Automatisation expériences ChIP-seq pour générer des profils épigénétiques sur 10 000 cellules HeLa

Résumé

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Résumé

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Introduction

Comme séquençage de nouvelle génération (NGS) technologies sont devenues monnaie courante et plus accessible, la principale méthode pour la cartographie du génome entier des interactions protéine-ADN est maintenant immunoprécipitation de la chromatine suivie d'une détection NGS (ChIP-seq), qui permet la découverte du facteur de transcription des sites ou des motifs de modifications des histones contraignant. ChIP-seq est avantageux de fournir des données à haut débit de l'ensemble du génome qui peut être utilisé pour l'analyse quantitative et qualitative des interactions protéine-ADN par la mesure des fragments d'ADN enrichies. Cependant, il ya quelques inconvénients dans les expériences de ChIP-seq standard tels que la difficulté à obtenir suffisamment de matière pour créer une bibliothèque de séquençage.

expériences de puce sont divisés en six étapes de base y compris les régions de liaison 1) protéine-ADN de réticulation 2) préparation de l'échantillon qui comprend la lyse des cellules et le cisaillement de la chromatine par sonication, 3) formation des complexes immuns,4) la précipitation des complexes immuns, 5) le lavage des complexes immuns, et 6) l'élution du matériau enrichi et analyse par qPCR et END.

Le succès d'un essai de ChIP dépend de trois facteurs principaux: une bonne préparation de la chromatine, la quantité d'antigène dans l'échantillon original, et la spécificité et d'affinité de l'anticorps pour son antigène correspondant. Une limitation importante est la nécessité de grandes quantités de départ du nombre de cellules afin d'obtenir suffisamment d'ADN enrichi pour créer une bibliothèque de séquençage. Pour les scientifiques qui travaillent avec des quantités limitées des échantillons, tels que des échantillons de biopsie ou de sous-populations de cellules, des expériences de ChIP-seq sont très difficiles. Des études récentes ont montré que des essais ChIP-seq peuvent être effectuées lorsque vous travaillez avec une faible quantité de cellules ^{1, 2.} Diagenode a développé un système de manipulation de liquides robotisé qui peut automatiser entièrement expériences ChIP-seq quand on commence avec un nombre limité de cellules.

Automation fournitde nombreux avantages par rapport à la préparation manuelle des échantillons de puce suivants car il diminue l'erreur humaine, réduit la variabilité, et réduit le coût expérimental. Protocoles semi-automatiques pour immunoprécipitation de la chromatine et la préparation de la bibliothèque ont été signalés, mais aucune de ces études a montré des données lors de l'utilisation des numéros de cellulaires faibles ^{3, 4, 5, 6.}

Dans cet article, un flux de production automatisé complète est décrite pour les deux immunoprécipitation et de préparation de la bibliothèque dosages chromatine dans un système de manipulation de liquide robotisé qui utilise une technologie à base de billes magnétiques et qui peut traiter plusieurs paramètres dans l'optimisation de protocole. Ici, les expériences de ChIP-seq automatisés ont été effectués avec succès sur un nombre limité de cellules dans le but de simplifier, normaliser, et de fournir une solution fiable pour étudier les profils épigénétiques dans de petites populations de cellules. Le protocole de ChIP automatisé décrit dans le présent document a été optimisé sur des cellules HeLa en utilisant des anticorps histones spécifiques et réactifs but le flux de travail peut être adaptée à d'autres lignées cellulaires et d'anticorps avec optimisation expérimentale correspondante.

Protocole

1. Expériences standard ChIP

1. collection cellulaire et les protéines et l'ADN réticulation.
   1. Cultiver les cellules HeLa-S3 à une confluence de 80% -90%. Retirez milieu de culture, laver le plat deux fois avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS), et ajouter la trypsine-EDTA (1x) à la plaque de culture. Incuber pendant un maximum de deux minutes pour détacher les cellules de la boîte. Recueillir les cellules et laver deux fois avec 10 ml de PBS.
      NOTE: Plus long temps d'incubation vont conduire à des dommages cellulaires.
   2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g et remise en suspension des cellules dans 20 ml de PBS. Passez à compter les cellules.
   3. Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 500 xg, jeter le surnageant et ajouter 500 ul de PBS. Le nombre optimal de cellules pendant l'étape de fixation est de 10 millions de cellules par 500 pi de PBS.
   4. Ajouter 13,5 ul de 37% de formaldéhyde fraîche dans chaque fraction aliquote de 500 pl de suspension cellulaire. Fixer les cellules pendant 8 minutes à température ambiante.
   5. Ajouter 57 ul de 1,25 M de glycine solution pour arrêter la fixation. Incuber pendant 5 min à température ambiante avec agitation constante par vortex doux. Travailler sur la glace partir de ce point.
   6. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
   7. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS. Jeter doucement le surnageant et garder le culot de cellules sur la glace.
2. La lyse des cellules et la chromatine cisaillement
   1. Ajouter 10 ml de glace iL1 tampons de lyse froid au culot de cellules (1 ml de tampon de lyse par million de cellules est le rapport optimal). Pipette de haut en bas plusieurs fois et incuber pendant 10 min à 4 ° C en mélangeant doucement.
   2. Centrifuger le lysat pendant 5 min à 500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant.
   3. Ajouter 10 ml de tampon de lyse froid glace iL2 aux lysats et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber les lysats pendant 10 min à 4 ° C.
   4. Centrifuger pendant 5 min à 500 g et 4 ° C et jeter le surnageant.
   5. Prepare le tampon de cisaillement complet adjonction, 200x cocktail d'inhibiteurs de protease (PIC) de la mémoire tampon de cisaillement iS1. Gardez le tampon sur la glace pendant 5 min et de travailler sur la glace par la suite. Ajouter 1 ml de la mémoire tampon complète de cisaillement iS1 à chaque 10 millions de cellules Pellet et mélanger délicatement par pipetage de haut en bas. Avant la sonification Incuber les échantillons sur de la glace pendant 10 min pour réduire la viscosité de l'échantillon.
   6. Cisaillement 300 ul de parties aliquotes de la chromatine par sonication en utilisant un sonicateur de bain d'eau pendant 2 à 3 séries de 10 cycles chacun. Un cycle se compose de 30 sec "ON" et 30 sec "OFF" sur un réglage de puissance élevée. Sinon, utilisez un dispositif pico-sonication avec un temps de sonication plus courte de 5 à 10 cycles de 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Brièvement vortex et tourner les tubes entre les pistes. Lors de l'utilisation d'autres types de sonicateurs, suivez les instructions du fabricant correspondant pour la chromatine cisaillement.
   7. Centrifuger la chromatine cisaillé à 16 000 xg pendant 10 min et collect le surnageant à être utilisé immédiatement dans l'étape IP. Alternativement, la chromatine stocker à -80 ° C pendant jusqu'à deux mois pour une utilisation future.
   8. Analyser le cisaillement efficacité de la chromatine avant l'étape d'immunoprécipitation utilisant 1-1,5% de gels d'agarose TAE ou bionalyzer. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb.

2. Faible expériences cellulaire ChIP

1. collection cellulaire et les protéines et l'ADN reticulation
   1. Cultiver les cellules HeLa-S3 à une confluence de 80% -90%. Retirez milieu de culture, laver le plat deux fois avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS), et ajouter 1x trypsine-EDTA à la plaque de culture. Incuber pendant un maximum de deux minutes pour détacher les cellules de la boîte.
      NOTE: Plus long temps d'incubation vont conduire à des dommages cellulaires.
   2. Recueillir les cellules par addition de milieu de culture de 1 ml contenant du sérum dans un tube de centrifugation de 1 ml. Compter les cellules.
   3. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. Porter le nombre de cellulesà 10 000 cellules par ml de milieu de culture pour la fixation.
   4. Ajouter 27 pi de 36,5% de formaldéhyde préparés frais dans chaque tube pour la fixation. Inverser le tube deux ou trois fois et incuber 10 min à température ambiante.
   5. Ajouter 115 ul de 1,25 M de glycine à la solution de l'échantillon, le tube inverser deux ou trois fois et incuber 5 minutes à température ambiante. Travailler sur la glace partir de ce point.
   6. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant lentement.
   7. Laver les cellules avec 1 ml de glace froide HBSS avec PIC (200x, concentration finale 1x). Inverser le tube deux ou trois fois pour remettre en suspension les cellules et centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant et garder le culot de cellules sur la glace.
2. La lyse des cellules et la chromatine cisaillement
   1. Ajouter 25 ul de tampon de lyse complet tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) par 10 000 cellules et agiter manuellement le fond du tube pour remettre en suspension les cellules. Incuber sur de la glace pendant 5 min.
   2. Ajouter 75 pi de HBSS complet (HBSS + PIC) tampon dans chaque aliquote contenant 10 000 cellules.
   3. Cisaillement aliquotes de 100 pi de 10 000 cellules par ultrasons pendant 5 séries de 5 chaque cycle. Un cycle se compose de 30 sec "ON" et 30 sec "OFF" sur le réglage haute puissance. Sinon, utilisez un dispositif pico-sonication utilisé avec un temps de sonication plus courte de cinq cycles de 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. Notez que les préparations de chromatine, des types de cellules différents et nécessitent d'ultrasons expériences d'optimisation de cisaillement distincts.
   4. Centrifugeuse la chromatine cisaillé à 14 000 g pendant 10 min à jeter l'insoluble et recueillir le surnageant à être utilisé immédiatement dans l'étape IP. Alternativement, la chromatine stocker à -80 ° C pendant jusqu'à deux mois pour une utilisation future.
   5. Analyser le cisaillement efficacité de la chromatine avant l'étape d'immunoprécipitation utilisant 1-1,5% TAE gels d'agarose oul'bionalyzer. Traiter les échantillons avec de la RNase avant l'analyse sur gel d'agarose afin d'améliorer l'évaluation visuelle de cisaillement. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb.

3. Immunoprécipitation de la chromatine et de la Bibliothèque Prep

1. Pour standards automatisé expériences ChIP
   1. Ajouter 120 ul de la puce tampon H (Chip tampon H + PIC) à 100 pi chromatine cisaillées. Utilisez 200 pi pour l'IP et de garder 2 pi à 20 pi comme échantillon d'entrée.
   2. Sélectionnez le automatisé ChIP 200 protocole ul dans l'instrument d'automatisation. Le débit du protocole est de 1 à 16 échantillons par cycle.
   3. Exécutez une expérience de ChIP automatisé utilisant, chromatine correspondant à 1-2000000 cellules, 1-2 ug d'anti-H3K79me3, le grade -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et H3K9me3 ChIP-seq des anticorps polyclonaux de lapin. Montants anticorps optimales varient selon la modification des histones et l'affinité et la specificity de l'anticorps correspondant.
      1. Utiliser des quantités égales de non-IgG de lapin immunisé comme un anticorps de contrôle d'isotype. Sinon, utilisez des perles non couchés ou anticorps bloqué spécifique contrôles de puce. Ajouter 20 pi de protéine A-perles magnétiques revêtues pour chaque réaction.
   4. Utilisez les histones automatisé ChIP-seq kit de réactifs pour effectuer des expériences de ChIP automatisés avec des anti-H3K79me3 et polyclonaux -H3K4me2. Utilisez le kit de réactifs de ChIP-seq idéales pour effectuer des expériences de puce anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3.
   5. Sélectionnez le protocole de ChIP automatisé suivant les instructions de logiciels mis en oeuvre dans l'appareil d'automatisation. Régler les paramètres expérimentaux ChIP à 4 heures pour l'étape de revêtement d'anticorps et 15 heures pour l'étape d'immunoprécipitation. L'étape de réticulation inverse a lieu dans l'instrument automatisé à 65 ° C pendant 4 heures.
   6. Purifier l'ADN réticulé inverse sur le système automatisé. Sélectionnez automated protocoles pour la purification d'ADN avec un protocole ou un kit utilisant magnétique purification d'ADN à base de perles. Éluer l'ADN dans 25 pi d'eau.
   7. Quantification de l'ADN immunoprécipité par extraction de 10% de l'ADN immunoprécipité. Le rendement en ADN immunoprécipité dépend de la qualité de la chromatine et l'anticorps, le type de cellule cible et la modification d'histone. Quantification de l'ADN en utilisant un kit de dosage selon les instructions du fabricant.
   8. Analyser la qualité de l'ADN immunoprécipité par PCR quantitative en utilisant des amorces pendant au moins une positive et une régions génomiques de contrôle négatif. Ne pas utiliser plus de 10% de l'ADN immunoprécipité total pour évaluer enrichissements puce.
      1. Préparer les réactions de qPCR. Ajouter 10 ul d'un mélange maître 2x Sybergreen qPCR, 1 ul de mélange d'amorces, 1-5 ul d'ADN immunoprécipité ou de l'entrée et de l'eau stérile jusqu'à 20 ul de volume réactionnel final. Le programme PCR quantitative comprend une étape de dénaturation initiale à 95 ° Cpendant 5-10 min selon le fournisseur de la Taq polymérase et les températures de recuit doivent être définies en fonction des amorces choisies.
   9. les protocoles de préparation de bibliothèque automatisé Utilisation compatibles avec les Illumina ChIP-seq réactifs de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce pour construire des bibliothèques utilisant à la fois l'ADN de ChIP ainsi que l'ADN d'entrée enregistré à partir de la même préparation de la chromatine. Utilisez 10-20 ng d'ADN immunoprécipité de chaque anticorps pour la préparation bibliothèque. Préparer jusqu'à 16 bibliothèques automatisées par cycle.
   10. Séquencer les bibliothèques et générer des grappes selon les instructions du fabricant Illumina. Effectuer primaire analyse bioinformatique (filtrage de cluster, appel de base, etc.) conformément à la norme Illumina pipeline, filtre et alignez le lit à la dernière assemblée du génome humain (version actuelle est GRCh38) avec l'alignement ELAND. Utilisez SICER ⁷ ou ⁸ MACS pour le pic appel et effectuer les analyses en aval de pics wième Homer ^{9, 10} ou logiciels bedtools préféré.
2. Pour nombre automatisé à faible cellulaires expériences ChIP
   1. Ajouter 120 pi de tampon de ChIP complète tC1 (Chip Buffer tC1 + PIC) à 100 pi chromatine cisaillées. Utilisez 200 pi pour l'IP et de garder 20 pi comme entrée.
   2. Sélectionnez automatisé ChIP 200 protocole ul dans le système d'automatisation. Le débit du protocole est de 1 à 16 échantillons par cycle.
   3. Exécutez une expérience de ChIP-seq automatisé utilisant des réactifs de ChIP automatisés et des anticorps de qualité ChIP optimisés pour travailler sur des quantités faibles de la chromatine. Utilisation chromatine correspondant à 10 000 cellules 100 000 cellules, et 0,5 pg d'anticorps anti-H3K27me3, 0,25 ug -H3K4me3, 0,1 ug -H3K27ac, 0,25 ug -H3K9me3 anticorps polyclonaux de lapin lapin professionnelles ChIP-seq qualité. Montants anticorps optimales varient en fonction de la modification des histones et l'affinité et la spécificité de l'anticorps correspondant.
      1. Utilisez quantité égale de rab non-immuneIgG de bits comme un anticorps de contrôle d'isotype. Sinon, utilisez des perles non couchés ou anticorps bloqué spécifique contrôles de puce. Ajouter 10 pi de protéine A-perles magnétiques revêtues pour chaque réaction.
   4. Sélectionnez le protocole de ChIP automatisé suivant les instructions de logiciels mis en oeuvre dans l'appareil d'automatisation. Régler les paramètres expérimentaux ChIP à 4 heures pour l'étape de revêtement d'anticorps et 15 heures pour l'étape d'immunoprécipitation. L'étape de réticulation inverse a lieu dans l'instrument automatisé à 65 ° C pendant 4 heures.
   5. Purifier l'ADN réticulé inverse en utilisant des colonnes de centrifugation suivant les instructions du fabricant et éluer des volumes de 6 pi à 25 pi d'eau.
   6. Quantification de l'ADN en utilisant un kit de dosage commercial. Analyser les résultats de qPCR en utilisant des amorces pour les régions de témoins positifs et négatifs pour évaluer la qualité de la puce.
   7. Utilisez un kit de préparation bibliothèque avec des réactifs de préparation de bibliothèques optimisé pour préparer des banques à faible quan d'ADNtités. Utilisez 30 pg et 300 pg de puce à ADN (correspondant à 10 000 et 100 000 cellules expériences respectivement) pour la préparation bibliothèque. Préparer bibliothèques utilisant le protocole automatisé compatible avec les réactifs de préparation bibliothèque. La bibliothèque prep débit automatisé est de 1 à 48 bibliothèques par cycle.
   8. Après la réparation des modèles d'ADN double brin extrémité, ligaturer les adaptateurs clivables tige-boucle contenant les sites d'amorce de séquençage. Après l'étape d'extension de l'ADN, amplification de l'échantillon avec la méthode d'amplification décrite haute fidélité dans la bibliothèque protocole de kit de préparation.
   9. Après amplification bibliothèque, de quantifier et de purifier les bibliothèques suivantes la bibliothèque directives du kit de préparation. On notera que la sélection de la taille, après purification ne est pas nécessaire.
   10. Séquencer les bibliothèques et générer des grappes selon les instructions du fabricant. Effectuer primaire analyse bioinformatique (filtrage de cluster, appel de base, etc.) à la suite du standpipeline de fabricant ard, filtre, et aligner les lectures à la dernière assemblée du génome humain (version actuelle est GRCh38) avec le ELAND ⁷ alignement. Utilisez SICER ⁸ ou ⁹ MACS pour le pic appel et effectuer les analyses en aval de pics avec Homer, bedtools ^10, ou ne importe quel logiciel préféré.

Figure 1. Captures d'écran du logiciel montrant comment mettre en place des expériences de ChIP automatisées sur le IP Compact-Star. Le logiciel offre la possibilité de choisir la quantité d'échantillons par cycle ainsi que pour modifier les paramètres expérimentaux clés (Anticorps revêtement, IP et lavages ) en fonction des besoins du chercheur. La procédure automatisée permet de tester différentes conditions en parallèle (par exemple, différents types et quantités d'anticorps, différents types et quantités de cellules et même différente types et quantités de billes magnétiques dans la même série. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Captures d'écran du logiciel montrant comment mettre en place la préparation de la bibliothèque automatisée pour le séquençage de prochaine génération en utilisant le kit de la bibliothèque dans le système d'automatisation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Résultats

Optimisation expériences ChIP-seq automatisés pour huit marqueurs d'histones différents

Afin de développer et de valider les protocoles de ChIP automatisés, des anticorps de qualité ChIP-seq qui étaient auparavant validés dans le manuel expériences ChIP-Seq succès (données non présentées) ont été sélectionnés. Les anticorps de qualité ChIP-seq suivants ont été choisis pour cette étude: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3. La spécificité de tous les anticorps de qualité ChIP-seq a déjà été confirmé par dot blot, des réseaux de peptides et des expériences de Western Blot (données non présentées). Pilot expériences ChIP-qPCR avec des quantités croissantes d'anticorps ont été effectués afin de déterminer la sensibilité des anticorps (figure 3). qPCR avec au moins deux positifs et deux cibles témoins négatifs ont été analysés et les profils avec enrichissements de positif plus négative cible plus élevés que quintuplé sont qualifiés pour le séquençage exper modes de. Il est important de réaliser des expériences de puce et-seq avec une haute qualité de la chromatine cisaillé. Toutes les expériences de ChIP présentés dans cette publication ont été réalisées avec la chromatine frais. Il est également possible de congeler les cellules fixées à -80 ° C et procéder à la préparation de la chromatine et de cisaillement sur un autre jour. Cependant, la chromatine préparé à partir de cellules fixées congelés peuvent se comporter différemment de la chromatine fraîchement préparés et donc des conditions de sonication peuvent avoir besoin d'être optimisé pour chaque préparation chromatine. Lorsque l'on travaille avec différents types de cellules, des tampons de cisaillement avec différentes compositions détergentes (SDS) peuvent être utilisés. Les types de cellules telles que des lignées de cellules primaires ou des cellules cultivées en suspension sont des cellules difficiles à cisaillement et nécessiteront de fortes concentrations de SDS (1%), tandis que des lignées cellulaires qui sont faciles à cisaillement telle que HeLa, il faudra concentrations de SDS faible (0,1%) dans la tampons de cisaillement.

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Figure 3. Validation des anticorps ChIP de qualité en utilisant le système d'automatisation. Puce a été effectuée avec anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3 anticorps polyclonaux de lapin sur la tonte de la chromatine 1 million de cellules HeLa-S3 en fonction des modifications des histones. Protocoles ChIP automatisés avec 200 pi volumes de travail ont été utilisés dans l'instrument d'automatisation pour des expériences de titrage d'anticorps. Des quantités d'anticorps de 1, 2, 5 et 10 mg ont été testées par expérience de puce et 2 ug IgG ont été utilisés comme contrôle négatif dans chaque expérience. Enrichissements ont été évalués par qPCR. Les résultats sont présentés en tant que% de l'entrée (la quantité relative d'ADN immunoprécipité par rapport à l'ADN d'entrée après analyse qPCR). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Après la validation et la détermination optima l quantités d'anticorps ChIP de qualité à utiliser dans le système d'automatisation, des expériences de ChIP-seq automatisés ont été effectués afin de générer des profils de séquençage pour chaque modification d'histone (Figure 4).

Profils ChIP-seq 4. histones Figure générés par des expériences de ChIP-seq automatisés. La figure montre les profils de ChIP-seq dans différentes régions génomiques pour H3K4me3, H3K9ac et H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 et H3K36me3. 4A montre la distribution de pointe le long de la complète X -chromosome et 4B la distribution dans une région de 75 kb entourant le gène de la GAPDH. 4C montre les profils de H3K27me3, H3K36me3 et H3K4me3 dans une région de 500 kb qui entoure le gène Myt1 et 4D montre la répartition des H3K9me3 dans un ZNF12 environnante 200 de la région kb.large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Histones profils épigénétiques pour six différentes modifications des histones associées à l'expression de gènes ont été générés (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 et H3K36me3). La figure 4A montre profils ChIP-Seq long du chromosome X pour les différents marqueurs d'histones. La corrélation hautement pic observé entre les profils des histones six différentes indique les capacités du système automatisé pour générer des données précises et fiables. Figure 4B, 4C et 4D montrent la répartition des pics pour les différentes modifications des histones dans les régions génomiques spécifiques.

Automatisés expériences d'immunoprécipitation de la chromatine bas pour 200 cellules

La quantité minimum de cellules qui peut être utilisé dans des expériences de ChIP dépend de la qualité de la chromatine, la specificity et la sensibilité de l'anticorps et l'abondance de la modification des histones ou de la protéine étudiée. Sélection de bons anticorps de qualité ChIP-seq est important lorsque l'on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon et la sélection de réactifs optimales et différents transporteurs améliore l'efficacité de la récupération de l'ADN et contribuer à la réussite de l'expérience de puce. Pour déterminer le montant minimum de cellules que le protocole de ChIP automatisé peut traiter, des quantités différentes de la chromatine, anticorps, et des billes magnétiques ont été testés dans le système automatisé IP-Star utilisant des réactifs de ChIP spécifiquement optimisé pour fonctionner avec de faibles quantités de la chromatine.

Tout d'abord, la chromatine de 10 000 cellules a été traité par ultrasons comme décrit dans le protocole. Les résultats ChIP ont été confirmés par PCR quantitative (figure 5A) qui montre des enrichissements significatifs avec H3K4me3 anticorps dans les régions de contrôle positif et un signal négligeable dans les régions de contrôle négatif. A titre de comparaison et la preuve de cohérence, additionadonnées de l obtenus avec H3K27ac, H3K9me3, et des anticorps H3K27me3, en utilisant 10 000 cellules est fourni.

Expériences ChIP automatisés ont été effectués alors pour démontrer les capacités du système automatisé de travailler avec de faibles quantités de cellules en utilisant le même anticorps H3K4me3. La puce automatisé bien performé, démontré par une série de dix réactions IP qui étaient reproductibles et très comparables avec les résultats ChIP manuelles (figure 5B). Expériences manuelles et automatisées ont été réalisées et les avantages des protocoles automatisés ont été observés dans une expérience à réduire la variabilité (figure 5C).

Figure 5. Optimisation des expériences puce et Auto puce sur 10 000 cellules expériences ChIP manuelles ont été effectuées sur 10 000 cellules et en utilisant 0,25 pg de H3K4me3, 0,1 pg de H3K27ac, 0,5 pg de H3K9me3 et 0,25 ug d'anticorps H3K27me3. Des quantités identiques de l'IgG de lapin ont été utilisés comme contrôle. La PCR quantitative a été réalisée avec des amorces pour les deux loci positif et deux loci négatif pour chaque test de la puce. La figure 5A montre la récupération, exprimée en pourcentage de l'entrée (la quantité relative d'ADN immunoprécipité par rapport à l'ADN d'entrée après analyse qPCR). La figure 5B montre 10 réactions ChIP se exécutent sur le IP-Star Compact à l'aide 0,25 pg H3K4me3 anticorps polyclonaux et 0,25 pg d'IgG de lapin anticorps de contrôle négatif. Puis l'analyse qPCR a été réalisée avec des amorces pour le promoteur positif loci EIF4A2 et GAPDH TSS et de la myoglobine loci négative exon2 et Sat2. La figure montre la récupération, exprimé en pour cent de l'entrée (quantité relative d'ADN immunoprécipité par rapport à l'ADN d'entrée après analyse qPCR). La figure 5C montre les données H3K4me3 puce 10 manuelles expériences de jetons par rapport aux 10 expériences de ChIP automatisés. Les barres d'erreur représentent s TANDARD écarts de chacun des dix répétitions. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Afin de comprendre la sensibilité des protocoles de ChIP automatisés, des expériences ont été réalisées en utilisant une quantité de cellules qui variait de 100 000 à 200 cellules vers le bas par IP. L'anticorps anti-H3K27me3 a été utilisé en tant que ce est une modification d'histone très commun. L'utilisation d'autres anticorps histones ou non histones cellules peut nécessiter plus ou moins, en fonction de l'abondance de l'épitope et la qualité de l'anticorps. Les expériences ont été validés par PCR quantitative et il a été observé que, en réduisant les montants de perles et anticorps fond dans les expériences est réduite permettant résultats ChIP-qPCR fructueuses avec aussi peu que 200 cellules anticorps (figure 6).

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Figure 6. automatisé tests de puce sur 200 cellules. Cellules HeLa-S3 et anticorps dirigés contre H3K27me3. Chromatine a été cisaillé à partir de 1 million de cellules et des dilutions en série de cette chromatine (de 100 000 à 200 équivalent cellulaire) ont été utilisés par la réaction de la puce. 1 pg de H3K27me3 et 10 pi de protéines billes magnétiques A enduit ont été utilisés sur l'expérience 100 000 cellules, 0,5 pg de H3K27me3 et 10 ul de billes sur 10 000 et 1 000 cellules, et 0,25 pg de H3K27me3 et 5 pi de perles avec 500 et 200 cellules. 1 ug et 0,5 ug d'IgG de lapin ont été utilisés comme anticorps témoin négatif lors de la réalisation des expériences avec 100 000 cellules et 1 000 cellules, respectivement. La figure 6A représente le taux d'occupation des gènes TSH2B et GAPDH en% par rapport à l'entrée. La figure 6B montre occupation relative des TSH2B par rapport au contrôle GAPDH négatif région génomique.

L'analyse en aval des résultats ChIP-Seq10 000 cellules

Afin d'évaluer la qualité globale des expériences automatisé ChIP-seq avec un faible nombre de départ de cellules, automatisées essais ChIP-seq ont été effectuées avec 0,25 pg de l'anticorps H3K4me3 sur 10 000 cellules HeLa et des expériences de puce sur 100 000 cellules HeLa-S3 ont été utilisés comme témoin positif pour l'expérience. Les bibliothèques automatisées ont été préparés en utilisant la bibliothèque Microplex kit de préparation des réactifs adaptés aux bibliothèques préparés avec des quantités faibles d'ADN. Notez que même si il est possible d'effectuer puce expériences réussies automatisés avec moins de 10 000 cellules, les quantités d'ADN tiré vers le bas ne sera pas suffisant pour préparer les bibliothèques en utilisant les réactifs du kit. Génération de cluster et le séquençage ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant. La bioinformatique analyses après les résultats exceptionnels séquençage montrent des échantillons de copeaux faible nombre de cellules. L'ensemble de données de 30 pg (à 10 000 cellules de matière de départ correspondante ) Contiennent un faible bruit de fond et des pics d'enrichissement très fiables qui sont confirmés à la fois par le pg ensemble de données 300 (correspondant à 100 000 cellules de la matière de départ) et l'ensemble de données H3K4me3 généré par le Broad Institute pour le projet ENCODE qui a été utilisé comme une référence externe. Il est important de noter le rapport des données 40 de chevauchement Haut, qui se réfère à une méthode standard utilisée dans le projet ENCODE ^11, dans lequel la puce-seq est considéré comme reproductible si la comparaison de deux ensembles de données il ya au moins un chevauchement des meilleurs 40% 80% des pics selon leur indice de pointage de signification. L'ensemble de données de 30 pg répond à ces critères par rapport à la fois à l'ensemble de données pg 300 (compte tenu de toutes ses sommets, et pas seulement le meilleur 40%) et les données Broad Institute (tableau 1). L'ensemble de données de 300 pg montre des pics presque identiques aux données Broad Institute avec un Top 40 taux de recouvrement de 98% (figure 7).

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Figure 7. essais de puce et génération bibliothèque sur 10 000 cellules expériences ChIP-Seq ont été générées sur 10 000 et 100 000 cellules HeLa-S3 utilisant un anticorps H3K4me3 (0,25 ug / ul). Les 35 balises pb ont été cartographiés au génome humain avec l'alignement ELAND. Durant le pic ultérieure appelant SICER pourrait identifier de manière fiable les enrichissements du faible nombre de cellules ainsi que des millions de cellules. Les ensembles de données ont été analysées et comparées entre elles et avec les données de référence produites par le Broad Institute. Les échantillons de cellules faibles sont conformes et ont de très grande similarité. L'échantillon de 30 pg remplit les critères ENCODE ¹¹ (min. 80% du top 40% des pics doit chevaucher). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1.

