Imagerie 3-D et de l&#39;analyse des neurones infecté<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Résumé

En utilisant ce protocole, nous avons pu coupes de cerveau l'image d'épaisseur de 160 um à partir de souris infectées par le parasite Toxoplasma gondii, qui permet la visualisation et l'analyse de la relation spatiale entre le parasite de enkyster et le neurone infecté.

Résumé

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire avec une large gamme d'hôtes, y compris les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, Toxoplasma établit une infection persistante à vie dans le cerveau. Bien que cette infection du cerveau est asymptomatique dans la plupart des personnes immunocompétentes, dans le fœtus en développement ou les personnes immunodéprimées telles que les acquis syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) des patients, cette prédilection pour et la persistance dans le cerveau peut entraîner une maladie neurologique dévastatrice. Ainsi, il est clair que l'interaction Toxoplasma cerveaux est essentielle à la maladie symptomatique produite par Toxoplasma, mais nous avons peu de compréhension de l'interaction cellulaire ou moléculaire entre les cellules du système nerveux central (SNC) et le parasite. Dans le modèle murin de la CNS Toxoplasmose il a été connu plus de 30 ans que les neurones sont les cellules dans lesquelles le parasite persiste, mais peu d'informations sont disponibles sur ce quipartie du neurone est généralement infecté (soma, dendrites, axone) et si cette relation cellulaire change entre les souches. En partie, ce manque est secondaire à la difficulté de l'imagerie et la visualisation des neurones infectés entiers d'un animal. De telles images ne nécessite généralement coupes sériées de tissu et les coutures imagées par microscopie électronique ou la microscopie confocale après immunomarquage. En combinant plusieurs techniques, le procédé décrit ici permet d'utiliser des sections épaisses (160 pm) afin d'identifier et de cellules d'image entière qui contiennent des kystes, ce qui permet la visualisation et l'analyse des différents neurones, une infection chronique à trois dimensions sans avoir recours à l'immunomarquage, microscopie électronique ou coupes sériées et les coutures. En utilisant cette technique, nous pouvons commencer à comprendre la relation cellulaire entre le parasite et le neurone infecté.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est d'obtenir des images haute résolution en trois dimensions de neurones individuels qui sont infectés par le parasite intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii.

Toxoplasma est souvent considéré comme l'un des parasites les plus réussies en raison de sa large gamme de hôte intermédiaire, qui comprend les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, après l'infection aiguë par ingestion d'aliments ou d'eau contaminés, Toxoplasma est capable de provoquer une infection persistante du SNC par la conversion de sa forme de réplication rapide (la tachyzoïte) à sa lente réplication et enkyster forme (l'bradyzoïte ). Chez les individus immunocompétents, cette infection latente CNS est pensé pour être relativement asymptomatiques, mais chez les personnes immunodéprimées comme les sidéens ou les receveurs de greffe, la recrudescence du parasite peut conduire à toxoplasmose cérébrale fatale ^1,2. En outre, des études récentes have montré que l'infection latente par Toxoplasma peut conduire à des changements de comportement chez les rongeurs ^3,4, bien que le mécanisme reste inconnu.

Étonnamment, malgré ces données soulignant l'importance de l'interaction CNS- Toxoplasma, on sait relativement peu de cette relation, en particulier au niveau cellulaire et moléculaire. La possibilité d'étudier les aspects même les plus simples de l'interaction cerveau-parasite a été entravée en partie par des limitations technologiques. Par exemple, la majeure partie du travail montre que les neurones sont les cellules dans lesquelles persistent kystes a été fait avec la microscopie électronique (EM) ^5,6. Bien EM donne haute résolution, il est temps, de main-d'œuvre, et coûteux. Immunofluorescence (IF) les essais ont été récemment utilisé en conjonction avec la microscopie confocale pour confirmer le travail effectué par EM ^7. Si les analyses sont techniquement facile à réaliser et relativement peu coûteux, mais l'utilisation de ces techniques pour undertand la relation spatiale entre le kyste et le neurone infecté nécessite la reconstruction de série, qui prend du temps, techniquement difficile, et peut conduire à la perte d'informations précieuses. Ainsi, nous avons développé une méthode qui peut être utilisé avec le modèle murin de la CNS toxoplasmose et nous permet de l'image l'ensemble des neurones infectés sans EM ou immunohistochimie (IHC). En développant une telle technique, nous pouvons commencer à explorer la relation cellulaire entre la cellule infectée et le kyste d'une manière relativement rapide et peu coûteuse.

