Le lapin de sang-shunt modèle pour l'étude de aiguë et les séquelles tardives de hémorragie méningée: Aspects techniques

Résumé

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures — subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

Résumé

Lésion cérébrale précoce et le vasospasme cérébral retardé à la fois contribuer à des résultats défavorables après une hémorragie méningée (SAH). Modèles animaux reproductibles et contrôlables qui simulent les conditions sont actuellement rares. Par conséquent, de nouveaux modèles sont nécessaires afin de reproduire les conditions physiopathologiques humaines résultant de SEP.

Ce rapport décrit les nuances techniques d'un modèle de SEP sang-shunt lapin qui permet un contrôle de la pression intracrânienne (PIC). Une dérivation extracorporelle est placée entre le système artériel et l'espace sous-arachnoïdien, ce qui permet examinateur indépendant SAH dans un crâne de fermeture. Étape par étape les instructions de procédure et de l'équipement nécessaire sont décrits, ainsi que les considérations techniques pour produire le modèle de la mortalité et une morbidité minimale. Des détails importants nécessaires pour la création chirurgicale réussie de ce modèle robuste, simple et cohérente SAH lapin ICP-contrôlée sont décrits.

Introduction

Hémorragie hémorragie méningée (HSA) est l'une des plus mortelles conditions neuropathologiques, conduisant souvent à des dommages ou la mort ¹ neurologiques permanentes. Des recherches antérieures ont mis l'accent sur ​​le vasospasme cérébral retardé (DCVS) que l'étiologie primaire des déficits neurologiques associés à la SEP ^2. Cependant, les pauvres en général les résultats cliniques des patients souffrant de SEP après le traitement du vasospasme a conduit à une expansion de l'axe de recherche pour inclure les effets de la petite lésion cérébrale (EBI) après SAH ^3. Une meilleure compréhension de l'importance à la fois de EBI et DCVS en contribuant à de mauvais résultats cliniques après SAH est essentiel pour le développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces.

Jusqu'à maintenant, l'injection de sang autologue simple et double dans la grande citerne a été la méthode standard pour SAH induction pour l'étude de DCVS ^2-6. Bien que couramment utilisé dans les études antérieures,ce modèle très probablement ne pas reproduire les principaux changements neuropathologiques de la SEP induit EBI ^7. En revanche, la perforation endovasculaire est connu pour produire des modifications physiopathologiques aiguës sévères qui reproduisent partiellement les symptômes de l'EBI ^7.

Ce rapport décrit un nouveau modèle de lapin de SAH conçu pour permettre une enquête de deux EBI et DCVS, ce qui permet une caractérisation plus précise de la pathologie SEP-induite _^8-10. Avec la technique décrite, modèle standard grande citerne est adapté en connectant le système artériel de l'artère sous-clavière et la grande citerne via un shunt extracorporelle. La circulation du sang est ainsi liée à la physiologie du lapin et entraîné par la différence de pression entre le sang artériel et de la pression intracrânienne. Le saignement s'arrête lorsque la pression intracrânienne (PIC) est égale à la pression artérielle diastolique et le sang dans le système de shunt coagule. Utilisant l'hôte & #8217; s physiologie réduit examinateur dépendant SAH induction, ce qui conduit à un modèle plus cohérent de SEP qui produit de façon fiable à la fois EBI et phénotypes DCVS ^3,8-10.

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Protocole

Trois mois vieilles femelles lapins néo-zélandais pesant 2.5-3.5 kg ont été utilisés pour cette procédure. L'étude a été réalisée en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec l'approbation du Comité du canton de Berne, Suisse (approbation n ° 105/13) de protection des animaux. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées dans des conditions stériles à l'Institut de chirurgie expérimentale du Département de recherche clinique à l'hôpital universitaire de Berne à Berne, Suisse. Un anesthésiste vétérinaire a suivi les animaux pendant la chirurgie et tout au long de la récupération.

1 Préparation des animaux, de positionnement et artère sous-clavière Canulation

1. Induire une anesthésie générale chez le lapin avec une injection intramusculaire de kétamine (30 mg / kg; Ketalar, 50 mg / ml) et de xylazine (6 mg / kg; Xylapan 20 mg / ml) et de la profondeur de l'anesthésie de commande en vérifiant la réponse du lapin à nocive stimulation (par exemple, pincement de l'orteil). Voir 1.7 en cas de réponse positive.
2. Déroulez les paupières inférieures des deux yeux et appliquez une petite quantité de pommade sur les paupières pour prévenir la sécheresse et l'irritation.
3. Sonder la veine latérale de l'oreille avec un Gbutterfly Venflon® 20 (20 G de cathéter vasculaire), fixer avec du ruban adhésif, et se connecter à un sac de gravité contenant du chlorure de sodium à 0,9% (500 ml / 24 h) et la kétamine (40 mg / kg / h) / xylazine (4 mg / kg / h) pour une administration intraveineuse continue (iv) l'anesthésie. Administrer des analgésiques supplémentaires toutes les 15 min iv (fentanyl, 1 mcg / kg). Remarque: Évitez les anesthésiques de gaz volatils, qui est associée à une diminution du RPC, l'augmentation de la CBF, et la baisse des taux métabolique cérébrale pour l'oxygène ¹¹ anesthésiques intraveineux offrent des caractéristiques plus idéales pour neuroanesthésie en préservant CBF et la vasoconstriction cérébrale, ^12, qui est d'une importance supérieure lors de l'étude cérébrale. vasospasme. En outre, bien que la mortalité est augmentée dans spontrespiration aneously animaux, il peut mieux imiter la situation humaine de SEP aiguë.
4. Fournir de l'oxygène (1 - 2 L / min) par l'intermédiaire d'un masque respiratoire qui permet à du dioxyde de carbone en fin d'expiration (EtCO ₂₎ la surveillance.
5. Installez un électrocardiogramme à 3 canaux (ECG) .Positionner trois électrodes sous-cutanées dans un arrangement triangulaire sur la face ventrale du lapin; spécifiquement, placer une électrode sur la région midthoracic droite (avec la distance sur le terrain rasé stérile pour le cathétérisme de l'artère sous-clavière) et deux électrodes dans le bas-ventre répartis sur les deux branches.
6. Surveiller la profondeur d'anesthésie toutes les 15 min pendant la chirurgie par suite de la fréquence respiratoire, la fréquence cardiaque (HR) contrôlée à partir du signal ECG, et réaction à une stimulation nociceptive.
7. En cas de réponse positive à une stimulation nociceptive (orteil de pincement), adapter la profondeur de l'anesthésie par kétamine bolus (6 mg / kg) iv et xylazine bolus (0,05 mg / kg) iv et / ou un bolus analgésie supplémentaire avec Fentanyl (1 mcg / kg) iv
8. Fixer le lapin dans une position couchée sur une plaque de réchauffement du corps, en inclinant la tête 20 ° vers le bas et en la tournant légèrement controlatérale au côté sur lequel l'artère sous-clavière sera exposé.
9. appliquer une pommade ophtalmique et préparer le terrain pour la chirurgie par le rasage des poils sur le pectoral droit dans le tiers médian de la clavicule, et sur le crâne frontal-, parietal- et occipital, le cou, et sur l'artère fémorale commune droite.
10. Désinfectez la peau pendant 3 min avec un large spectre antiseptique, par exemple., Povidone iodée.
11. Couvrir le lapin avec des draps stériles. Effectuer toutes autres procédures dans des conditions stériles et fréquemment l'application 4% papavérine HCl et une solution antibiotique (sulfate de néomycine 5 mg / ml) par voie topique pour prévenir le vasospasme artériel par la manipulation de la cuve et des infections locales.
12. Infiltrer le muscle pectoral avec des anesthésiques locaux (lidocaïne 1% maximum de 6 mg / kg). Faire une incision parasternale peau et la préparer lamuscle pectoral. Utilisation du microscope, disséquer l'artère sous-clavière et le fixer avec une extrémité proximale et distale ligature (4-0 sutures polyfilament) autour de l'extrémité exposée. Gardez une ligature à proximité de la commande proximale en place pour fixer le cathéter et ligaturer le vaisseau distal.
13. Effectuer une artériotomie dans la paroi de l'artère sous-clavière par incision de l'artère avec un microscissor courbe et cathétériser l'artère sous-clavière rétrograde avec un petit intravasculaire robinet à 3 voies. Fixer le cathéter en double ligature vers le noeud de ligature distale afin d'empêcher la torsion de l'artère ou de la flexion de la partie proximale de l'artère et à éviter un glissement ou un saignement massif.

2. pression artérielle et de la surveillance Gaz du sang artériel

1. Connectez le robinet d'arrêt à 3 voies à i) la canule intravasculaire pour gaz du sang artériel (ABG) analyse, le pH, la PaCO _2, PaO _2, le bicarbonate, l'excès de base, et de SO _2, ii) le sang artériel invasifpression de l'appareil de mesure, et iii) le dispositif de dérivation.
2. Prélever des échantillons de sang pour le statut ABG (PaCO _2, PaO ₂₎ et de surveiller en permanence les paramètres standards cardiovasculaires et respiratoires (pression artérielle, RH, ECG, fréquence respiratoire et de fin-de-marée de CO ₂₎ et de transfert de données via l'interface de sortie analogique à un Analog- convertisseur / enregistreur de données numérique et magasin.
   REMARQUE: Les pressions seront remis à zéro au niveau du cœur avant et après chaque session, et étalonnage de la pression du convertisseur analogique / numérique convertisseur et système d'enregistrement des données se fera une fois avant la série commence.

3. de base par soustraction numérique angiographie

1. Passer une dispositif de calibrage externe (petite sphère) sur les deux angles de la mandibule afin de calibrer l'angiographie.
   NOTE: Ceci permet la comparaison exacte des mesures a posteriori de la ligne de base et le suivi diamètre du vaisseau.
2. Effectuez l'angiographie numérique (DSA) par rétrograde intra-uninjection d'un bolus de rterial Iopamidol non ionique (0,6 ml / kg, 5 ml / s pendant 2 secondes) à travers l'artère canulée et rincer immédiatement la canule après injection d'un bolus de solution saline afin d'empêcher l'occlusion de celui-ci.
3. Obtenir des images (7 images à 14 sec) du système vertébro utilisant un enregistrement rapide d'angiographie séquentielle dans une position oblique 5 ° à gauche antérieure.
4. Infiltrez la zone autour de l'artère fémorale commune droite avec des anesthésiques locaux (lidocaïne 1%, maximum 6 mg / kg). Faire une petite incision inguinale de la peau. Utilisation du microscope pour la visualisation, disséquer l'artère fémorale commune et le fixer avec une extrémité proximale et distale ligature (4-0 sutures de polyfilament) autour de l'extrémité exposée.
5. Après artériotomie, cathétériser l'artère fémorale d'une gaine 5-F. Rincer l'orifice latéral de la gaine avec une solution saline.
6. Progresser un cathéter 5-F dans l'artère brachiocéphalique à travers la gaine sous fluoroscopie. Créer une feuille de route, puis avancez un fil de guidage à the système vertébro. Injecter un bolus de Iopamidol non-ionique (0,6 ml / kg, 5 ml / sec en 2 sec) pour DSA comme décrit dans l'étape 3.2.

4 Rotation à position couchée

1. Après base DSA, repositionner le lapin de la position couchée à la position couchée. Veillez à ne pas manipuler ou déplacer la position des cathéters intra-artériels.
2. Placez la tête dans un porte-tête à un angle de 30 °, orienté tête vers le bas.

5. Cisterna Magna Puncture

1. Désinfectez la peau sur la tête et le cou avec Povidone iodée 3 fois pendant 1 min chacun, et couvrir la zone chirurgicale avec des draps stériles.
2. Insérez un x 40 mm aiguille d'accès moelle pédiatrique de 22 G transcutanée dans la grande citerne sans incision de la peau avant ou déplacement de muscle.
3. Assurez-vous que l'animal est complètement anesthésié en assurant une absence de réponse orteil-pincement avant de glisser l'aiguille le long de la osseux protubérance occipitale externejusqu'à ce qu'un écart a été détecté; ne pas pousser l'aiguille plus loin.
4. Confirmer le bon positionnement de l'aiguille en observant des gouttes spontanée de liquide céphalo-rachidien avec la tête du lapin incliné à un angle de 20 ° pendant quelques minutes.

6 Installation de la pression intracrânienne et cérébrale surveillance du flux sanguin

1. Après cutanée médiane et Galea incision, insérer un petit écarteur chirurgical.
2. Faire trois ostéotomies rond (diamètre de 2 mm) à l'aide d'un micro-foret à haute vitesse dans la partie frontale du crâne selon les points de repère du crâne extérieures (Figure 1) ^9, c'est à dire, sur le bulbe olfactif et frontal bilatéral pour le placement d'un dispositif de neuromonitorage si nécessaire. Utilisez une règle à l'échelle du millimètre à déterminer les coordonnées de bavure emplacement des trous comme suit: pression intracrânienne (PIC) suivi dans la ligne midpupillary, une à deux mm de la ligne sagittale médiane; intraparenchymateuses sondes laser Dopplerquatre à cinq mm antérieure et latérale par rapport au bregma (figure 1).
3. Visualisez la dure-mère, et effectuer l'hémostase méticuleuse: utiliser de la cire d'os pour l'hémostase osseuse en raison de son action de tamponnement et effectuer l'hémostase locale à l'aide de la coagulation bipolaire de la dure-mère.
4. Placez la pression intracrânienne (PIC) pointe du moniteur intraparenchymateuse dans le bulbe olfactif droit à une profondeur de 2 mm, puis étalonner.
5. Placez les sondes à l'aiguille fine de deux laser-Doppler en utilisant un système de serrage externe et de les insérer dans les trous de bavures correspondants dans les deux hémisphères droit et frontal latéral gauche du système ventriculaire, c'est à dire, sur la ligne médiane pour éviter toute interférence avec le fluide céphalo-rachidien. Placer les sondes d'aiguilles jusqu'à une profondeur de 2,5 mm.
6. Après mise en place des sondes de neuromonitoring, sceller tous les trous de bavures avec un bouchon de cire d'épaisseur de l'os afin de maintenir le crâne étanche.
7. Mesurer les paramètres de base de la moyenne de la pression artérielle (MAP), ICP et la circulation sanguine cérébrale (CBF) à l'aide d'un moniteur à paramètres multiples et quatre canaux tissu laser-Doppler moniteur de perfusion sanguine.

7. Shunt induction

1. Connectez l'aiguille d'accès moelle dans la grande citerne de l'artère sous-clavière auparavant un cathéter par une tubulure de surveillance de la pression artérielle remplie. Utiliser le robinet à 3 voies pour la mesure de la pression artérielle et que le port de prélèvement de sang.
   NOTE: La gravité de SEP dépend de la quantité de sang, et peut être grossièrement estimé par le ampleur de caillots subarachnoïdiens au moment de la récolte du cerveau ^5,11.
2. Surveiller en permanence MAP, RH, ECG, la fréquence respiratoire et la fin-de-marée de CO ₂ à un taux d'échantillonnage de 1 Hz à partir de 6 min avant au moins jusqu'à 20 min après HSA.
3. Assurez-vous que l'animal est complètement anesthésié en assurant une absence de réponse orteil de pincement avant d'ouvrir la connexion de dérivation entre l'artère sous-clavière et la grande citerne pour induire SAH par la Gradie de pressionnt.
   REMARQUE: Un SAH contrôlée peut être obtenue par la fermeture de la dérivation à n'importe quel moment (par exemple, à un niveau souhaité de ICP.).
4. Enregistrer des valeurs de régime permanent pendant une période de temps d'environ 15 min.
5. Après ICP atteint son apogée, maintenir l'aiguille d'accès vertébrale en place jusqu'à ce que l'ICP retourne à un état d'équilibre proche des valeurs de référence. Si le plateau du PCI est maintenue pendant plus de 10 secondes ou si ICP diminue spontanément, fermer le shunt.
6. Retirer CBF sondes à l'aiguille fine et la sonde ICP, boucher les trous de bavures avec de la cire d'os, retirez tous les cathéters (y compris cathéter sous-clavière, depuis la manipulation du cathéter avec saignement consécutif est associée à une forte morbidité et la mortalité, et augmente le taux d'infection), effectuer rigoureuse irrigation de la plaie avec sulfate de néomycine et suturer la peau.

8. gestion postopératoire

1. La procédure dure environ 2 heures. En raison de la demi-vie de la kétamine et de la xylazine, le temps de récupération de l'animal est assez courte - environ 1 h. Les animaux sont maintenus sous une lampe chauffante pendant la récupération. D'autres liquides ne sont pas fournis. Au cours de cette phase initiale de récupération post-opératoire, appliquer la buprénorphine 0,02 mg / kg sc toutes les 8 heures pendant 24 heures.
2. Appliquer transdermique de fentanyl matrice patchs libérant 12,5 pg / h dans la région du cou rasé des animaux pour l'analgésie efficace au cours de la prochaine 72 heures.
3. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
4. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale dans la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.

9 Suivi angiographie par soustraction numérique pour évaluer DCVS au Jour 3

1. Effectuez les étapes 1.1 à 3.6 comme décrit ci-dessus.
2. Euthanasier les animaux par injection intra-artérielle de bolus de thiopental de sodium (40 mg / kg) (thiopental, Ospedalia AG, Hünenberg, Suisse). Dans les cas où l'histologie et immunohistochemistry est nécessaire, effectuer une perfusion intracardiaque de fixation à la température ambiante sous une pression de perfusion de 100 cm H ₂ O.

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Résultats

Le modèle de shunt de sang de lapin de SAH décrit dans ce rapport produit EBI dans l'hippocampe (figure 2A, B), le cortex basale (Figure 2A, B), et le système vasculaire cérébral (figure 2C) dès 24 h après la blessure et représente une caractéristique distribution du sang (figure 2D) ^8. En outre, le modèle déclenche modérée à des degrés sévères de DCVS sur trois jours après SAH induction (figure 3)...

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Discussion

Le modèle de dérivation produit pathologie similaire à celle observée chez l'homme après aiguë SAH ^3,8,10. Il a été suggéré que EBI peut exacerber, maintenir et même déclencher DCVS ^12, et que ce tel modèle peut aider à enquêter sur les phases précoces et tardives DCVS, y compris les interactions EBI et DCVS suivantes SAH. En particulier, reproductible in vivo DCVS techniques de surveillance, y compris DSA ^13, calculé angiographie par tomographie ^14,

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Operation microscope	Zeiss, Jena, Germany		Zeiss, OPMI-MD surgical microscope
Surgical equipment	B. Braun, Germany		Forceps medical no. 5; vessel scissors 8 cm; microclip 4 mm
Respirator	Hugo Sachs
Hair clipper	3M Surgical Clipper		Starter Kit 9667A
Body warm plate	FHC
Blood gas analyzer	Radiometer, Copenhagen, Denmark	ABL 725
Cardiac monitoring	Camino Multi-Parameter Monitor, Integra, Plainsboro, NJ, US	AP-05
Software analysis	BIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA, USA		Biopac MP100 and acqKnowledge software,version 3.8.1
Software analysis	ImagePro Discovery, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA		Image-Pro Plus version
Angiography apparatus	DFP 2000 A-Toshiba	MIIXR0001EAA
ICP monitor	Camino Laboratories, San Diego, CA, USA		ICP monitor, Model 110-4B
Blood flow monitor	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		CAL KIT microsphere solution
Laser-Doppler flowmetry fine needle probes	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		MNP110XP, 0.48 mm diameter
Pressure tube	B. Braun, Germay		PE 1.0 mm × 2.0 mm
Anesthesia monitor	GE Medical Systems, Switzerland		Datex S5 Monitor
Material
20 G vascular catheter	Smiths Medical		Jelco i.v. catheter, REF 4057
5.5 F three-lumen central venous catheter	Connectors, Tagelswangen, Switzerland		Silicone catheter STH-C040
22 G x 40 mm needle	Emergo Group Inc., Netherlands
High-speed microdrill	Stryker, Solothurn, Switzerland	5400-15
Bone wax	Ethicon, Johnson & Johnson,NJ, USA	ETHW31G
Bipolar forceps	Aesculap, Inc., PA, US	US349SP
Ketamin			Any generic product
Xylazine			Any generic product
Buprenorphine			Any generic product
Fentanyl			Any generic product
Transdermal fentanyl matrix patches			Any generic product
Lidocaine 1%			Any generic product
4% papaverin HCl			Any generic product
Neomycin sulfate	Research Organics Inc., OH, USA		Any generic product
Povidone-iodine			Any generic product
0.9% sodium chloride			Any generic product
Iopamidol	Abott Laboratories, IL, USA		Any generic product
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
4-0 polyfilament sutures	Ethicon Inc., USA	VCP284G