par ex. 4 semaines après la SCI) en anesthésie profonde (isoflurane à 5% pendant 2-3 min) et perfuser les transcardiaque avec 50 ml froid (4 ° C) suivie d'une solution saline froide 150 ml 4 % de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS).
2. Retirer la moelle épinière et le mettre dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) pendant 24 heures.
3. Mettez la moelle épinière dans une solution de saccharose de 25% pour cryoprotection pendant 48 heures.
4. Fournir cryosections longitudinales avec une épaisseur de <30 pm.
5. Pour la coloration immunohistochimique de tous les noyaux cellulaires offrant une utilisation de fond DAPI (1: 1000). PNJ positifs DsRed apparaissent en rouge, QL-six FITC apparaît en vert, et les deux donc pas besoin d'être teinté spécialement. (Figure 4).
6. Pour la microscopie électronique à balayage (MEB) permettent échantillons tremper dans glutaraldéhyde à 4 ° C pendant 2 heures, déshydratent les lentement en 10 étapes d'incrémentation% d'éthanol pendant 5 min et les placer dans un liquide sous pression CO ₂ siphon pendant 1 heure. échafaudages Coat avec de l'or à l'aide d'une coucheuse de pulvérisation. Prenez des photos avec un microscope électronique à balayage Hitachi S-3400N. (Figure 5)

Résultats

Lors de l'exécution de la procédure décrite ci-dessus, vous obtiendrez un SAP échafaudage combler la cavité et offrant une amélioration de l'environnement inhibitrice, moins effarouchement des tissus et une augmentation de la survie de l'APN. La figure 4 montre une section longitudinale d'une moelle épinière de rat obtenu au site de la lésion six semaines après SCI et quatre semaines après l'injection NQ6 SAP et PNJ transplantation. Peptides NQ6 ont été injectés a...

Discussion

Ce protocole a été développé pour permettre au lecteur de réaliser un modèle de lésion cervicale chez les rats et d'utiliser une approche de traitement combiné avec les PAS et les PNJ favorisant une meilleure récupération après cervicale SCI.

Surtout en comparaison à d'autres modèles de traumatismes cervicaux, comme le (hémi) -transection modèle ou les modèles de chute de poids et une commotion cérébrale, le clip contusion / modèle de compression représente à la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysmal clip	SharpTech
Surgical microscope	Leica
Micro injection system	World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments
Hamilton syringe	Hamilton company
Subdural pumps	Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument	Fine Science tools
Isoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP	Baxter
7.5% Povidone iodine	Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0.4% Trypan blue	Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)	Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF)	Sigma