Le procédé que nous avons développé combine les techniques actuellement disponibles pour la compensation optique et des coupes de cerveau épaisseur d'imagerie par microscopie confocale à ⁸ avec un système qui marque dans les cellules in vivo qui ont été injectées avec des protéines parasitaires ^9,10. Dans ce système, on infecte les souris Cre-rapporteurs qui expriment une protéine fluorescente verte (GFP) qu'après la recombinaison médiée par Cre ¹¹ par Toxoplasma Souches qui expriment une protéine fluorescente rouge (RFP) et se injectent la recombinase Cre dans les cellules hôtes ^9. Cette combinaison nous permet de récolter le cerveau de souris infectée après l'infection du système nerveux central est établi, couper des sections de cerveau épais, et identifier rapidement les domaines pertinents pour l'image en trouvant la DP ⁺ kystes. Il est important de noter que l'expression de la cellule hôte de la GFP dépend uniquement de l'injection de Cre par des parasites, et non sur l'infection, un certain nombre de cellules GFP ⁺ ne contiennent pas de parasites ^10. Comme l'objectif de ce protocole est de pouvoir neurones infectés images entières, l'accent est mis uniquement sur ​​la GFP ⁺ neurones qui contiennent également un appel d'offres ⁺ kyste, mais le protocole peut également être utilisé pour l'image de la GFP ⁺ / DP ^- neurones.

Une fois que le cerveau infecté est récolté et sectionnée, les sections sont rendus transparents par compensation glycérol. Régions appropriées des articles sont ensuite visualisés en microscopie confocale, alci-visualisation sans précédent de cellules hôtes infectées et les parasites enkystés dans leur intégralité. Ici, nous fournissons un protocole complet pour identifier, de compensation optiquement, et les neurones d'imagerie infectés.

Protocole

NOTE: Les souris ont été élevées et maintenues dans une pièce à température contrôlée et l'humidité de 12 h inversée cycles lumière / obscurité avec de la nourriture et de l'eau disponibles ad libitum à l'Université de l'Arizona. Des expériences ont été menées conformément aux lignes directrices et approbation du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arizona. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Les souris Cre-reporters sont sur ​​une souris C57BL / 6 de fond ¹¹ et sont disponibles dans le commerce.

1. Infection souris

REMARQUE: La méthode d'infection de la souris par Toxoplasma gondii décrit ci-dessous a été utilisé dans les études publiées antérieurement ^10-12.

1. Cultiver les souches de Toxoplasma en fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivés en haut glucose de Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml streptomycin, et 2 mM de L-glutamine (cDMEM) dans un ballon T-25 dans un incubateur à _CO2 à 5% jusqu'à ce que les parasites ont formé de grandes vacuoles parasitophores.
2. Parasites Seringue à libération par grattage des cellules du fond de la fiole et faire passer la solution résultante à travers une aiguille de calibre 25 reliée à une seringue de 3 ml deux fois à l'intérieur de la fiole puis transférer toute la solution à un boîtier de seringue 5 ml relié à une aiguille de calibre 27 qui a été placé à l'envers à l'intérieur d'un tube conique de 15 ml. Connectez le piston sur la seringue et passer la solution du parasite dans le tube conique.
3. Centrifugeuse le tube pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant puis remettre en suspension le culot dans 4-6 qualité USP ml stérile 1x tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (solution mère).
4. Chargez un hémocytomètre avec 10 pi de solution mère, attendre 5-10 minutes pour les parasites de se installer puis de compter le nombre de parasites dans les quatre coins et au centre des carrés de la grande place centrale.
5. Diluer pardes sites à taille de l'inoculum approprié de 100K / 200 ul PBS 1X puis injecter à des souris par voie intrapéritonéale (ip) avec un volume total de 200 pi.
   NOTE: Pour cette procédure, les souris ont été inoculées avec 100K de type III (CEP) ¹³ tachyzoïtes dans 200 ul PBS 1x. Lorsque infecter les souris avec d'autres souches de Toxoplasma, la concentration d'inoculum peut avoir besoin d'être ajusté pour tenir compte de niveau de virulence.

2. Perfusion et récolte du cerveau

Remarque: Ce protocole a été effectuée après l'infection 21 jours (dpi), car cela représente le point auquel le nombre de pics de kystes sont présents dans le cerveau de souris de temps, mais d'autres points dans le temps peut être utilisé. Taille, le nombre, l'emplacement, et la présence ou l'absence de kystes dépend de nombreux facteurs, y compris souche de souris, parasite type de souche ainsi que la taille de l'inoculum ^{7,14 - 17.} Les enquêteurs devront déterminer individuellement la inoculum approprié pour la souris et Toxoplassouche de ma il / elle utilise.

1. Configuration de tous les outils de récolte chirurgicales (Figure 1).
2. Pour chaque souris, préparer et garder sur la glace: 20ml seringue remplie de 0,9% de chlorure de sodium (NaCl) + 10 U / ml d'héparine dans 1x qualité USP PBS stérile (héparine / Saline); Seringue de 20 ml rempli avec 4% de paraformaldehyde (PFA); Scintillation flacon avec 15 ml 4% PFA. Pour plusieurs souris, préparer un bécher rempli de la totalité du montant de chaque solution nécessaire pour toutes les souris alors établir une seringue pleine de fraîcheur et d'une solution pour chaque perfusion.
3. Anesthésier la souris ip avec 200 pl / 25 g de poids corporel de kétamine / xylazine cocktail (24 mg / ml et 4,8 mg / ml) le jour de l'intérêt. Surveiller la souris pour le niveau de l'anesthésie en cochant pincement de l'orteil réflexe. Continuer avec le protocole qu'une seule fois la souris montre aucune réponse à une pincement de l'orteil entreprise.
   NOTE: D'autres méthodes d'anesthésie peut être utilisé tant que le niveau approprié de l'anesthésie est atteint avantle traitement de protocole.
4. Placez la souris en position couchée sur la plate-forme de mousse couverte. Epingler les quatre membres sur les pieds puis vaporiser la poitrine et l'abdomen avec 70% d'éthanol (EtOH) (figure 2A). Ajout de plusieurs serviettes en papier stériles sous la souris peut être utilisé pour aider à absorber débordement de liquides de perfusion.
5. Ascenseur peau juste en dessous du sternum avec une pince puis utilisez des ciseaux pour faire une incision. Tirez la peau pour exposer la poitrine (figure 2B).
6. Soulevez xiphoïde processus et faire une incision abdominale juste en dessous du diaphragme, exposer le foie qui est carrément disséquée du diaphragme. Faire deux incisions, l'une à gauche et une à droite à travers le diaphragme et le fond des côtes. Étendre les incisions gauche et droite d'environ 1 / 2-2 / 3 chemin jusqu'à la cage thoracique, qui est ensuite renvoyée pour ouvrir la cavité thoracique (figure 2C).
   REMARQUE: Prenez soin de ne pas couper tous les organes ou des gros vaisseaux sanguins Dusonner cette procédure car cela pourrait compromettre la qualité de la perfusion.
7. Perfuser transcardiaque avec 10-20 ml d'héparine / Saline suivie par 10 à 20 ml 4% PFA.
   NOTE: Si la perfusion est fait correctement, le foie se met du rouge à bronzer (figure 2D). Si ne pas fait correctement, les vaisseaux sanguins seront visibles (figure 2E).
8. Retournez la souris sur son abdomen, re-broches pieds pulvérisent alors à la tête et le cou avec EtOH à 70%. Soulevez la peau de la base du cou et de faire une incision. Enlever la peau pour exposer le crâne (figure 2F). Décapiter la tête au niveau des épaules. Retirez le crâne, retirez délicatement le cerveau, et le placer dans un flacon à scintillation rempli de 4% PFA (Figure 2G-H).
   NOTE: Si bien perfusé, le cerveau apparaît blanc avec pas de vaisseaux sanguins visibles (Figure 2I). Si le cerveau ne est pas bien perfusé, les vaisseaux sanguins seront visibles (Figure 2J).
9. Placez le Scintillation flacon avec le cerveau dans 4% PFA à 4 ° C pendant la nuit, couvert de la lumière. Rincer le cerveau dans la non-qualité USP 1x PBS et le transfert à un nouveau flacon de scintillation rempli de frais 1x PBS. Rangez le cerveau 1x PBS à 4 ° C, couvert de la lumière.
   REMARQUE: compensation réussie et l'imagerie a été accompli avec sections stockées dans 1x PBS pendant jusqu'à un mois, mais il est préférable de l'article le cerveau en quelques jours que le stockage prolongé dans PBS va renverser la fixation PFA et pourrait conduire à moins de images optimales . Autofluorescence et l'augmentation de flou ont été constatées dans certaines sections imagées après stockage dans 1x PBS pendant un mois ou plus.

