Méthode d&#39;évaluation des effets d&#39;une gamme de longueurs d&#39;onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif<em&gt; In Vitro</em

Résumé

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Résumé

Rouge / thérapie lumière proche infrarouge (R / NIR-LT), délivré par laser ou diode électroluminescente (LED), améliore les résultats fonctionnels et morphologiques dans une gamme de blessures du système nerveux central in vivo, peut-être en réduisant le stress oxydatif. Cependant, on a montré des effets de R / NIR-LT sur le stress oxydatif varier en fonction de la longueur d'onde ou de l'intensité de l'irradiation. Les études comparant des paramètres de traitement font défaut, en raison de l'absence de dispositifs disponibles dans le commerce qui offrent de multiples longueurs d'onde ou intensités, adaptés à débit élevé mettre en études d'optimisation in vitro. Ce protocole décrit une technique pour la livraison de la lumière dans une plage de longueurs d'onde et des intensités d'optimiser les doses thérapeutiques nécessaires pour un modèle de lésion donnée. Nous émettons l'hypothèse que de fournir un procédé de lumière, dans lequel les paramètres de longueur d'onde et d'intensité peuvent être facilement modifiés, pourrait faciliter la détermination d'une dose optimale de R / NIR-LT pour réduire les espèces réactives de l'oxygène(ROS) in vitro.

Lumière non cohérente au xénon a été filtré à travers des filtres d'interférence à bande étroite pour fournir des longueurs d'onde variables (longueurs d'onde centrales de 440, 550, 670 et 810 nm) et des fluences (8,5 x 10 ^-3 à 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ de la lumière à des cellules en culture. Sortie de lumière de l'appareil a été calibré pour émettre des doses thérapeutiques pertinentes quantiques, l'égalité de la lumière à chaque longueur d'onde. Les espèces réactives ont été détectés dans le glutamate a souligné les cellules traitées avec la lumière, en utilisant DCFH-DA et H ₂ O ₂ des colorants fluorescents sensibles.

Nous avons livré avec succès la lumière à une gamme de longueurs d'onde physiologiquement et thérapeutique et intensités pertinentes, à des cellules en culture exposées à glutamate comme un modèle de lésion du SNC. Alors que les influences de R / NIR-LT utilisées dans la présente étude n'a pas exercer un effet sur ROS généré par les cellules cultivées, la méthode de livraison lumière est applicable à d'autres systems y compris les mitochondries ou plus physiologiquement modèles de culture organotypique pertinentes isolé, et pourrait être utilisé pour évaluer les effets sur un éventail de mesures des résultats du métabolisme oxydatif.

Introduction

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont nécessaires pour une série de voies de transduction de signaux et les réactions normales du métabolisme cellulaire, y compris ceux de la neuroprotection ^1. Toutefois, lorsque le mécanisme antioxydant endogène sont incapables de contrôler la production de ROS, les cellules peuvent succomber à ^2,3 stress oxydatif. Après une lésion du SNC, les augmentations liées à la présence des ROS et le stress oxydatif sont supposés jouer un rôle important dans la progression des dommages ^{de 4,5.} Malgré le nombre important des stratégies pour atténuer le stress oxydatif qui ont été évalués, il ne existe actuellement pas de stratégie anti-oxydantes complètement efficaces, cliniquement pertinentes pour atténuer la production de ROS et le stress oxydatif associé à l'utilisation clinique après ^six neurotraumatologie. Par conséquent l'atténuation du stress oxydatif reste un objectif important pour l'intervention thérapeutique ^7.

Améliorations suiventR ing / NIR-LT ont été signalés dans un large éventail de blessures et les maladies, y compris réduction de la taille de l'infarctus du cardia, complications rénales et hépatiques pendant le diabète, la dégénérescence rétinienne, lésion du SNC et d'AVC ^8, peut-être en réduisant le stress oxydatif. Se agissant en particulier lésion du SNC, des études précliniques d'efficacité de la lumière de 670nm ont montré de bons effets dans les modèles de dégénérescence rétinienne ^9-11, des blessures de la moelle épinière ^12, la mort neuronale ^13. Les essais cliniques ont été menées pour l'âge sèche dégénérescence maculaire liée et sont actuellement en cours pour la course ^14, mais les résultats de ces essais ne semblent pas prometteuses, peut-être due à une défaillance d'employer un traitement efficace des paramètres ^15. En tant que tel, R / NIR-LT n'a pas été largement adopté dans le cadre de la pratique clinique normale dans neurotraumatologie, en dépit d'être un outil facile à administrer, non-invasive et le traitement relativement peu coûteux. Obstacles à l'application clinique comprennent le manque d'un cldébut mécanisme d'action et l'absence d'un effet de ^16,17 protocole de traitement standard compris. La littérature actuelle concernant la thérapie de lumière révèle une pléthore de variation des paramètres de traitement à l'égard de sources d'irradiation (LED ou laser), longueur d'onde (par exemple, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), la dose totale (joules d'irradiation / unité de surface), la durée (temps d'exposition), le calendrier (de l'insulte avant ou après), la fréquence de traitement et le mode de livraison (impulsion ou continu) ^8. La variabilité des paramètres de traitement entre les études rend la comparaison difficile et a contribué au scepticisme concernant l'efficacité ^16.

Par conséquent, l'optimisation de la R / NIR-LT est clairement nécessaire, avec des systèmes capables de fournir le mécanisme de criblage à haut débit nécessaire de comparer les multiples variables culture cellulaire. Cependant, il existe quelques systèmes d'éclairage disponibles dans le commerce qui peuvent fournir la flexibilité et un contrôle suffisant sur wavelength et l'intensité pour effectuer ces expériences d'optimisation. Commercialement dispositifs LED disponibles ne sont généralement pas en mesure de fournir de multiples longueurs d'onde ou intensités, entraînant enquêteurs employant plusieurs appareils LED de différents fabricants, qui peuvent varier non seulement de l'intensité, mais aussi le spectre de longueur d'onde de la lumière émise. Nous avons abordé cette question en utilisant une source de lumière au Xénon à large bande filtré à travers des filtres d'interférence à bande étroite, générant ainsi une gamme de longueurs d'onde et influences de la lumière, ce qui permet à proximité, un contrôle précis des paramètres de R / NIR-LT.

Il est important de noter que la dose thérapeutique de traitement est définie par le nombre de photons qui interagissent avec la photoacceptor (chromophore) qui, dans le cas de R / NIR-LT est postulé comme la cytochrome c oxydase (COX) ^18. énergie des photons livré varie avec la longueur d'onde; signifie doses égales de l'énergie à différentes longueurs d'onde sera comprisé des différents nombres de photons. Par conséquent, la lumière émise à partir du dispositif a été étalonné pour émettre un nombre égal de photons pour chacune des longueurs d'onde choisies à tester. Nous avons développé un système qui peut être utilisé pour délivrer R / NIR-LT à une gamme de longueurs d'onde et des intensités à des cellules in vitro et a démontré la capacité de mesurer les effets de la R livré / NIR-LT sur la production de ROS dans les cellules soumises à le stress glutamate.

Protocole

1. L'étalonnage optique: Mesure Lumière sortie

1. Pour préparer l'appareil de distribution de lumière, connecter une source de lumière à large bande (par exemple, Xenon ou une lampe de tungstène) à une alimentation appropriée. Positionner une lentille de collimation devant de la source lumineuse pour produire un faisceau collimaté de lumière. Faire passer la lumière à travers un filtre de chaleur liquide pour éliminer la majeure partie de la chaleur du faisceau lumineux. Selon l'application, focaliser le faisceau collimaté à l'ouverture d'entrée d'un guide de lumière liquide, qui prévoit la livraison plus flexible de la lumière (par exemple., Dans un incubateur).
2. A l'autre extrémité du guide de lumière liquide, positionner une seconde lentille de collimation et un support pour le brouillage et les filtres de densité neutre. Vérifiez que cet arrangement produit un endroit éclairé de façon uniforme de la lumière de la bande de fréquence et de l'intensité souhaitée.
   Remarque: La distance entre l'extrémité du guide de lumière et le plan de l'échantillon peut être nécessaire de varier en fonction dela surface qui doit être éclairée, mais aussi rappeler que la distance de l'extrémité du guide de lumière augmente, l'intensité lumineuse diminue. Dans la présente étude, cette distance est 14 cm, et donne une section transversale du faisceau qui éclaire uniformément une zone de 3x3 puits sur une plaque à 96 puits.
3. Veiller à ce que la lumière parasite de la lampe et les composants optiques associés est incapable d'atteindre l'échantillon.
4. Tournez sur le refroidisseur d'eau pour le filtre de chaleur liquide et se assurer qu'il ya échange de l'eau à travers l'enveloppe de filtre. Allumer la source de puissance de la lampe et d'attendre au moins 5 minutes pour la source de lumière à large bande à se stabiliser. Remarque: L'utilisation du refroidisseur d'eau est nécessaire pour éviter une surchauffe de l'appareil.
5. Sélectionnez un filtre d'interférence à bande étroite (généralement décrits par leur longueur d'onde centrale, de transmission de pointe et largeur à mi-hauteur (LMH) de la bande passante) pour générer la gamme d'onde d'éclairage. Remarque: Les filtres d'interférence à bande étroite utilisées dans la présente étude étaient 442 nm, 550 nm, 671 nm et 810 nm.
6. Mesurer la lumière produite par la lampe au niveau du plan où l'échantillon doit être placé pendant le traitement. Mesurer la lumière en utilisant une sonde de rayonnement calibré (cosinus collecteur) connectée à un spectroradiomètre approprié, en utilisant le logiciel de propriété selon les instructions du fabricant.
7. Utilisez des filtres de densité neutre pour régler l'intensité de la lumière jusqu'à la sortie désirée est obtenue. Remarque: Dans la présente étude, l'intensité de la lumière transmise par chaque filtre d'interférence est ajusté pour donner une sortie quantique égale à chacune des quatre bandes de fréquence de traitement. Il est important de vérifier l'étalonnage régulièrement, comme la sortie de la lampe est sujette à changement.
   Note: Après la mise en place de l'appareil, les cellules sont prêtes à être éclairée figure 1 est une représentation de l'appareil de distribution de lumière utilisée dans l'étude actuelle..

Figure 1. Image de l'appareil de distribution de lumière. Illustrated sont la source d'énergie la lumière, lampe au xénon avec logement, lentille de collimation, filtre à eau, ouverture d'entrée, guide de lumière liquide, seconde lentille de collimation, porte-filtre, cadre de traitement et mat carte noire. On notera que les filtres de longueur d'onde et d'intensité à bande étroite ne sont pas représentés.

