Laboratoire de Physiologie et de démonstration: taux de filtration glomérulaire dans un Rat

Résumé

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Résumé

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

Introduction

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

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Protocole

Avant toute procédure d'animaux, les soins des animaux et l'utilisation comité institutionnel (IACUC) doit approuver le protocole. Ce protocole a été approuvé par l'Université Michigan State IACUC.

1. Préparation pré-lab de Solution FITC-inuline

1. Chaud 20 ml d'une solution saline à 70 ° C et agiter lentement à 100 mg de FITC-inuline (5 mg / ml de FITC-inuline) jusqu'à ce que toute l'inuline se dissout.
2. Solution refroidir à température ambiante et ajouter 800 mg d'albumine de sérum bovin (40 mg / ml de BSA, de la poudre lyophilisée, essentiellement globuline libre, endotoxine faible, ≥98% de pureté par électrophorèse sur gel d'agarose).
3. Filtrer la solution inuline-BSA avec du papier filtre (grade 1). Placer la solution filtrée dans une seringue de 20 ml avec un filtre seringue pointe (0,2 um) et couvrir de papier d'aluminium pour protéger de la lumière.

2. anesthésie et la chirurgie

1. Placez le rat dans une chambre d'induction rempli avec 5% d'isoflurane pour induire une anesthésie. bod d'enregistrementpoids y (250-350 g) et de placer le rat sur une plate-forme chirurgicale chauffé conçu pour maintenir 37 ° C la température du corps pendant toute l'expérience. Sécuriser doucement le rat à la plate-forme avec la bande de laboratoire sur les pattes. Maintenir l'anesthésie avec 1-2% d'isoflurane avec qualité médicale 100% O ₂ au taux de 0,8-1,0 L / min de débit d'air.
2. Insérer un cathéter conique (pointe de OD intravasculaire, 2.7f) dans l'artère fémorale pour la pression artérielle et la surveillance de la fréquence cardiaque, et le prélèvement de sang.
3. Insérer un cathéter (PE-50) dans la veine fémorale pour l'injection d'inuline. Fixez le cathéter aux tissus de soie tressée 5-O suture chirurgicale ⁶ environnante.
4. Attacher le cathéter artériel à un transducteur de pression à jauge de contrainte. Enregistrez la pression artérielle et le rythme cardiaque en utilisant le logiciel d'acquisition de données et l'affichage sur un écran d'ordinateur en temps réel. Cette technique est démontrée en détail sur la vidéo ^6.
5. Exposer la vessie par une incision sus-pubienne. Coupez un petittrou dans la pointe de la vessie et d'insérer une canule (PE-190) avec une chaleur évasées pointe intérieur de la vessie pour la collecte d'urine. Fixez la canule à la vessie avec une suture en bourse.

3. L'urine et de prélèvement sanguin

1. Placer la seringue de FITC-inuline dans une pompe à seringue avec un débit fixé de 1 ml / h pour 100 g de poids corporel (3 ml / h pour un rat pesant 300 g). Fixer la seringue au cathéter de la veine fémorale. Lancer la perfusion de l'inuline et de permettre une période d'équilibrage de 1-2 h. Gardez seringue recouverts d'une feuille de protéger de la lumière.
2. Déterminer si le taux d'écoulement de l'urine est stable et appropriée pour l'analyse de l'échantillon (20 pl / min) en recueillant un échantillon d'urine dans un flacon pré-pesé collecte pendant une période de 10 min. Déterminer le volume d'urine par gravimétrie avec une échelle numérique. Un volume d'urine pendant une période adéquate de collecte de 10 min est de 0,2 ml. Continuer à prélever des échantillons d'urine jusqu'à ce que deux collections consécutives indiquent un taux de 20 pi / m d'écoulement d'urineou plus.
3. Échantillons de pré-drogues
   1. Prélever un échantillon d'urine pendant une période de 20 min. Prélever un échantillon de sang (0,5 ml) à partir du cathéter artériel au point milieu de la période de collecte d'urine. Soyez prudent pour dégager complètement le cathéter artériel de solution saline avant de recueillir un échantillon de sang dans un flacon de collection contenant 1 U héparine. Utiliser les flacons de collecte avec des marques de volume pour faciliter la collecte de 0,5 ml de sang artériel.
   2. Rincer le cathéter artériel avec une solution saline à l'héparine (20 U / ml) pour effacer le cathéter de sang (env. 0,1 ml). La longueur du cathéter artériel doit être aussi court que possible afin de limiter le volume de solution saline à l'héparine requis pour rincer.
      Remarque: des échantillons de sang dilué produisent des calculs inexacts de DFG et l'excrétion fractionnaire de Na et K.
   3. Attendre 10 min, et répéter la collecte de l'urine une seconde pré-médicament et de l'échantillon de sang.
4. Après la collecte de deux échantillons de pré-drogue, administrer un diurétique drug, furosémide (10 mg / kg), par l'intermédiaire du cathéter artériel. Rincer le cathéter artériel avec une solution saline héparinée pour effacer le cathéter de médicament. Faire attention à empêcher l'injection d'air à travers le cathéter artériel. Notez l'heure de l'injection de furosémide.
5. Les échantillons post-médicaments: A chacun des points dans le temps 3 ci-dessous, de recueillir un échantillon d'urine pendant une période de collecte de 10 min, et un échantillon de sang (0,5 ml) au milieu de la période de collecte d'urine.
   1. Pour l'échantillon post-Drug 1 - recueillir cinq minutes après le furosémide.
   2. Pour l'échantillon post-Drug 2 - recueillir dix minutes après le furosémide.
   3. Pour l'échantillon post-Drug 3 - recueillir quinze minutes après le furosémide.
6. Lorsque tous les échantillons ont été collectés, euthanasier le rat conformément aux procédures institutionnelles par thoracotomie et l'ablation du cœur. Retirez les deux reins. Décapsuler (retirer la membrane entourant) et efface les reins à éliminer l'excès de sang. Peser les reins.

4. Analyse des échantillons

1. Mesurer tous les volumes d'échantillon d'urine par gravimétrie avec une balance numérique, et des poids records.
2. Centrifugeuse échantillons de sang entier avec une centrifugeuse de table (1800 xg) pour séparer le plasma. Transférer des échantillons de plasma de petits flacons étiquetés.
3. Analyser concentrations de Na et K dans les échantillons d'urine et de plasma avec un analyseur de sodium / potassium.
4. Mesure de FITC-inuline dans le plasma et l'urine
   1. Diluer l'urine pré-drogue (de 1: 200 à 1: 400), et l'urine post-drogue (1:10) avec un tampon HEPES (500 mM, pH 7,4).
   2. Ajouter 40 pi de pi étalon ou d'échantillon et 60 de tampon HEPES dans une plaque de 96 puits (un échantillon par puits) et de permettre à mélanger pendant 10 min tout recouvert d'une feuille d'aluminium.
   3. Générer une courbe d'étalonnage pour FITC-inuline pour des concentrations de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figure 1). Déterminer FITC-inuline fluorescence dans les échantillons et les normes en utilisant un lecteur de microplaques avec son excitations et d'émission des longueurs d'onde de 485 nm et 538, respectivement.
   4. Monter les valeurs fluorescents pour les normes à une fonction logistique analyse de régression de 4 paramter. Les paramètres de la fonction de régression sont utilisés pour calculer la concentration FITC-inuline dans des échantillons de plasma et d'urine (tableau 1).

5. Analyse post-laboratoire des résultats: Calculs

1. Calculer urine Débit (UV; ml / min): [volume d'urine recueillis (ml)] ÷ [moment de la collecte (min)]
2. Calculer débit de filtration glomérulaire (GFR; ml / min): [concentration d'inuline urine (pg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [Plasma inuline conc. (Ug / ml)]
3. Calculer la charge filtrée de sodium (pmol / min): concentration en sodium du plasma (umoles / ml) x DFG (ml / min)
4. Calculer l'excrétion de sodium Taux (U _Na V; pmol / min): la concentration de sodium dans l'urine (pmol / ml) x UV (ml / min)
5. Calculer fractionnaire excrétion de sodium (FE Na;%): [U _Na V (pmol / min)] ÷ [Charge de sodium filtré (pmol / min)] x 100
6. Calculer la charge filtrée potassium (pmol / min): Plasma concentration de potassium (umol / ml) x DFG (ml / min)
7. Calculer excrétion de potassium Taux (U _K V; pmol / min): la concentration de potassium dans l'urine (pmol / ml) x UV (ml / min)
8. Calculer fractionnaire excrétion de potassium (K FE;%): [U _K V (pmol / min)] ÷ [Charge de potassium filtrée (pmol / min)] x 100

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Résultats

Le diurétique utilisé dans la démonstration de laboratoire était furosémide qui inhibe très rapidement la réabsorption de Na et K filtré par le rein entraînant une augmentation de Na, K, et l'excrétion de l'eau dans les minutes suivant l'administration du médicament. Par son mécanisme primaire, furosémide devrait avoir des effets minimes sur GFR et la charge filtrée de Na et K, mais va augmenter le flux d'urine et l'excrétion fractionnaire de Na et K.

Les r...

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Discussion

Un marqueur approprié pour la mesure de GFR doit répondre à quatre critères: être filtré librement le glomérule, non liée aux protéines plasmatiques, et ni être absorbé ni sécrétée dans le néphron. L'inuline est un polymère de fructose qui satisfait à ces critères. En conséquence, la clairance rénale de l'inuline est considéré comme l'étalon-or pour mesurer GFR ^7. La technique démontrée représente l'approche traditionnelle de la détermination de la clairance rénale ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420