Discussion

Immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage est maintenant une procédure standard. Voici un protocole de ChIP-seq automatisé qui peut générer des profils épigénétiques de la chromatine avec aussi peu que 10 000 cellules de matériau de départ est présenté.

Automatisation puce et préparation de la bibliothèque des essais permet la standardisation de la procédure d'optimisation de la puce et de réduire la variabilité expérimentale. Le système de manipulation de liquides présentée ici élimine bon nombre des procédures manuelles associées avec puce réduire les mains sur le temps de seulement 30 min, minimise la perte échantillon et permet précise ChIP-seq avec seulement quelques picogrammes d'entrée bibliothèque. Afin de réaliser des expériences de ChIP-seq automatisés succès, il est également crucial d'utiliser des préparations de la chromatine cisaillées de haute qualité et des anticorps de qualité puce suivants dans chaque expérience Le système utilise la technologie à base de billes magnétiques et offre une flexibilité de changer principaux paramètres expérimentaux tels que l'incubation temps pour la couche d'anticorpsING et étapes d'immunoprécipitation ou la modification des conditions de lavage permettant au chercheur de mener toutes les expériences nécessaires pour l'optimisation de ChIP-seq. Le système automatisé est une plate-forme «ouverte» qui permet également de comparer plusieurs réactifs en parallèle pour l'optimisation des conditions expérimentales pour chaque lignée cellulaire individuelle et anticorps et permet la comparaison directe de différents types et concentrations de la chromatine, anticorps différents et même différents types de magnétique perles.

Une des limitations du système automatisé est la nécessité d'automatiser les protocoles des volumes qui varient de 5 ul à 200 ul. Cependant, la miniaturisation des expériences dans cette plate-forme automatisée permet également la réduction des coûts dans les réactifs.

En plus des protocoles décrits dans la présente étude, le système est adaptable et automatise une variété d'autres applications basées sur des billes magnétiques, tels que une immunoprécipitation égalementnd capture de l'ADN méthyle (technologies MeDIP et MethylCap), une immunoprécipitation d'ADN hydroxylmethylated (de hMEDIP), immunoprécipitation de la chromatine séquentiel (ReChIP), immunoprécipitation ARN (ARN-IP), la conversion au bisulfite, et des essais de purification de l'ADN.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life technologies	14190-094
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-100ML
Formaldehyde 37%	Sigma	F8775-25
1.25 M Glycine Solution	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL1	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL2	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Shearing Buffer iS1	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Protease Inhibitors Mix (200x)	Diagenode	C01010130	Component of the Auto True Micro ChIP kit
HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Life technologies	14175-053
Lysis Buffer tL1	Diagenode	C01010130	Component of the Auto True Micro ChIP kit
ChIP Buffer tC1	Diagenode	C01010130	Component of the Auto True Micro ChIP kit
ideal ChIP-seq kit	Diagneode	C01010051
ChIP-Buffer H	Diagenode	C01010020	Component of the Auto Histone ChIP-seq kit
Auto Histone ChIP-seq kit	Diagenode	C01010020
Auto True Micro ChIP kit	Diagenode	C01010130
H3K79me3 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15310068
H3K27me3 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15410069
H3K4me3 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15410030
H3K4me2 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15410035
H3K9ac polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410004
H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410200
H3K36me3 polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410058
H3K9me3 polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410193
Rabbit IgG	Diagenode	C15410206
Protein-A coated paramagnetic beads	Diagenode	C01010020
Auto IPure	Diagenode	C03010010
MicroChIP DiaPure columns	Diagenode	C03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml	Diagenode	DMMLD2D100
Quant-IT dsDNA	Invitrogen	Q32854
Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA	Illumina	FC-121-3001
Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit	Illumina	IP-202-1012
MicroPlex Library Preparation Kit	Diagenode	C05010010
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
Illumina Library prep Quantification kit	Kapa Biosystems	KK4844
IP-Star Compact  Automated System	Diagenode	B03000002
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060001
Qubit system	Invitrogen	Q32857
Illumina Hiseq systems	Illumina