Visage axotomie des nerfs chez la souris: Un modèle pour étudier motoneurone réponse à une blessure

Résumé

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Résumé

Le but de ce protocole chirurgical est d'exposer le nerf facial, qui innerve la musculature faciale, à sa sortie du foramen stylomastoïdien et coupé ou écraser pour induire une lésion nerveuse périphérique. Avantages de cette chirurgie sont sa simplicité, haute reproductibilité, et l'absence d'effet sur les fonctions vitales ou la mobilité de la paralysie faciale ultérieure, résultant ainsi en un résultat chirurgicale relativement faibles par rapport à d'autres modèles de lésion nerveuse. Un avantage majeur de l'utilisation d'un modèle de lésion des nerfs crâniens est que les motoneurones résident dans une population relativement homogène dans le noyau moteur facial dans le pont, ce qui simplifie l'étude des corps cellulaires des neurones moteurs. En raison du caractère symétrique de l'innervation du nerf facial et le manque de diaphonie entre les noyaux moteurs du visage, l'opération peut être effectuée de manière unilatérale avec le côté unaxotomized servant de témoin interne apparié. Une variété d'analyses peut être effectuée après l'opération de culss la réponse physiologique, dont les détails sont au-delà de la portée de cet article. Par exemple, la récupération de la fonction musculaire peut servir de marqueur comportementale pour réinnervation, ou les motoneurones peut être quantifiée pour mesurer la survie des cellules. En outre, les motoneurones peuvent être capturées avec précision en utilisant la microdissection laser pour l'analyse moléculaire. Parce que l'axotomie du nerf facial est peu invasive et bien toléré, il peut être utilisé sur une grande variété de souris génétiquement modifiées. En outre, ce modèle de la chirurgie peut être utilisé pour analyser l'efficacité des traitements de lésion nerveuse périphérique. Lésion du nerf facial fournit un moyen d'enquêter non seulement les motoneurones, mais aussi les réponses du microenvironnement central et périphérique gliale, le système immunitaire, et la cible musculature. Le modèle de lésion du nerf facial est un modèle de lésion nerveuse périphérique largement acceptée qui sert comme un outil puissant pour étudier les lésions nerveuses et la régénération.

Introduction

De nombreux modèles de lésion nerveuse périphérique existent, mais celui qui se démarque pour l'étude des motoneurones est le modèle nerf facial axotomie. Le nerf facial, également connu sous le nerf crânien VII, est originaire de la protubérance et innerve les muscles de l'expression faciale ^1,2. Dans ce protocole chirurgical, le nerf facial est exposé à sa sortie du foramen stylomastoïdien et soit coupé ou écrasé. La gravité des lésions nerveuses peuvent être classés suivant les ^trois classifications Sunderland, qui différencie la blessure sur la base de l'intégrité de l'axones, endonèvre, périnèvre et épinèvre, qui sont des couches de tissus conjonctifs qui enveloppent séquentiellement autour des faisceaux d'axones. Dans la lésion par écrasement (axonotmésis), les axones sont sectionnés, mais le périnèvre et épinèvre sont préservés. Récupération fonctionnelle complète du visage écrasement du nerf se produit dans environ 11 jours parce que la gaine du nerf intacte sert de conduit dans lequel les axones repoussent ^4,5. D'D'autre part, la blessure de coupe (neurotmésis), les axones et tous les trois couches de tissu conjonctif sont coupés, et l'ensemble du nerf distal doit repousser pour restaurer la musculature innervation. Reconnexion chirurgicale de la épinèvre est souvent effectuée chez des patients humains atteints de lésions nerveuses transection, mais les résultats de récupération sont rarement optimale. Une étude plus approfondie est nécessaire pour comprendre pourquoi le nerf ne parvient pas à repousser à sa cible et quelles thérapies peut être utilisé pour améliorer et accélérer le processus de régénération.

Il ya de nombreux avantages à l'étude des lésions nerveuses en utilisant le modèle nerf facial axotomie. Tout d'abord, la procédure nerf facial axotomie est rapide, facile et hautement reproductible; et la paralysie résultante des muscles faciaux ne affecte pas les fonctions vitales et est bien toléré par l'animal. Parce que ce est un modèle de lésion du nerf crânien, l'étude des corps cellulaires des neurones moteurs est simplifiée car les motoneurones résident dans une population relativement homogène dans ee moteur visage noyau dans le pont. La population ne diffère en fonction du modèle subnucléaire dans le noyau moteur facial, comme il ya sept sous-noyaux spécifiques à chaque innervant un groupe spécifique de muscles, donc différences subnucléaires en réponse à axotomie peut influer sur les résultats ^2,6,7.

Un avantage majeur du modèle de lésion du nerf facial est que le côté unaxotomized peut servir de contrôle interne associé parce que le innervation nerveuse est très symétrique et il n'y a pas de diaphonie entre les noyaux moteurs du visage ^8. Un autre avantage de l'utilisation de ce procédé chirurgical est l'absence d'un traumatisme direct au SNC ou rupture de la barrière hémato-encéphalique ^9. Les complications telles que des saignements excessifs et l'infection sont rares à cette procédure.

Diverses analyses peuvent être effectuées pour évaluer la réponse physiologique à une lésion nerveuse. La récupération du réflexe de clignement des yeux et l'activité whiskers peut être utilisé comme un comportementalemesure de ^10,11 fonctionnelle de récupération. L'enregistrement vidéo de l'activité vibrisses est actuellement la méthode la plus puissante pour détecter récupération de nerf facial innervation ^12,13. Après l'euthanasie, l'analyse histologique du tronc cérébral peut être effectuée sur les corps cellulaires des neurones moteurs dans le noyau moteur facial. Le noyau moteur facial est subdivisée en sept sous-noyaux, chacun spécifique à certains muscles du visage, permettant pour examen différencié des réponses à une blessure ^2,6. Motoneurones du visage peuvent être comptés pour quantifier la survie cellulaire, ou immunohistochimie peuvent être utilisés pour identifier des biomarqueurs et des populations de cellules spécifiques ^14. Le noyau moteur facial peut être microdissection avec précision en utilisant capture laser pour l'analyse moléculaire de la réponse cellulaire aux lésions nerveuses ^15,16. Impacts du nerf facial axotomie peuvent être analysés dans le cortex moteur ^17,18. En outre, le nerf peut être disséqué pour étudier la dégénérescence wallérienne ¹⁹ oula régénération des axones ^20, et les muscles peuvent être retirés pour étudier jonctions neuromusculaires ^21. Le nerf facial axotomie peut également être utilisé pour étudier les cellules d'accompagnement centraux et périphériques gliales ^{22, 21} cibler la musculature et le système immunitaire de réponse de ^23. Bien que beaucoup ait été accompli dans l'étude du modèle de axotomie du nerf facial ^24, une étude plus approfondie de lésion du nerf périphérique est nécessaire parce que les lésions nerveuses est un problème important pour les patients et les traitements actuels ne parviennent pas à produire des résultats optimaux. Ce modèle est un outil puissant pour l'examen de la réponse physiologique à des lésions nerveuses et l'analyse de l'efficacité des thérapies de régénération nerveuse.

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Protocole

Toutes les procédures exécutées sont approuvés par l'École de médecine institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité Université de l'Indiana et suivent Institut national de lignes directrices de la santé.

1. Technique chirurgicale

1. Maintenir une technique aseptique lors de cette procédure en utilisant des gants stériles, des instruments et un champ opératoire stérile selon les directives du NIH ^25. Stériliser les outils avant de commencer la chirurgie par eux autoclavage (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement pour la liste complète). Utiliser un stérilisateur à billes de verre pour stériliser les outils pendant l'opération.

2. Anesthésie et préparation

1. Anesthésier la souris dans une boîte d'anesthésie avec un mélange de 0,9 L / min d'oxygène et 2,5% d'isoflurane utilisant un système de vaporisateur isoflurane vétérinaire. Assurez-vous que la souris ne répond pas à des changements dans la position du corps avant de le retirer de la boîte.
2. Appliquer une pommade ophtalmique à l'mouLes yeux de soi pour les protéger du dessèchement.
3. Mettez le débit de gaz dans la zone du cône de nez. Placez la souris carrément sur son côté gauche sur un bloc couverte chauffée avec un tampon chirurgical et papier absorbant banc avec son nez et la bouche à l'intérieur du cône. Surveiller en permanence le rythme respiratoire et le taux de la souris et ajuster les niveaux isoflurane selon les besoins (entre 2,5 à 3% d'isoflurane) pour maintenir un niveau adéquat d'anesthésie, et utiliser le pincement de l'orteil réflexe pour confirmer la sédation totale.

3. Approche chirurgicale

1. Aligner et concentrer le stéréoscope avec le champ opératoire. Ajuster le cône de nez et la bande vers le bas de sorte qu'il est positionné le long du bord du champ visuel.
2. Avec la souris couché sur le côté gauche, la bande du bord de l'oreille droite à le cône de nez, exposant la zone située derrière l'oreille où l'incision sera faite. Assurez-vous que la veine auriculaire postérieure se déplace horizontalement à travers l'oreille. Notez que le placement correct de til animale et enregistrement de l'oreille sont cruciales afin de trouver rapidement le nerf facial.
3. Mouiller la fourrure sur et derrière l'oreille avec 70% d'éthanol et de se raser le site chirurgical aide d'un rasoir ou un scalpel lame. Prémouillage la fourrure facilite le rasage à cet endroit anatomique.
4. Nettoyer la peau avec une solution d'iode, telles que le lavage chirurgical Betadine (7,5% de povidone-iode), suivie de 70% d'éthanol. Répéter ce nettoyage deux fois plus pour désinfecter soigneusement la zone.
5. Pour déterminer où faire l'incision, oligo la veine auriculaire postérieure de l'oreille caudale vers la zone postérieure de la protubérance de l'oreille. Avec des ciseaux de printemps, faire une incision de 4 mm 2 - 3 mm en arrière à la protubérance.
6. Disséquer par la graisse sous-cutanée et le fascia utilisant dissection. Evitez de couper direct avec les ciseaux, car les vaisseaux sanguins ou les tissus musculaires peuvent être facilement endommagés.
7. En cas de saignement, appliquer une pression sur le site chirurgical avec un coton-tige stérilependant au moins 30 sec. Si la perte de liquide importante se produit, injecter la souris par voie intraperitoneale avec 0,5 ml de solution saline stérile à 0,9% en utilisant une aiguille G 25 ou 27.
8. Utilisez plusieurs sites clés, le nerf spinal, canal de l'oreille, et antérieure digastrique (décrit ci-dessous), pour localiser le nerf facial. Disséquer autour de ces sites jusqu'à ce que les branches du nerf facial sont visualisés. Le nerf apparaît comme une structure solide blanc importante quand il se est révélé et une couche de fascia adhère à des structures sous-jacentes.
   1. Trouver le nerf spinal, qui se déplace de la partie caudale du crâne pour innerver le muscle trapèze, une fois que la graisse sous-cutanée et le fascia ont été disséqués. Le nerf facial est profonde du nerf spinal.
   2. Trouvez le conduit auditif cartilagineux qui ressemble blanc nacré et peut être vu rostrale du nerf facial.
   3. Trouver le ventre musculaire du muscle digastrique antérieure qui se trouve sur le dessus et caudal du nerf facial.
9. Lorsque les principales branches du nerf facial sont visualisées, les tracer le dos pour trouver leur origine du foramen stylomastoïdien. En utilisant une pince fine pointe de Dumont # 5/45 pour maintenir le site chirurgical ouvert, avancer les conseils printemps ciseaux suivants le chemin de nerf, puis déplacez la pince le dos pour garder la zone nouvellement ouverte avancée.
10. Visualisez le tronc du nerf facial avec le zygomatique, buccale et branches mandibulaires marginaux à ce point.
    REMARQUE: La branche temporelle sera trouvé plus près des foramen. Les branches nerveuses mandibulaires marginaux dans ses parties supérieure et inférieure de plus près à la mâchoire, ainsi ces branches nerveuses ne seront pas visibles à ce niveau.
    1. Si l'exécution d'une transection du nerf, de stabiliser le nerf doucement avec les pinces fines de pointe et de couper le nerf avec les ciseaux à ressort. Éviter d'appliquer trop de traction du nerf avec la pince pour empêcher avulsing le nerf partir du tronc cérébral. Pousserles souches de distance les uns des autres, ou couper et enlever une partie du nerf distale pour se assurer qu'aucun reconnexion peut se produire.
    2. Si l'exécution d'une lésion par écrasement, utiliser Dumont # 5/45 pince pour comprimer le nerf pendant 30 secondes en utilisant une pression constante pour rompre tous les axones, puis répétez cette cohue à un second angle perpendiculaire à la première place à l'écrasement. Eviter d'appliquer des quantités variables de pression pendant la cohue de 30 secondes, sinon la blessure ne sera pas uniforme entre les animaux.

4. clôture et récupération

1. Repositionner la graisse et les muscles sur les structures sous-jacentes.
2. Rapprocher les bords de l'incision et de fermer la plaie en utilisant un clip de la plaie de 7,5 mm. Sutures ou de la colle est aussi acceptable pour la fermeture des plaies. Analgésiques post-opératoires peuvent être fournis à ce moment.
3. Retirer le ruban de l'oreille de la souris. Éteignez le flux de l'isoflurane et laissez la souris pour respirer l'oxygène pur pendant 30 sec à 1 min. Place la souris dans une cage vide sans litière pour remettre de l'anesthésie.
4. Lorsque la souris est récupéré, examiner son comportement pour des signes de confirmation de la paralysie faciale. Les moustaches seront paralysés et inclinés vers la joue, le nez sera dévié, et l'œil ne clignote pas en réponse à une bouffée d'air.
5. Animaux Maison conjointement après la chirurgie si elles sont des femmes. Évitez héberge des souris conjointement parce qu'ils sont plus agressifs et ont tendance à retirer de force les clips de la plaie de leur compagnon de cage, ce qui conduit à l'infection. Fournir analgésiques post-opératoires en ce moment, si nécessaire.
6. Surveiller les souris une fois par jour pendant plusieurs jours après l'opération afin de se assurer qu'aucune infection ou d'autres complications se produisent après l'opération. Retirer des agrafes 7-10 jours après la chirurgie se ils ne sont pas tombés sur leur propre.
7. Appliquer pommade ophtalmique lubrifiante à l'œil touchée par jour pour prévenir les complications de la cornée, soit jusqu'à ce que le réflexe de clignement des yeux est rerecouverts ou jusqu'à l'euthanasie.

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Résultats

Après le nerf facial axotomie est effectuée, la perte des motoneurones survient à la suite de la blessure. Motoneurone la survie après une blessure dépend de nombreuses variables, comme le sexe, l'âge des animaux au moment de la chirurgie, et de la timepoint à laquelle les chiffres de motoneurones sont faites, et Moran et l'examen Graeber ²⁴ et Jinno et l'examen Yamada ²² fois résumer les données de survie des motoneurones. Typiquement, environ 86% des motoneurones survivent à...

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Discussion

The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.

Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo microscope	Leica	M60
Labeling tape	Fisher Scientific	15-952
Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge	Fine Science Tools	15003-08	Sterilize before use
Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm	Fine Science Tools	12040-01	Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth cross action wound clip applier 5"	George Tiemann & Co	160-910	Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips	Fine Science Tools	12029-12	Used to remove wound clip
0.9% Sodium chloride injection, USP	Hospira	0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser	Fisher Scientific	19-027132
70% Ethanol
Glass bead sterilizer