2. Préparation des cellules

1. Le mode de livraison R / NIR-LT décrit peut être appliqué à tout type de cellule ou dans un système de modèle in vitro; ce titre, les descriptions suivantes de culture cellulaire sont générales, en utilisant des techniques bien établies de phéochromocytome de culture (PC12), Müller (RMC1) et des cellules rétiniennes mixtes primaires.
2. Avant l'ensemencement des cellules pour le traitement de lumière et à l'oxydation test de stress, la culture des cellules dans leur milieu de croissance respectif contenant des suppléments appropriés (par ex., FBS, Les antibiotiques) dans flas T75 immortaliséks jusqu'à 70-80% de confluence.
3. Détachez cellules immortalisées des flacons T75, en utilisant la méthode appropriée pour le type de cellule à tester par exemple., La trypsine. Si nécessaire, avant de procéder à l'ensemencement des cellules en plaques de 96 puits dosage, les puits des plaques de dosage de revêtement avec 10 pg / ml de poly-L-lysine pendant 1 heure (par ex., Pour des cellules PC12) ou 10 pg / ml de poly-L-lysine de 1h suivie par un O / N incubation avec 10 pg / ml de laminine (par ex., pour les cellules rétiniennes mixtes).
4. Centrifuger les cellules pour recueillir, le cas échéant (par ex., 3 min à 405 g pendant cellules PC12 ou 10 min à 218 g pendant cellules RMC1), supprimer le surnageant et remettre en suspension dans 8 ml de milieux de culture cellulaire appropriée.
5. Si les cellules rétiniennes mélangés doivent être utilisés, de préparer P0-5 ratons néonatale par digestion enzymatique (papaïne) selon les procédures établies ¹⁹
6. Comptez le nombre de cellules viables à l'exclusion de 0,4% (p / v) colorant bleu trypan, en utilisant un hémocytomètre.
7. Ajuster suc densité cellulaireh que les cellules seront d'environ 70 à 80% de confluence après 24 ou 48h dans la culture. (Pour les cellules PC12 la densité d'ensemencement est de 4,0 x 10 ⁵ cellules viables / ml, pour les cellules RMC1, elle est de 2,5 x 10 ⁵ cellules viables / ml pour les cellules rétiniennes et mixte, il est 8 x 10 ⁵ cellules viables / ml). Après l'ajout de cellules soit plaques claires ou noires à 96 puits (utilisés pour le H ₂ O ₂ ou DCFH-DA dosage respectivement), dans 100 ul de milieu de croissance approprié, permettent plaque de se asseoir sur une surface plane à 37 ° C, 5 % de CO ₂ (ou quelles que soient les conditions sont appropriées pour le type de cellule spécifique) pendant au moins 24 heures pour permettre l'adhérence des cellules.
8. cellules de la culture dans un milieu de croissance dans les 96 plateaux et appropriées jusqu'à ce qu'ils soient 70 à 80% de confluence (24h pour PC12 et les cellules RMC1, 48h pour les cellules rétiniennes mixtes).

3. Ajout glutamate Stressor aux cellules

1. Préparer monosodique d'acide concentrations hydrate de sel de stress L-glutamique de 0-10mm en pleine grossissement appropriéemilieux de culture e.
2. Retirez le support à partir des cellules et laver en douceur les cellules trois fois avec du PBS (PC12) ou HBSS (RMC1 cellules rétiniennes et mixtes). Après lavages, ajouter un milieu contenant du glutamate à un volume total de 100 pl / puits.

4. Premiers doses de traitement par la lumière

1. Immédiatement après l'addition du glutamate ou le facteur de stress de choix, exposer les cellules à un traitement de lumière aux longueurs d'onde et des intensités souhaitées en plaçant sous l'appareil de distribution de lumière préparée. Ne oubliez pas de modifier la sortie quantique du faisceau lumineux en utilisant les combinaisons établies de filtres de densité neutre en fonction de la longueur d'onde étant administré.
   Remarque: Dans les expériences actuelles, exposer les cellules à un traitement de lumière pendant 3 min maintenir la température en se reposant sur ​​un bloc C de chaleur ^{37 o} les plaques à 96 puits. La durée du traitement peut varier selon les besoins.
   1. Placez une carte noir mat sous les cellules pour empêcher la lumière reflétant dans des puits adjacents dans le 96-well bac désigné pour les autres paramètres de traitement.
2. Si un traitement est souhaité pour de plus grandes longueurs de temps, ajouter un tampon 25 mM Hepes pour maintenir le pH du milieu de culture cellulaire ou, idéalement, placer les plaques de l'appareil et de traitement dans un incubateur à concentration de CO ₂ régulée à 5% de CO _2, ou les conditions qui sont optimales pour le type de cellule spécifique.
3. Après l'achèvement du traitement par la lumière, placer les cellules sur une surface plane et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ (ou ce que les conditions sont optimales pour le type de cellule) pendant 24 heures.
   Remarque: Les doses supplémentaires de R / NIR-LT peuvent être administrés de la manière décrite ci-dessus, si besoin.

5. final Dosage du traitement par la lumière et la détection de ROS

1. Avant d'effectuer le tour final du traitement par la lumière, préparer les réactifs à utiliser pour la détection ROS. Préparer du tampon de citrate 50 mM (pH 6,0 de), le Triton X100, et H ₂ O ₂ réactif de détection de travailsolution (1: 2: 97 rapport de 10 mM de H ₂ O ₂ la détection solution mère de réactif; 10 U / ml peroxydase de raifort; citrate de sodium 50 mM (pH 6,0)). Préparer DCFH-DA à une concentration finale de 100 microns dans les médias appropriés.
   Remarque: Réactif DCFH-DA pour les cellules PC12 est en milieu RPMI, réactif DCFH-DA pour les cellules RMC1 est en milieu DMEM. Notez que des réactifs de détection disponibles dans le commerce ont des sensibilités différentielles pour ROS spécifique et les réactifs doivent être choisis avec soin pour fournir l'information désirée pour une application particulière.
2. Administrer un traitement de lumière pour les cellules, comme décrit dans l'étape 4.1-4.1.2. Se assurer que les cellules sont traitées avec les influences / longueurs d'onde désirées de lumière.
3. Immédiatement après traitement par la lumière, retirez le support contenant le glutamate et laver deux fois avec une solution tampon appropriée (pour les cellules PC12, PBS est utilisé pour les cellules et RMC1, HBSS est utilisé). Effectuez les tests ROS sur les cellules comme suit:
   1. H ₂ O ₂ test: ajouter 45 ul de 50 mM de tampon de citrate (pH 6,0) et 5 ul de Triton X100 à chacun des puits. Secouer doucement les cellules sur un agitateur orbital pendant 30 secondes et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 15 min. Ajouter 50 ul de H ₂ O ₂ de la solution de travail de détection et incuber pendant 30 min à température ambiante. Mesurer la fluorescence en utilisant un lecteur de plaque avec une longueur d'onde d'excitation de 530 nm et une longueur d'onde d'émission de 480 nm.
   2. DCF essai: ajouter 100 pl de la solution 100 uM de DCFH-DA à chacun des puits et incuber pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO _2. Retirez le support contenant 100 uM DCFH-DA et laver avec une solution tampon appropriée (comme décrit ci-dessus) deux fois. Ajouter 90 pi de solution tampon et 10 pi de Triton X100 à chacun des puits et agiter doucement sur un agitateur orbital pendant 30 secondes avant le 15 minutes d'incubation à 37 ° C. Mesurer DCF fluorescence obtenue à l'aide d'un lecteur de plaque avec une longueur d'onde d'excitation de 480 nm et d'une Wavel d'émissionongueur de 530nm.
   3. Express ROS valeurs relatives à la concentration en protéine de cellules restantes dans les puits, en utilisant une trousse colorimétrique pour quantifier la concentration de protéines selon les instructions du fabricant, en se référant à une courbe standard pour calculer mg de protéine.

Résultats

La sortie de la lumière prononcé en longueur d'onde de 670 nm a été calibré en utilisant des filtres de densité neutre afin d'irradier les cellules avec une gamme de fluences englobant une dose de lumière de 670nm précédemment montré pour être bénéfique in vivo (0,3 J / cm ^{2) 20.} Comme le nombre de filtres de densité neutre devant la source de lumière accrue, l'intensité (W / m ²⁾ a diminué, ce qui permet de passer moins de lumière vers la zone cible. Le table...

Discussion

Nous avons adapté avec succès un système de distribution précise de la lumière et calibré pour fournir un mécanisme pour l'étude d'optimisation de la R / NIR-LT in vitro. Longueur d'onde et l'intensité de paramètres R / NIR-LT sont capables d'être manipulées avec précision et de manière efficace en utilisant ce système. Nous avons établi que le traitement lumière des cellules ne ont pas conduit à la mort cellulaire, bien que ROS ne ont pas été réduite au niveau des longu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B