3. cerveau sectionnement

1. Retirer le cerveau de 1x PBS et le placer dans une matrice du cerveau (figure 3A) pour permettre plus précis et coupe même à travers le cerveau. Coupez le cervelet et olfactives ampoules, se il est présent, et puis couper le cerveau coronaire en 2 ou 3 sections.
   NOTE: Découper et couper du cerveau peut être fait sans l'aide d'une matrice de cerveau. Nombre de sections découpées coronaire dépend de la distance de coupe de la Vibratome utilisé. Le cerveau peut être sectionnée dans ne importe quelle orientation, si les articles sagittal et coronal sont les plus couramment utilisés pour l'identification neuroanatomiques.
2. Fixer chaque section de cerveau sur un bloc de montage de spécimen de cyanoacrylate. Apposer un petit bloc de gel d'agarose à 5% derrière la section du cerveau de soutien (figure 3B).
   NOTE: D'autres mécanismes de soutien peuvent être utilisés, mais sans le soutien, l'Vibratome peuvent pousser sur le cerveau causant sectionnement inégale.
3. Couper le tissu dans 160 um (distance de travail de l'objectif utilisé pour l'imagerie) d'épaisseur avec des sections Vibratome la réglés à une vitesse de 4 et de l'amplitude de neuf.
   REMARQUE: Les paramètres de vitesse et l'amplitude peuvent être ajustées en fonction de la machine particulier utilisé afin d'obtenir même, sections lisses. Si les paramètres sontpas correct, le résultat peut être sections inégales, déchirure des marques de tissus ou de bavardage.
4. Recueillir des coupes de tissus dans un flacon de scintillation rempli de frais, réfrigérés 1x PBS se ils vont être réglés en moins d'une semaine. Si les sections ne vont pas être réglés dans une semaine, place des sections dans 1,5 ml microtubes remplis de solution de cryoconservation et conserver à -20 ° C.

4. compensation optique des coupes de tissus du cerveau

NOTE: Ce protocole a été modifié d'une méthode déjà publié ^huit.

1. Préparer 25%, 50%, 75% et 90% en volume / volume de glycerol dans du PBS 1x + 2% de Tween-20 (Gl / PBST).
2. Retirer sections de 1x PBS ou, en cas de cryoconservation, rincer à 1x PBS et transfert à un flacon à scintillation contenant 10 ml de 25% Gl / PBST. Lieu flacon sur un agitateur à 4 ° C, couvert de l'exposition à la lumière, pendant 12 heures.
3. Vérifiez que toutes les sections ont coulé au boTTOM du flacon. Aspirer le 25% Gl / PBST, laissant juste assez pour couvrir les sections Ensuite, remplissez le flacon avec 10 ml 50% Gl / PBST et lieu sur un agitateur à 4 ° C, couvert de l'exposition à la lumière, pendant 12 heures. Répétez ce processus pour les 75% Gl / PBST puis 90% Gl / PBST. Laissez sections dans le 90% Gl / PBST pendant 24 heures pour atteindre la compensation maximale. Au cours du processus de compensation, observer compensation optique progressive (figure 4).
   NOTE: Ce processus peut être accéléré si des solutions sont modifiées immédiatement après sections ont coulé au fond du flacon. Dans 75% et 90% des solutions, les articles ne seront pas couler tout le chemin vers le bas du flacon, mais flottent au milieu.

5. montage coupes de tissus cérébraux

1. Coupez un n ° 1,5 lamelle en 5 morceaux pour créer une entretoise. Utilisez un crayon de règle et diamanté de marquer et de briser la lamelle le long des lignes discontinues sur la figure 5A. Jeter tqu'il pièce centrale, disposer les quatre pièces extérieures sur une lame de verre clair pour créer une fenêtre, puis brosser vernis à ongles transparent sur ​​les coutures pour faire adhérer les pièces de l'entretoise à la diapositive dans la configuration correcte (figure 5B).
   NOTE: L'entretoise sera utilisé pour créer l'espace nécessaire entre la lame et la lamelle pour le montage des sections dégagées. La lamelle peut être découpé en différentes façons de créer ne importe quelle fenêtre de la taille nécessaire. Prédécoupées cales en mousse sont également disponibles dans le commerce. Pour permettre vernis à ongles pour sécher complètement, il est préférable de faire des diapos avec entretoises au moins un jour avant sections de montage.
2. sections de transfert à une diapositive à l'aide d'une pipette de transfert en plastique avec la pointe coupées. Assurez-vous de remplir environs avec 90% Gl / PBST. Abaissez délicatement une lamelle sur les sections en veillant à ne pas introduire de bulles. Excédent Gl / PBST peut être évacuée avec une lingette non pelucheux.
3. Image GFP ⁺ neurones contenant DP ⁺ Kystes de Toxoplasma gondii avec un microscope confocal immédiatement (Figure 7A-B), puis conserver les lames plat et recouvert de la lumière à 4 ° C.
   REMARQUE: Sinon, joint glisse complètement autour de tous les bords pour stocker et imagées à une date ultérieure. L'utilisation de vernis à ongles transparent pour sceller diapositive est facultative et peut rendre plus difficile à enlever lamelle si l'on devait supprimer des sections de la diapositive à une date ultérieure pour un traitement ultérieur.

6. Imaging

NOTE: Toute microscope peut être utilisé qui a la capacité d'obtenir haute résolution z-piles.

1. Après avoir initialement constaté le plan focal à 10X, changer pour un objectif 20X et parcourir la section d'identifier un kyste situé à l'intérieur d'un GFP ⁺ cellule. Centrer la région d'intérêt (ROI) dans le champ de vision.
2. Changer pour un objectif 40X. Concentrer et à travers l'ensemble du ROI pour se assurer que l'ensemble de la cellule et CYst sont visibles.
   REMARQUE: Les images ont été obtenues en utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1,30 Huile DIC M27.
3. Utilisation du logiciel d'imagerie installé, obtenir un z-pile qui comprend la totalité de la cellule avec kyste. Moyenne des paramètres utilisés pour obtenir des images sont représentées à la figure 6.
   peuvent avoir besoin d'être ajusté en fonction de chaque section enquêteurs de tissus et les capacités de microscope Réglages: NOTE.
4. Obtenir une image maximale de projection de la z-stack en définissant le nombre de projections à 1. Obtenir une vue complète de rotation en définissant le nombre de projections à 64 ans.
   REMARQUE: Les autres logiciels sont disponibles et peuvent être utilisés pour obtenir projection maximale, de rotation ainsi que d'autres points de vue des images z-stack.
5. Analyser image avec un logiciel d'analyse d'imagerie.

Résultats

Figure 7 comprend des images représentatives de deux GFP ⁺ neurones à partir de deux sections 160 um d'épaisseur différentes, ainsi que d'une mesure représentative de la distance à partir de kyste à cellule-corps de la figure 7B. Chiffres contenant kyste 7-A et B montrent que cette nouvelle protocole permet la visualisation du neurone infecté dans son intégralité. La figure 7C montre que cette technique de f...

Discussion

Étant donné que les changements cellulaires dans des cellules hôtes infectées ont été liés aux résultats de la maladie dans les infections avec d'autres organismes intracellulaires tels que le VIH, la rage, et Chlamydia ^18,19, nous avons développé une technique qui nous permettrait d'étudier les interactions intimes qui surviennent entre le CNS Cellule hôte et Toxoplasma. La méthode décrite ici atteint cet objectif en permettant l'imagerie efficace des neurones infectés chr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible