Dans injections intra-cardiaque Utero tomate-lectine sur les embryons de souris pour évaluer le flux sanguin rénal

Résumé

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Résumé

La formation et la perfusion de développer des vaisseaux sanguins rénaux (en dehors de glomérules) sont grandement sous-étudiées. Comme vasculaire développe via l'angiogenèse (qui est l'embranchement des gros vaisseaux) et la vasculogenèse (formation de novo de la cuve), des techniques de cartographie de perfusion telles que des moulages en résine, l'imagerie in vivo de l'échographie, et les micro-dissection ont été limitées à démontrer les relations intimes entre ces deux processus et les structures rénales en développement au sein de l'embryon. Ici, nous décrivons la procédure in utero intra-cardiaques marqués au FITC tomates microinjections de lectine ultrasons guidées sur des embryons de souris pour mesurer l'ontogenèse de la perfusion rénale. Tomate lectine (TL) a été perfusé dans tout l'embryon et les reins récoltés. Les tissus ont été co-colorées pour diverses structures rénaux y compris: progéniteurs néphron, les structures de néphrons, urétéral épithélium, et la vascularisation. À partir de E13.5 grands navires de gros calibre ont été perfusé, cependant périphériqueles navires sont restés unperfused. Par E15.5 et E17.5, petits vaisseaux périphériques ainsi que glomérules a commencé à devenir perfusé. Cette technique expérimentale est essentielle pour l'étude du rôle du système vasculaire et la circulation sanguine au cours du développement embryonnaire.

Introduction

Pendant le développement embryonnaire, deux processus vasculaires discrets, mais simultanées ont lieu: l'angiogenèse, le processus par lequel un navire se développe à partir d'un grand navire et vasculogenèse pré-existante, qui est une formation de novo de vaisseaux de progéniteurs endothéliaux résidentiels ^1,2. Respectivement, le premier est synonyme de flux sanguin, tandis que le second est pensé à prendre largement en l'absence de celui-ci.

Simultanée à la formation des vaisseaux sanguins, un processus cyclique et dynamique de la synthèse rénale des cellules progénitrices, la prolifération et la différenciation commence à se dérouler le jour embryonnaire 9,5 (de E9.5). À ce stade, le bourgeon urétéral (UB) envahit le dos en entourant mésenchyme métanéphrique (MM), et se poursuit jusqu'à la naissance ^3. Répétées ramification de la condensation dans UB rapidement métanéphrique bouchon mésenchyme commence la formation des unités fonctionnelles du rein, néphron. Avec chaque nouvelle génération de UB et nephron, les générations plus âgées sont déplacés dans des régions intérieures corticales et médullaires, où ils subissent ensuite encore maturation et la différenciation dans des environnements essentiellement vasculaire denses. Comme le montre Dressler et al., ^3, ce procédé est précipité par embryologique signalisation inductive, telle que la diaphonie entre UB et MM, et une myriade de facteurs extracellulaires ^6.3. Deux facteurs extracellulaires récemment étudiés dans le pancréas et les reins en développement comprennent la tension d'oxygène et la circulation sanguine ^7,8. Ce dernier sera discuté plus en détail ci-dessous en relation avec le développement du rein.

Afin d'exposer le rôle inductive que le flux sanguin peut jouer dans la différenciation néphrons des cellules progénitrices, ainsi que dans d'autres processus d'organogenèse, méthodes précises et exactes de cartographie de flux sanguin embryonnaire est impératif.

D'autres méthodes de mesurer le flux sanguin comprennent la prescription de ulimagerie trasound et de résine jette ^9,10. En conclusion, ces modes ont été montré à faire défaut en soi dans leur capacité à dévoiler simultanément juxtapositions temporelles et spatiales entre la circulation sanguine et différenciation des cellules souches. moulages en résine, par exemple, offrent un modèle valide de formation de motifs de navire dans les tissus adultes, mais dans des vaisseaux immatures, tels que les points de temps avec embryonnaires, les navires sont nettement sous-développé et qui fuit. Par conséquent, la résine jette ne parviennent pas à tenir dans les petits vaisseaux, souvent poreuse,.

Pour ces obstacles apparents, entre autres, nous avons choisi d'intégrer guidée par échographie in vivo intra-cardiaques lectine de tomate embryonnaire (TL) en micro-injections dans nos enquêtes de développement du rein. Dans cette procédure, nous utilisons une sonde à ultrasons pour guider l'aiguille d'une manière synchrone monté micropipette remplie de 2,5 pi de solution de TL dans le ventricule gauche d'embryons de souris E11.5 en des points, E13.5, E15.5 et E17.5 temps. E170,5 est le stade de développement plus tard que les aiguilles ne sont pas assez fort pour pénétrer l'embryon plus développé.

Les avantages de ce procédé de micro-injection sont abondants. microinjection guidée par échographie permet un positionnement précis d'une aiguille d'injection dans le ventricule embryonnaire gauche, l'expulsion passif et contrôlée de solution dans le cœur battant de l'animal, un minimum de dommages à cœur et les tissus environnants, et la prévention de l'insuffisance cardiaque soudaine et la mort du embryon avant la perfusion de plein-corps. Avec l'utilisation d'un TL marqué au FITC, ne importe quel système vasculaire perfusé maintiendra le marqueur le long de sa membrane apicale endothéliale. En combinaison avec l'immunohistochimie, en utilisant Pecam (CD31, plaquettes endothéliale molécule d'adhésion cellulaire) et divers autres marqueurs vasculaires, nous sommes en mesure de distinguer clairement entre les navires perfusés et ONU-perfusé, ainsi que de caractériser toute coloration anormale de tissus environnants.

Protocole

NOTE: L'Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité a approuvé toutes les expériences.

1. Préparation des instruments échographie microinjection et d'embryons

1. Mettre en place scène, montage, et la sonde (Figure 1) ainsi que les instruments chirurgicaux (figure 2). Lieu tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4) dans un bain C de réchauffement de 37 °. Remplir entièrement l'aiguille de micro-injection d'huile minérale, en utilisant une seringue ml fixée à une seconde aiguille souple 25 G, à travers sa base.
2. Fixer aiguille sur la rotation bras monter, et l'aiguille vide de la solution de l'huile minérale. Re-remplir de 2,5 pi de solution de TL. Veiller à ce que les bulles d'air sont présents au sein de l'aiguille d'injection. Tournez bras d'aiguille vers le mur, loin de la scène.
3. Anesthésier la femme enceinte dans la chambre anesthésie par perfusion continue de l'isoflurane. Quand la mère est rendu inconscient, transférer l'anesthésie au tube de nez positionné sur le caudal côté de la scène, la mère et le lieu en position couchée avec le museau dans le tube de nez pour permettre la continuation d'un état complètement anesthésiés.
4. membres de bande en angle de 45 °, ou avec les mains et les pieds reposaient et positionnés Overtop ECG onglets / de contrôle de la température. Il est important que le barrage enceinte est surveillé en permanence pour se assurer que l'anesthésie est suffisante et que dans une pommade appliquée sur les yeux pour réduire le séchage.
5. Appliquer le produit d'épilation dans le bas-ventre de la mère, essuyer doucement avec des cotons-tiges sèches, puis de nouveau avec 70% des cotons-tiges éthanol saturé de supprimer ne importe quel produit et l'excès de poils. Assurez-vous de nettoyer la peau abdominale hors de tous les cheveux sur le site de l'incision (Figure 3).
6. Effectuez une laparotomie sur la mère enceinte en utilisant des pinces et ciseaux chirurgicaux fines. Prenez soin d'éviter de couper les gros vaisseaux ou organes viscéraux. Faire la première incision droite de l'épiderme 1,5-2 cm au-dessus du vagin et continuent couper vers les côtes pour approximatEly 2-3 cm. Exposer la membrane sous-cutanée, repérez la ligne blanche ("ligne blanche") (figure 3), et une coupe parallèle à l'incision initiale, le long de la même longueur, pour exposer interne organes viscéraux et saccules utérines.

2. Extraction des embryons

1. Utilisez applicateurs de coton-tige de 6 pouces à manoeuvrer mère et embryons. Poussez doucement (ne pas forcer) sur la peau avec applicateur à manipuler premier embryon de l'ouverture de l'incision. Après extraction de la première saccule de l'embryon, doucement et lentement tirer le reste de la corne de l'utérus à travers et sur l'extérieur de la mère. Évitez de tirer intestin ou d'autres organes via une incision à ce stade.
2. Quantifier embryons et placez doucement corne utérine arrière gauche en mère. Puis commencer à placer la corne utérine droit de retour dans la mère en commençant par le plus embryon de saccule du vagin sur la corne et le déplacement vers le bas. Continuer ainsi jusqu'à ce que deux embryons restent exposés (Figure 4). Enfin, les embryons de position dans une colonne ci-dessus et parallèle à la ligne incision, en étant conscient de ne pas couper la circulation de l'utérus.
3. Placer des blocs d'argile et de la situation entre les bras et le corps, ainsi que des pattes et la queue. Veiller à ce que les surfaces d'argile sont approximativement au niveau de laparotomie. Mouiller la boîte de Pétri fenestré avec 37 ° C PBS.
4. Saisissez étendant pince de la main droite et le plat fenêtrée Petri avec la main gauche (fenestration parallèle à embryons) et porter fermé pince ~ 5 cm à travers fenestration, du haut de la boîte de Pétri. Pince complètement ouvert sans déchirer fenestration maille.
5. Manœuvrer mains au-dessus des embryons et de se concentrer vue sur les deux saccules d'embryons. Sans (ou légèrement) toucher saccules avec maillage de fenestration ou une pince, les glisser par la fente et mis boîte de Pétri sur l'abdomen de la mère. Avec des pinces encore étendues, manipuler maille fenêtrée pour asseoir sur chaque côté et à la base de chaque embryon (figure 5 ) et tirez forceps sur l'ouverture de la fente.
6. Ensuite, placez caoutchouc bleu contenant mur dans boîte de Pétri, sans pincement ou de blesser embryons (Figure 6). Assurez-vous que les blocs d'argile sont fermement équilibrage boîte de Pétri, embryon, et le mur contenant du caoutchouc. Enfin, remplissez boîte de Pétri avec 37 ° C jusqu'à ce que PBS embryons sont complètement submergés (Figure 6), tout en contrôlant les fuites au maillage fenêtrée.

3. Procédure d'injection

1. Étage inférieur d'injection avec la mère et les embryons vers le bas en utilisant le réglage de niveau Z bouton (Figure 1), puis tourner l'aiguille d'injection et le bras de montage et aligner directement avec sonde à ultrasons, avec ½ aiguille cm à gauche et sous la pointe de la sonde (Figure 7) . Poussez l'aiguille-bras (pas aiguille) 45 ° par rapport à la sonde. Veillez à ne pas frapper la pointe de l'aiguille avec la sonde de plat ou ultrasons.
2. Levez étape d'injection revenir à hauteur d'origine, avec des ultrasons probe directement au-dessus de la sonde embryons doit être légèrement submergé et dans 3-4 mm du tissu embryonnaire. Utilisez X & Y ajustement stade boutons (figure 8) de modifier la position embryon / mère / étape pour localiser systématiquement cœur battant embryonnaire.
3. Directement centre de l'écran de l'échographie observer un marqueur cible centrale noire dessinée (*). Localiser ventricule gauche (de préférence) ou atrium en utilisant les boutons de réglage de scène X & Y (Figure 8), puis augmenter ou diminuer la scène avec le bouton tournant sur ​​la scène pour positionner la cible d'injection précisément sur ​​le centre marqueur noir sur l'écran de l'échographie.
4. Utilisez X bouton de réglage de scène pour déplacer embryon vers la droite, hors de l'écran de l'échographie. Repositionner l'aiguille de microinjection et le bras en place, ½ cm de distance et 90 ° à la sonde à ultrasons (figure 7).
5. Avec microinjection montage boutons de réglage (Figure 9C-G), l'aiguille de position avec la pointe clairement alSIGNÉ avec le repère central. Ajuster l'angle d'injection (en utilisant les boutons de la figure 9C & EG), et X, Y, Z et vecteurs de micro-aiguille pour assurer pointe de l'aiguille est concentrée dans le bon plan. Rentrer aiguille de microinjection utilisant uniquement le bouton "injection" (figure 9F), attention de ne pas ajuster les autres dimensions.
6. Encore une fois, en utilisant uniquement l'X fine bouton de réglage de scène mouvement embryon de retour sous la sonde, avec la cible exactement sur la marque centrale sur l'écran de l'échographie. Assurez-vous que le ventricule gauche est maintenant exactement sur la même X, Y, et Z avion.
7. Ensuite, avec juste la "injection" bouton sur le micro-injection de montage, percer lentement embryon avec l'aiguille de microinjection et porter doucement pointe dans le ventricule gauche. Injecter la totalité des 2,5 pi de solution de TL dans le ventricule gauche ou jusqu'à ce que les avertissements sonores vides, en tenant «vide» et en tapant "remplir" une fois (Figures 2A et B). À ce momentinjection d'observer une ombre émanant de la pointe de l'aiguille qui est la TL entrant dans la chambre cardiaque (figure 10). À l'inverse, se rétracter rapidement aiguille de microinjection tournant le "injection" bouton (Figure 9F) sur la micro-injection de montage lorsque l'injection est terminée.
8. Continuer à côté embryon et répétez cette procédure pour embryons restants suivants cette série d'étapes et enfin placer les embryons finales retour dans l'abdomen de la mère. Mettez l'anesthésie à la boîte de chambre et déplacez doucement mère ici pour 15 min de temps de la dernière injection.

4. récolte embryons et analyse

1. Sacrifiez barrage par dislocation cervicale. Développez la laparotomie pour enlever facilement cornes utérines de la mère. Garder les embryons dans les utérine sac. Placez les embryons in réfrigérés PBS.
2. Disséquer embryons de l'utérus sac (si le tissu collecte nécessaires pour le génotypage) et placer le tout embryon in 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit, puis dans 30% de saccharose nuit, geler en coupe cryostat moyenne. Ensuite, couper l'cryosection et le placer sur des lames pour l'analyse immunohistochimique. Vous pouvez éventuellement utiliser des tissus pour l'ensemble de montage par déshydratation dans 100% de méthanol, après fixation dans 4% PFA.
3. Pour l'analyse immunohistochimique placer les cryosections dans PBS pour éliminer les PTOM. Puis bloquer les sections avec 10% de sérum de âne normale pendant 30 min. Puis ajouter anticorps primaire PECAM au 1: 100 dilution nuit à 4 ° C. Le lendemain, laver les lames dans PBT trois fois pendant 10 min chacun et ajouter d'âne anti rat 594 secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   NOTE: Ce est une technique très exigeantes nécessitant l'optimisation et la coordination de l'échographie et de la micro-injection. Il ya une courbe d'apprentissage très raide liés à cette technique et nécessite de quatre à six semaines d'injections encadrés avant on devient compétent.

Résultats

Formation vasculaire précède flux dans le développement de reins

Une majorité de tissu embryonnaire (y compris le rein) contient une vascularisation dense (deux unperfused et perfusé), même au début des points de temps embryonnaires. Pour mieux mesurer et analyser le flux sanguin dans le rein en développement, nous avons utilisé une méthode in utero embryonnaires micro-injections intracardiaques. Avec l'utilisation d'une haute résolution ultrasons pour identifier le coeur ...

Discussion

Microinjection anesthésie et délais

En ce qui concerne l'anesthésie de la mère, il est essentiel de maintenir constant d'air (2-3 L / min) et à faible PSI. Le débit de la sédatif doit être maintenue à environ 1,75 à 2 L / min. Simultanément, les délais dans lesquels les injections ont lieu doivent être étroitement surveillés et contrôlés pour chaque portée. Pour chaque portée de la procédure d'injection doit être maintenu sous 45 min. L'importance de ce d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10