Dérivation des cellules T<em&gt; In Vitro</em&gt; De la souris les cellules souches embryonnaires

Résumé

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Résumé

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Introduction

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Protocole

1 Préparation de milieux de culture, cytokines et plaques GELATINISE

1. Préparer support de cellules ES en utilisant la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec l'hyperglycémie et du pyruvate de sodium. Ajouter 20% ESC Qualifié de sérum bovin fœtal (FBS), 1% pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine, 1% tampon HEPES, acides aminés 1% non essentiels, 0,1% de gentamicine (50 mg / ml) et 0,1% ( 55 pM) β-mercaptoéthanol. Stériliser les médias de cellules ES par filtration.
2. Préparation de supports en faisant OP9 1 L de milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) de poudre selon les instructions du fabricant. Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Mélanger par inversion. Stériliser par filtration en deux aliquotes de 500 ml.
   NOTE: L'utilisation des médias à base de poudre est recommandé et susceptible de donner un meilleur entretien des cellules OP9 et dans les résultats de la différenciation in vitro. Cette approche est devenue notre procédure standard. Cependant, nous notons aussi that nous avons parfois utilisé liquides pré-faites α-MEM avec succès suffisant.
3. Préparation des milieux de congélation en ajoutant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 90% de FBS. Agiter doucement et stériliser par filtration. Conserver à 4 ° C.
4. Préparer 2,000x ligand Flt-3 (10 ng / ml) en dissolvant recombinant ligand Flt-3 humain (Flt-3L) dans des milieux de OP9 complète à 10 pg / ml. Aliquote de 1,5 ml dans des microtubes et conserver à -80 ° C. Suivez les recommandations du fournisseur en ce qui concerne la stabilité et le stockage.
   REMARQUE: La stabilité de Flt-3L est court (1 mois à 4 ° C ou 3 mois à -80 ° C).
5. Préparer 1,000x IL-7 (1 ug / ml) en utilisant le support de OP9 complète. Aliquote de 1,5 ml dans des microtubes et conserver à -80 ° C. Suivre les recommandations du fournisseur sur la stabilité et le stockage (IL-7 est stable jusqu'à 12 mois à -80 ° C).
6. Préparer facteur inhibiteur 1,000x leucémie (LIF) (10 pg / ml) par une dilution 1:10 de 10 ⁷ unités de LIF in médias de cellules ES. aliquote de magasin à 4 ° C. N'oubliez pas de noter la date d'expiration prévue par le fabricant sur les flacons de parts.
   NOTE: Ce produit est stable dans la forme concentrée ou diluée au moins 18 mois à compter de la date de fabrication.
7. Préparer des plaques de 6 puits par gélatinisé ajouter 1,5 ml de solution à 0,1% de gélatine dans chaque puits d'une plaque à 6 puits. Laisser la vaisselle dans la hotte stérile à température ambiante avec des couvercles sur les, ce qui permet au moins 30 min pour le revêtement. Les plats peuvent également être laissés dans un incubateur humidifié nuit. Éliminer toute solution de gélatine restes juste avant l'ensemencement des cellules. Ne laissez pas la solution de gélatine sécher complètement dans le puits.

2 Préparation et maintenance de cellules nourricières et de la souris de cellules souches embryonnaires (MESC)

Remarque: toutes les cellules à incuber dans un humidifié à 37 ° C incubateur avec 5% de CO _2.

1. Décongélation fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)
   1. Rapide décongeler un flacon congelé (~ 5 x 10 ⁶ cellules / flacon) de mitomycine C traités (ou non) la mitose arrêté MEF et les transfèrent à un tube de 15 ml.
   2. Ajouter 8 ml de milieu de cellules ES à des cellules décongelées, dans un mode de goutte à goutte à diluer progressivement le DMSO du milieu de congélation.
   3. Centrifuger les cellules à 400 x g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez délicatement le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieu de cellules ES.
   4. Préparer un tube de centrifugation de 50 ml avec 33 ml de milieu préchauffé cellule ES. Ajouter 3 ml de MEF remis en suspension pour amener le volume final à 36 ml.
   5. Distribuer les 3 ml de MEF remis en suspension dans chaque puits de deux plaques de 6 puits gélatinisé. Placer les plaques dans l'incubateur pendant au moins six heures pour permettre aux cellules de se fixer et se propagent avant l'ensemencement des mESCs sur eux. Ces couches nourricières mitotiquement arrêtés peuvent être utilisables pendant plusieurs jours après l'ensemencement initial, si leurs médias sont changés tous les 2-3 jours.
      NOTE: MEF fraîchement arrêtés peuvent également être utilisés.
   6. MESCs semis
      1. Quick-dégel d'un flacon avec un clone MESC congelé dans un bain d'eau à 37 C °, et de préparer les cellules comme décrit dans 2.1.1-2.1.3.
         NOTE: Nous geler 2 flacons de MESC d'un puits confluent d'une plaque à 6 puits.
      2. Retirez le support d'un puits (par MESC clone) de la plaque à 6 puits avec des monocouches arrêtées MEF (préparé dans l'étape 2.1.5) et ensemencer 3 ml de la mESCs au-dessus de la monocouche MEF. Ajouter 3 pi de 1,000x LIF (10 ng / ml). Retour plats dans l'incubateur.
   7. L'entretien des cellules ES et de la trypsine médiation passage
      REMARQUE: les médias changent tous les jours, ou division sur la base confluent de MESC. Idéalement, la récolte et intermédiaires / re-plaque les cellules tous les deux jours.
      1. Retirez le support de cellules souches embryonnaires et laver mESCs avec 2 ml de PBS. Retirer du PBS. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,25% et on incube à 37 ° C pendant 3-5 min.
      2. Recueillir les cellules traitées à la trypsine et les transférer dans un tube à centrifuger de 15 ml. Vigoureusement pipette la suspension de cellules pour briser les mottes de mCES. Ajouter 2 ml de milieu complet de cellules ES à la suspension de cellules de neutraliser la trypsine.
      3. cellules de tourner à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml ES médias cellulaire.
      4. Retirez le support de plaques de 6 puits contenant des monocouches préparés MEF arrêtés. Ajouter la quantité appropriée de la suspension de cellules (sur la base du rapport de division souhaité) dans 3 ml de milieu de cellules ES à chaque puits pour ensemencer. Ajouter 3 pi de 1,000x FRV. Un confluent MESC bien divisé 1: 6 sera prêt pour le passage en 2 jours.
   8. OP9 / entretien des cellules OP9-DL1
      1. Décongeler une fiole de cellules OP9 (suivez les étapes 2.1.1-2.1.3 l'utilisation des médias OP9)
      2. Ajouter 7 ml de milieu de OP9 à boîte de 10 cm pour culture de tissus. Ajouter 3 ml de cellules remises en suspension d'une manière goutte à goutte, la distribution des cellules tout au long de la plaque. Placer les cellules dans l'incubateur pendant une nuit.
      3. Vérifiez la confluence des cellules OP9 le lendemain. Si le plat contient de nombreuses cellules flottantes morts, remove les médias et ajouter 10 ml de milieu de OP9 frais. Remettre le plat dans l'incubateur si presque pleine confluence n'est pas observée. Split (utilisant de la trypsine) 1: 4 la monocouche près de la confluence de OP9.
         NOTE: Les plaques doivent encore atteindre un même niveau de confluence dans environ 2 jours. Prenez soin de ne pas laisser les cellules OP9 devenir plus confluentes.
      4. Geler les premiers passages de cellules OP9 que les stocks d'expansion.
         NOTE: Nous geler 2 flacons de cellules OP9 d'un proche confluence de 10 cm. Chaque flacon d'expansion stock peut être encore propagée à constituer des stocks de travail qui sont ensuite utilisés dans Mesc expériences de co-culture. Gardez tous les stocks de OP9 congelés dans l'azote liquide plutôt que dans le congélateur à -80 ° C, car les fluctuations de température peuvent influer négativement sur la qualité des gels.

   3. OP9-DL1 Co-culture procédure

   1. Préparations de co-culture
      1. Environ une semaine avant le début d'une co-culture, décongeler MEF, mESCs et sto cellule OP9 travailcks. Comme les cellules OP9-DL1 ne sont pas nécessaires jusqu'au jour de co-culture 8, décongeler les cellules OP9-DL1 pendant les trois premiers jours après le début de co-culture. Maintenir ou geler toutes les cellules que nécessaire.
      2. Déterminer le nombre initial de plaques de 10 cm avec des monocouches de cellules OP9 préparés pour atteindre 80% de confluence sur la co-culture jour 0 fondé sur le barème de l'expérience (par exemple, le nombre de clones Mesc à être différencié et le nombre de co-culture des moments de analyser). Pour se préparer à une co-culture, diviser près plat de confluence des cellules OP9 entre 1: 4 et 1: 6, deux jours avant lorsque les monocouches seront nécessaires.
         REMARQUE: Il faudra au moins une plaque par ESC clone. En règle générale, un seul clone ESC ensemencée sur une seule plaque (comme décrit ci-dessous) au jour 0 devrait donner suffisamment de cellules pour ensemencer six plaques à la journée 5 passage. Chaque plaque jour 5 permettra un ultérieur point de temps d'analyse.
      3. Depuis monocouches OP9 seront continuellement nécessaires pour le passage de co-culture, prenez soin de toujours maintadans un nombre suffisant de plaques de culture de OP9 supplémentaires en parallèle avec la co-culture.
   2. Jour 0: Initiation de co-culture
      1. Recueillir MESC comme dans 2.3.1-2.3.4. Compter les cellules.
      2. Pour chaque clone MESC préparer 5 x 10 ⁴ MESC dans 10 ml de milieu par boîte de OP9.
         NOTE: Bien que nous n'avons pas utilisé, nous notons qu'un moyen alternatif consistant en α-MEM, 10% de FBS, et 5 x 10 ^-5 M β-mercaptoéthanol a également été signalé pour une utilisation dans la différenciation des co-cultures ^10.
      3. Enlevez le vieux médias de OP9 plats et ajouter les 10 ml de suspension MESC les plats en prenant soin de distribuer les cellules uniformément dans toute la plaque. Placez les plats à la 37 ° C incubateur.
   3. Jour 3: Changement de média
      1. Retirer les plats de l'incubateur et observer au microscope. Colonies devraient commencer à perdre brillance et semblent aplatie.
      2. Retirez le papier de plats et ajouter doucement 10 ml de frais OP9médias.
      3. Retour aux plats de co-culture de l'incubateur. Contrôler visuellement la formation de colonies mésoderme comme tous les jours pour informer le calendrier de préparation OP9 alimentation monocouche pour le prochain passage (jour 5), qui ne devrait pas être effectuée jusqu'à ~ 80-90% des colonies afficher visuellement mésoderme comme morphologie. Report maximum de cinq jours l'étape de transfert de cellule est de 2 jours.
   4. Jour 5: trypsine passage médiation avec pré-placage.
      REMARQUE: Préparez à l'avance un nombre suffisant de boîtes de 10 cm avec des cellules OP9 optimale confluentes. Procédez aux étapes suivantes que si les co-cultures afficher visuellement les caractéristiques décrites à l'étape 3.3.3 (voir aussi résultats représentatifs).
      1. Retirez le support de la vaisselle de co-culture. Ajouter 4 ml de PBS à laver. Agiter le PBS et l'enlever. Ajouter 4 ml de trypsine à 0,25% et placer les plats dans l'incubateur pour ~ 5 min.
      2. Perturber la couche de cellules traitées à la trypsine par pipetage vigoureux, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air excessifs, jusqu'à unsuspension cellulaire homogène, la plupart du temps unique est obtenue.
      3. Ajouter 4 ml de milieu OP9 complètes et mélanger par pipetage. Transfert des cellules dans un nouveau, vide de 10 cm et les placer dans l'incubateur pendant 30 min pour permettre aux cellules OP9 à adhérer à l'antenne. Cette étape de «pré-placage" réduit le nombre de cellules transférées OP9 à la prochaine étape de co-culture.
      4. Préparer 50 ml tubes de centrifugeuse avec tamis de cellules de 40 um.
      5. Recueillir des cellules non-adhérentes de l'antenne pré-plaqué et de les transmettre à travers le tamis de cellules dans le tube. Laver la capsule doucement avec 6 ml de PBS et passer à travers le même filtre, laissant les cellules OP9 attachées derrière.
      6. Centrifuger les cellules à 400 x g 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 3 ml de milieu complet de OP9. Compter les cellules.
      7. Retirez le support de plaques de 10 cm avec des cellules OP9 optimale confluentes.
      8. Pour chaque point de temps d'analyse, de semences 5 x 10 ⁵ cellules sur la OP9 monocouche dans un volume final de 10 ml.
      9. Ajouter 5 ng / ml recombinant Flt-3L humain et de placer les plats dans l'incubateur.
   5. Jour 8: de cellules souches hématopoïétiques (HPC) collection
      REMARQUE: préparer à l'avance un nombre suffisant de plaques de 6 puits avec des monocouches ou OP9 OP9-DL1 cellules de sorte qu'elles seront ~ 80% de confluence dans le temps pour cette étape.
      1. Préparer 50 ml tubes de centrifugation avec 40 um tamis.
      2. Retirez les plats de l'incubateur et observer au microscope. Grappes brillantes de BHP devraient être plus ou moins attachés à la monocouche OP9. Recueillir le plus grand nombre de ces cellules que possible par lavage (mais pas trop perturber) la monocouche OP9 avec une pipette et les médias existant sur le plat. Pour éviter la formation de mousse, laissez toujours au moins 1 ml de médias dans la pointe de la pipette au cours de cette collection de HPC / étape de lavage.
      3. Faire passer les cellules à travers le tamis de 40 um dans un tube. Ajouter 8 ml de PBS à la même plaque et vérifier sous le microscope si tous les CAH nousre recueillies. Répétez l'étape de lavage / de collection avec du PBS et (si nécessaire) avec un lavage plus énergique. Filtrer les cellules dans le tube contenant déjà les cellules provenant de la même plaque.
      4. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
      5. Préparer un mélange de maître de 3 ml (par plaque ensemencée au jour 5) des médias OP9 avec 5 ng / ml Flt-3L et 1 ng / ml d'IL-7.
      6. Retirer le surnageant et remettre le culot dans les médias OP9 avec Flt-3L + IL-7 master mix (3 ml pour chaque boîte de 10 cm traitées). Transférer les cellules recueillies à partir de chaque plaque dans un puits d'une plaque à 6 puits avec des cellules OP9.
         1. Pour conduire les cellules vers monocytes, cellules B ou lignées érythroïdes, ensemencer les cellules prélevées sur des cellules OP9. Pour obtenir des cellules T, ensemencer les cellules sur des monocouches de cellules OP9-DL1.
      7. Placez les plaques de 6 puits en incubateur.
   6. Jour 10: Changement de média
      1. Préparer un tube à centrifuger de 15 ml pour chaque clone MESC-chargeur type de cellule distinct combination en co-culture.
      2. Préparer un mélange maître de supports de OP9 avec 5 ng / ml de Flt-3L et 1 ng / ml d'IL-7. Préparez 3 ml pour chaque puits.
      3. Recueillir délicatement les médias de chaque puits de la plaque de 6 puits combiner les médias à partir de plusieurs puits contenant le même clone-alimentation combinaison de type de cellule ESC.
      4. Ajouter 2 ml de mélange maître de médias OP9 (voir 3.6.2) dans chaque puits.
      5. Centrifuger la presse collectées à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot (très faible si visible) dans 1 ml de OP9 maître médiatique mélange (voir 3.6.2) par puits collectées à l'origine à l'étape 3.6.3.
      6. Distribuer 1 ml de cellules de nouveau dans chaque puits à partir de laquelle les médias ont été recueillis portant le volume dans chaque puits de 3 ml. Remettre les boîtes dans l'étuve.
   7. Jour 12: Pas de passage de la trypsine
      REMARQUE: préparer à l'avance un nombre suffisant de boîtes à 6 puits avec des cellules OP9 ou OP9-DL1 afin qu'ils soient confluentes de façon optimale dans le temps pour ce step. Jour 12 est idéal pour la cytométrie en flux analyses de érythroïde en développement, monocytes et lymphocytes T à un stade précoce.
      1. Préparer un mélange maître (3 ml pour chaque bien qui se poursuivra en co-culture) des médias OP9 avec 5 ng / ml de Flt-3L et 1 ng / ml d'IL-7.
      2. Préparer 50 ml tubes à centrifuger de 40 um tamis (un pour chaque clone-alimentation combinaison de type de cellule ESC en co-culture).
      3. Pipette vigoureusement les médias existants dans chaque puits de ventiler toutes les cellules (y compris la monocouche) dans le puits. Continuer avec pipetage vigoureux jusqu'à un état ressemblant à une suspension de cellule unique est obtenue.
      4. Passez les cellules recueillies à travers le tamis dans le tube. Ajouter 3 ml de PBS dans chaque puits pour laver et de recueillir toutes les cellules restantes. Passez cellules à travers le même filtre. Mélanger les cellules à partir de plusieurs puits contenant le même clone-alimentation combinaison de type de cellule ESC.
      5. Jeter le filtre cellulaire et retirer une aliquote l'équivalent d'un bien (~ 6 ml) pour toute désirécytométrie de flux (ou autre) des analyses à effectuer ce jour-là. Conserver les échantillons sur la glace avant utilisation.
      6. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Reprendre le culot des tubes de 50 ml de centrifugeuses dans 3 ml de mélange maître par puits pour être re-graine. Ajouter 3 ml par puits de chaque suspension cellulaire sur le type de cellules nourricières appropriées et placer les boîtes dans l'incubateur.
   8. Jour 14: Changement de média
      1. Suivez les étapes décrites à la section 3.6.
   9. Jour 16: Pas de passage de la trypsine
      REMARQUE: préparer à l'avance des boîtes de 6 puits de cellules OP9 ou OP9-DL1 confluentes de façon optimale pour cette étape.
      REMARQUE: Jour 16 est idéal pour les analyses de flux cytométrie de lymphocytes B et les lymphocytes T de la scène centrale.
      1. Suivez les étapes décrites dans la section 3.7.
   10. Jour 18: Changement de média
       1. Suivez les étapes décrites à la section 3.6.
   11. Jour 20: n passage de la trypsine
       REMARQUE: Jour 20 is idéal pour la cytométrie en flux analyse de mi à fin phase de développement des cellules T.
       1. Suivez les étapes décrites dans la section 3.7. Si vous le souhaitez, effectuer la différenciation des cellules passé 20 jours changement de support alternatif et pas trypsine passages tous les deux jours, avec un suivi quotidien du taux d'expansion des lymphocytes.

Résultats

Lorsqu'il est cultivé sur MEF en présence de LIF, mESCs peuvent être maintenues dans un état indifférencié. Dans des conditions idéales, ils apparaissent sous forme de colonies compactes de cellules entourées par un halo lumineux en microscopie à contraste de phase (figure 1). Ces cultures doivent être contrôlés quotidiennement. Selon la confluence des cellules, les médias peuvent être modifiés ou cellules peuvent être divisées. Voisins colonies de Mesc ne doivent pas venir au point...

Discussion

Le système OP9-DL1 co-culture a été utilisée pour étudier le rôle des différents produits de gènes au cours du développement de types de cellules sanguines à partir de cellules souches. ^8,12,13 Il s'est également avéré un modèle efficace pour étudier la fonction de l'ADN de régulation de gènes cours de la différenciation cellulaire ^9,14. Grâce à cette approche comme une alternative aux modèles entiers de la souris peut produire des économies considérables en temps et ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab