Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

Résumé

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Résumé

Les cellules répondent à la stimulation par la chimiokine perdre leur forme ronde dans un processus appelé polarisation, et en modifiant la localisation subcellulaire de nombreuses protéines. Techniques d'imagerie classiques ont été utilisées pour étudier ces phénomènes. Cependant, ils doivent l'acquisition manuelle de nombreuses cellules, suivie par une quantification du temps de la morphologie et de la co-localisation de la coloration de plusieurs dizaines de cellules. Ici, un procédé rapide et puissant est décrit à étudier ces phénomènes sur des échantillons constitués de plusieurs milliers de cellules en utilisant une cytométrie en flux de la technologie de formation d'image qui combine les avantages d'un microscope à celles d'un cytomètre. Utilisation de lymphocytes T stimulés avec CCL19 et coloration pour les molécules MHC de classe I et de l'actine filamenteuse, une stratégie de déclenchement est présenté simultanément à mesurer le degré de modifications de forme et l'étendue de la co-localisation de marqueurs qui sont affectés par la signalisation de CCL19. En outre, cette stratégie de porte nous a permis de OBSERVe la séparation de l'actine filamenteuse (à l'avant) et phosphorylée Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) protéines (à l'arrière) dans les cellules T polarisées après CXCL12 stimulation. Cette technique est également utile pour observer l'effet de blocage sur la polarisation de deux éléments différents: l'inhibition de la polymérisation de l'actine par un inhibiteur pharmacologique et l'expression de mutants de la / voie de signalisation de la PKC atypique PAR6. Ainsi, la preuve montre que cette technique est utile d'analyser les altérations morphologiques et redistributions de protéines.

Introduction

Les chimiokines sont de petites protéines solubles qui attirent les cellules à des endroits spécialisés ^1. Par conséquent, ils participent au positionnement correct de cellules dans les tissus, un rôle crucial dans le développement et la physiologie. Le système immunitaire ne fait pas exception à cette règle car il repose sur l'action de nombreux différents types de cellules qui agissent de concert pour monter une réponse immunitaire efficace. En contrôlant la localisation spécifique d'un type de cellule immunitaire dans un état donné, les chimiokines sont des pré-requis avant antigènes étrangers peuvent être détectés et neutralisés.

Dans les lymphocytes T en particulier, les chimiokines se lient à des récepteurs spécifiques de surface qui, lors de l'engagement, suscitent de nombreux signaux intracellulaires (élévation du calcium, la phosphorylation de ERK, activation GTPases Rho, augmentation des intégrines affinité et altérations du cytosquelette) qui favorisent motilité des cellules T ^2,3. Au niveau cellulaire, on peut observer des altérations morphologiques induites par stimulation de chimiokine.Ces changements dans les formes cellulaires sont particulièrement dramatique dans les cellules T: les cellules T au repos ont une morphologie ronde bourrelet lorsque vous voyagez dans le flux sanguin. Cependant, la détection de la présence de chimiokines dans les sites inflammatoires ou à proximité des organes lymphoïdes va changer la forme des cellules T qui adoptent désormais une «main-miroir» morphologie typique composé d'une forme bipolaire: un bord d'attaque à l'avant et un bord arrière, ou uropode, ⁴ à l'arrière. En outre, les composants intracellulaires peuvent séparer dans ces deux régions opposées d'une cellule T de polarisation pour maintenir la migration. Par exemple, les filaments d'actine polymérisation augmente lors d'une stimulation de chimiokine ⁵ actine polymérisée et se accumule à l'avant d'une cellule polarisée T ^2. D'autre part, plusieurs protéines telles que les protéines phosphorylées de la famille Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) qui relient la membrane plasmique au cytosquelette d'actine corticale, relocaliser au uropode de polarisationLes cellules T ^6. Fait intéressant, nous et d'autres avons montré que ce processus de polarisation est nécessaire pour la migration des cellules T. En effet, un traitement qui interfère avec la polarisation va inhiber la motilité cellulaire. Par exemple, l'inhibition de l'activité des membres de la protéine atypique kinases C (PKC) famille, PKCÇ et PKCι blocs T polarisation de la cellule et le processus de balayage de migration des cellules dendritiques ^7. T polarisation cellulaire est également réglementée par GTPases Rho. Nous avons montré que la modulation de l'activité de la protéine RhoA par Fam65b récemment décrit interfère avec les changements de cellules T de la morphologie et de leur capacité à migrer dans un dosage ⁶ Transwell. Comme polarisation est une étape préalable à la motilité cellulaire, il est donc crucial d'être en mesure de quantifier comme un indicateur principal de réponses de chimiokines. modifications de la forme des cellules ont déjà été mesurés manuellement ^8. Cependant, ce type de dosage est très chronophage, de sorte que seuls quelques-uns habituellementdizaines de cellules sont prises en compte.

Ici, une nouvelle méthode est présentée à quantifier rapidement le degré de modifications de forme de lymphocytes T exposés à la chimiokine stimulation. Un flux d'imagerie de cytométrie la technologie (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) est utilisée, qui combine les avantages d'un cytomètre de flux et un microscope ^neuf pour quantifier efficacement la quantité de cellules polarisées dans différentes conditions de stimulation de chimiokine. En plus de la quantification des altérations morphologiques que l'on peut mesurer robuste avec cette technologie, il est également possible d'évaluer les changements dans la localisation subcellulaire de certaines protéines de chimiokine sur la signalisation.

Protocole

1. Préparation des lymphocytes T

1. Préparer la souris primaire ou cellules T humaines comme décrit ^10,11.
2. Cultiver les cellules T humaines dans un milieu complet RPMI avec 10% de sérum AB humain à une densité de 2-3 x 10 ⁶ cellules / ml.
   NOTE: L'utilisation de sérum de veau foetal (FCS) à la place du sérum humain peuvent induire la polarisation spontanée d'une grande fraction de cellules T humaines en culture. Gardez ces cellules en culture pendant 4-5 jours, et autre processus à tout moment pendant cette période.
3. Maintenir les cellules T de souris dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS à une densité cellulaire similaire. Utilisez immédiatement ou le lendemain, après une culture O / N à 37 ° C en présence de 10 ng / ml IL7.
4. Cultiver la lignée cellulaire T humaine CEM dans RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS.

2. Chemokine Stimulation

1. Laver 5 x 10 ⁵ cellules par condition expérimentale en milieu HBSS chaud complété avec 10 mM HEPEs. Pour certaines expériences, co-transfection de cellules T humaines primaires la veille avec 2 pg pmaxGFP et 8 pg pcDNA3.1 ⁺ (vecteur vide, contrôle), PKCÇ kinase morts, ou des plasmides PAR6 N-terminaux.
2. Reprendre le culot cellulaire dans un milieu HBSS chaud-Hepes (utiliser 0,3 ml x nombre de conditions expérimentales).
3. Distribuez les cellules dans 1,5 ml microtubes.
   NOTE: En conséquence, un tube correspondant à une seule condition expérimentale contient 5 x 10 ⁵ cellules dans 0,3 ml de milieu HBSS-HEPES. Pour certaines expériences, ajouter 500 nM Latrunculin A ou de véhicule (DMSO) et on incube les cellules pendant 30 min avant la stimulation de chimiokine.
4. Ajouter 10 à 500 ng / ml CCL19 ou chimiokine CXCL12 dans chaque tube.
   NOTE: Nous utilisons habituellement 10-200 chimiokine ng / ml pour les cellules T humaines. Cellules CEM ne expriment pas le récepteur CCR7 qui se lie CCL19. Par conséquent, les cellules CEM ne seront en mesure de répondre à une stimulation de CXCL12. En outre, utiliser des concentrations plus élevées de chimiokines (300-500 ng / ml) pour polariser les cellules T de souris.
5. Retourner les tubes à plusieurs reprises et les incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 8 à 10 min ou de cellules T primaires ou CEM, respectivement.
6. Arrêter le processus de polarisation en ajoutant à chaque tube 0,3 ml d'une solution chaude contenant 2% de paraformaldehyde (PFA) et Hepes 10 mM dans du PBS. Retourner les tubes et les incuber à 37 ° C pendant 5 min.

3. colorations

1. Transférer les cellules des microtubes à la cytométrie en flux tubes.
2. Remplir les tubes avec une solution complètement RT contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,5 mM d'EDTA et 10 mM de Hepes dans du PBS.
3. Centrifuger les tubes à 460 g pendant 4 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul d'une solution contenant RT 5% de FCS dans du PBS.
5. Ajouter 5 ul de FITC-anti-HLA-ABC dans chaque tube, les vortex, et incuber pendant 30 min à température ambiante, à l'abri de la lumière.
6. Laver les cellules une fois avec du PBS contenant 5% de FCS, unend fois avec du PBS seulement.
7. A RT: ajouter 500 ul de 1% de PFA, incuber pendant 10 min, puis laver les cellules avec une solution contenant 1% de BSA, 0,5 mM d'EDTA et 10 mM de HEPES dans du PBS.
8. Jeter le surnageant, complètement remplir les tubes avec une solution de PBS contenant 0,2% de BSA, 0,1% de saponine, 0,5 mM d'EDTA et 10 mM de Hepes (tampon de perméabilisation).
9. Laver les cellules deux fois dans ce milieu.
10. Retourner les tubes pour éliminer le milieu et Vortex les dissocier le culot cellulaire.
11. Ajouter 0,25 ug / ml TRITC-phalloïdine et / ou une dilution 1: 100 d'anticorps anti-P-ERM à chaque tube, les vortex et incuber pendant 30 min à température ambiante.
12. Laver les cellules avec le tampon de perméabilisation. Incuber avec un anticorps secondaire fluorescent si nécessaire.
13. Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS et les transférer à des microtubes.
    REMARQUE: Les cellules sont prêts pour l'acquisition. Sinon, tout en gardant un volume total maximal de 200 pi par tube, ajouter concentré PFA à une finale 1%concentration afin de préserver les colorations si les cellules ne sont pas à utiliser le même jour pour un traitement ultérieur.

4. Images acquisition et d'analyse

1. Allumer l'appareil (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) et laissez-le se calibrer selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Le logiciel INSPIRE été utilisé avec un objectif 40X (0,75 NA). Le logiciel IDEAS 3.0 a été utilisé pour tous les quantifications signalés.
2. Préparer une série de fenêtres d'acquisition qui peuvent être sauvegardés dans un modèle pour de futures expériences. Dessinez histogrammes qui quantifient les valeurs de gradient de RMS. De la population "In Focus", sélectionnés sur les RMS de l'histogramme gradient, délimiter la population "cellule unique" sur un histogramme de la zone. Une fois que le tube de microcentrifugation a été inséré dans la machine, régler la puissance du laser, porte sur des cellules individuelles et d'acquérir des lymphocytes T 5000.
3. Dans les idées molleslogiciel, ouvrez le fichier d'acquisition et de créer un histogramme qui indique la valeur de la valeur RMS de gradient pour les images de champ lumineux (canal 1) obtenu pour chaque cellule individuelle. Dessinez une grille sur le gradient histogramme RMS qui considère cellules présentant RMS valeur gradient ci-dessus 57.
   NOTE: Le gradient RMS permet de prendre en compte dans l'analyse uniquement les lymphocytes T qui sont dans le plan focal. Nous avons déterminé de manière empirique que les cellules individuelles présentant une valeur de gradient supérieure à RMS 57 sont dans le plan focal, et peuvent être considérés de façon précise.
4. Dans le / menu Analyse des Masques, créer un nouveau masque, appelé Erode (M01,2) du masque de la morphologie sur les images en fond clair M01, érodés de 2 pixels. Puis, dans l'Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonctionnalité de la zone, calculé sur le masque Erode (M01,2). A partir des cellules sélectionnées dans la grille précédente, ouvrir un histogramme montrant la zone de cellules à l'aide de ce masque nouvellement créé.
   La morphologie des masques qui sont disponibles par: NOTEdéfaut sont beaucoup plus grande que la taille réelle de la cellule. Ainsi, il est plus précis de l'éroder jusqu'à deux pixels.
5. Dessinez une porte sur les cellules T individuelles, à l'exception des billes de calibration et de débris (petite zone) et les doublets (grande surface). Réglez cette porte à chaque acquisition.
   REMARQUE: Les variations de la taille des cellules auront une incidence sur la position de la porte. Comme les cellules T de souris sont plus petites que les cellules T humaines qui sont eux-mêmes plus petites que les cellules CEM, la surface de chaque type de cellule est proportionnelle à sa taille.
6. Considérant les cellules individuelles, de mise au point qui ont été fermée dans les étapes précédentes, ouvrez une parcelle points constituée de la Raw Max Pixel sur la coloration HLA-ABC (canal 2, axe des x) en fonction de la Raw Max Pixel sur la phalloïdine coloration (Channel 4, axe y). Créer un portail d'exclure les événements fluorescentes non colorées ou saturés. Ouvrez deux histogrammes montrant la Raw Max Pixel pour HLA-ABC (canal 2) et phalloïdine (Channel 4) colorations.
7. Dans l'analyse / menu Masques, createa nouveau masque, appelé Erode (M02,2) du masque de la morphologie des cellules HLA-ABC colorées (canal 2), érodés de 2 pixels. Puis, dans l'Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonction consistant en le paramètre de circularité, calculé sur la Erode (M02,2).
   NOTE: Ce paramètre mesure la déviation de la forme de la cellule d'un cercle. Par conséquent, une cellule T parfaitement ronde aura une valeur de circularité élevée tandis que les cellules polarisées allongés présentera un indice de circularité bas.
8. Par la suite, créer un autre histogramme qui rendra compte les valeurs de la fonction de circularité des cellules précédemment gated. Utilisez cet histogramme pour tracer directement la distribution d'un individu, la population cellulaire de mise au point selon la valeur de la circularité de chaque cellule individuelle.
9. Au vu de la forme de l'histogramme pour les cellules non stimulées, tracer une grille de cellules polarisées, à partir de la valeur de circularité la plus basse jusqu'à la valeur limite de circularité où la plupart des cellules non stimuléessont tracées. Regardez l'affichage des statistiques pour le pourcentage de cellules polarisées parmi la population fermée (Gated%).
   NOTE: Nous avons mis cette porte pour les valeurs de l'indice circularité ci-dessous 13.
10. Afin de regarder la polarisation de la coloration de l'actine dans les cellules, tracer un histogramme pour la Détail Lumineux valeur similarité R3, comparant la coloration HLA-ABC (canal 2) et la coloration de la phalloïdine (Channel 4).
    NOTE: Plus la valeur de cette fonction, plus superpose les deux colorations sont.
11. En utilisant la même stratégie de déclenchement comme précédemment, tracer une grille sur des cellules non stimulées pour la coloration distinct qui montre le pourcentage de cellules présentant une coloration de l'actine polarisée.
12. Une fois terminé, le pourcentage de cellules présentant une ségrégation dans la distribution du CMH de classe I et de colorations phalloïdine, le pourcentage de cellules polarisées ainsi que les valeurs moyennes des indices circularité et la similitude de toutes les cellules ± SD sont présentés dans l'correspStatistiques onding panneaux.

Résultats

Le premier exemple choisi ici concerne l'utilisation de lymphocytes T primaires humains stimulés avec CCL19. Cependant, la même stratégie peut être utilisée avec des cellules T de souris primaires, des lignées de cellules T ou tout autre type sensible à la stimulation de chimiokine sur les cellules. La stratégie présentée ici de déclenchement comprend une série de fenêtres qui sélectionnent les événements ciblés, puis les cellules individuelles. Enfin la plage d'intensité de fluorescence est su...

Discussion

Grâce à une technologie récente des flux d'imagerie de cytométrie une stratégie rapide et informative déclenchement d'analyser des événements cellulaires et moléculaires induits par la stimulation de la chimiokine est présenté. A partir d'une seule expérience, on peut obtenir deux types d'informations: les changements dans la morphologie cellulaire induites par stimulation de la chimiokine et la distribution subcellulaire de protéines différentes pendant le processus de polarisation. Fait i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis