Examen de Rapid Dopamine Dynamics avec Numérisation rapide voltampérométrie cyclique cours intra-orale administration exhausteur de goût chez les rats Awake

Résumé

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

Résumé

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

Introduction

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées selon les National Institutes of Health (NIH) Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par l'institutionnel soin et l'utilisation des animaux Comité l'Université de Yale (IACUC).

Préparatifs 1) Pré-chirurgicales

1. Préparation de la solution orale
   1. Créer des solutions de 10% de saccharose et 0,005% de L-menthol dans de l'eau désionisée (pH 7,4). Conservez ces solutions dans des récipients fermés, à température ambiante, et refaire toutes les 2 semaines, pour éviter la dégradation.
2. solutions d'étalonnage de l'électrode
   1. Assurez-tampon Tris (pH 7,4) à tout moment avant l'étalonnage. La solution se compose de 12,0 mM de Tris-HCl, 140 mM de NaCl, KCl 3,25 mM, CaCl2 1,20 mM, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM de _MgCl2, et 2,00 mM de Na ₂ SO _4.
   2. Créer une solution de réserve de la dopamine 10 mM (DA; chlorhydrate de dopamine) dans l'acide perchlorique 0,1 M. L'acide perchlorique prévient l'oxydation de la dopaminee. Conserver cette solution de stock à -20 ° C et utiliser jusqu'à 6 mois. Faire plusieurs aliquotes de la solution stock de DA pour le stockage à utiliser chaque aliquote qu'une seule fois.
   3. À partir du stock mM DA 10, des solutions diluées dans un tampon Tris à des concentrations de 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, et 31,25 nM.
   4. Pour l'étalonnage de pH, préparer des solutions de tampon Tris avec le pH de 7,2, 7,3, 7,5, et 7,6. Cela permettra de fournir des solutions qui imitent des variations de pH qui peuvent survenir au cours de l'expérience in vivo.
3. Fabrication de l'électrode
   1. Par aspiration sous vide, aspirer une fibre T-650 carbone (7 um de diamètre) dans un capillaire en verre de borosilicate (longueur 10 mm, diamètre extérieur 0,6 mm, diamètre intérieur 0,4 mm).
   2. Passer capillaire en verre rempli de fibres de carbone dans un extracteur électrode verticale. Pour les paramètres initiaux, mettre le chauffage à 55,0 et désactiver l'aimant. Cependant, outre l'optimisation peut être nécessaire à la fois de chauffage et les paramètres magnétiques varient from laboratoire à.
      Remarque: L'électrode doit être d'au moins 5,5 cm de long (y compris cône) de sorte qu'il peut facilement se glisser dans le micromanipulateur et être inséré au moins 6,9 mm en dessous de la dure-mère dans le cerveau de rat. Si l'électrode est trop court, les enregistrements de partie ventrale du noyau accumbens ne seront pas réalisables. D'autre part, la longueur de l'électrode totale ne doit pas dépasser 6,5 cm sinon il sera trop long pour tenir dans le micromanipulateur.
   3. L'utilisation d'un microscope optique, couper la liaison carbone-fibre exposée afin qu'elle se prolonge au-delà de 75 à 100 um de l'extrémité de la vitre. Vérifiez que l'électrode a une très serré, à peine perceptible, l'étanchéité entre l'électrode de verre et fibre de carbone, qui va produire un minimum de bruit pendant l'enregistrement ultérieur. Jeter l'électrode si il ya des fissures visibles dans le verre ou si le sceau est lâche, ce qui est indicatif d'un joint pauvres. Pour des instructions plus détaillées, voir [12] et [13].
4. Assemblage de l'électrode dans le microromanipulator
   1. Obtenir un 3, fil de 30G qui est isolé sur la moitié de la longueur du fil et utiliser une petite brosse pour appliquer une fine couche d'argent peindre directement sur le fil. Immédiatement après l'application de peinture argentée, insérer le fil dans le trou sur le dessus de l'électrode pour fournir une connexion physique et électrique avec la fibre de carbone. Sous un microscope, veiller à ce que le fil d'argent en contact avec la fibre de carbone.
   2. Fixez le fil d'argent et électrode à l'aide micromanipulateur thermorétractable.
   3. Placer l'électrode en fibre de carbone préparé dans l'alcool isopropylique purifié (IPA) pendant au moins 10 minutes pour nettoyer la surface de l'électrode et pour augmenter la sensibilité à la suite de la dopamine. Après le trempage dans de l'IPA, rincer la fibre de carbone avec de l'eau du robinet pour enlever l'IPA.
5. Référence fabrication de l'électrode
   1. Prenez un fil de 13 mm contenant de l'argent une participation d'environ 6 mm Ag / Ag Cl maille (7 mm fil d'argent seul, 6 mm mesh, 0,4 mm de diamètre),couper la partie d'argent vers le bas pour environ la moitié de sa longueur d'origine et souder la partie de l'argent du fil à une épinglette en or.
   2. Appliquez l'époxy sur la soudure sur la broche.
   3. Tremper l'Ag / Ag Cl mesh extrémité dans un copolymère de polytétrafluoroéthylène et de 5% de perfluoro-3,6-dioxa-4-méthyl-7octene-sulfonique 5 fois, avec des périodes de séchage par air 30 min entre chaque immersion.
   4. Permettre à l'enduit Ag / Ag Cl maille sécher à l'air O / N.
   5. Cure au four à 120 ° C pendant 1 h.

2) Chirurgie combinée intra et chirurgie intracrânienne Canulation (environ 75 min)

1. Oral fabrication de cathéter
   1. Ajouter le cathéter par voie orale, et stériliser par stérilisation à l'oxyde d'éthylène, au moins 10 jours avant la chirurgie.
   2. Couper PE 100 tube dans 6 cm de long segments.
   3. L'utilisation d'un fer à souder, faire fondre une extrémité du tube de PE et immédiatement presser contre une surface solide pour refroidir le tuyau en PE. Le résultat devrait créerun petit disque plat à une extrémité de la tubulure PE et ne doit pas être bridé. Utiliser une aiguille (18 G) ou pousser la broche pour créer un trou dans le centre de ce disque.
   4. À l'autre extrémité du tube de PE, insérer confortablement l'extrémité émoussée d'une aiguille G 18 dans le tube.
   5. Utiliser une perforatrice de papier standard, punch plusieurs pièces circulaires d'une feuille de polytétrafluoroéthylène (3,18 mm d'épaisseur, 6 mm de diamètre) pour créer les rondelles de polytétrafluoroéthylène.
   6. Créer un trou dans le centre de la rondelle. Prenez l'aiguille fixée sur le tube PE et poussez-le à travers la rondelle. Une fois que l'aiguille est à travers, faire glisser la rondelle vers le bas du tube de PE de sorte qu'il soit à plat contre la rondelle.
2. Chirurgie buccale
   1. Après la stérilisation des outils chirurgicaux, la canule (coupé à 2,5 mm en dessous du socle avant stérilisation), et l'électrode de référence, anesthésier le rat par une injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
      1. After 5 min, appliquer un test de stimulus nociceptif (de pied ou pincement de la queue) pour évaluer le niveau de l'anesthésie. Si le sujet montre aucune réaction physique à l'épreuve de stimulus nociceptif (flancher réponse, augmentation de la fréquence respiratoire ou cardiaque), administrer un coup de pouce de la kétamine de 10% à 15% de la dose initiale et répétez le protocole de stimulus nociceptif ci-dessus.
   2. Après le rat est totalement anesthésié et ne montre aucune réaction au test de stimulus nociceptif, utiliser tondeuses animales de se raser la fourrure du rat des yeux à environ 2 mm derrière les oreilles. Ensuite, placez le rat sur un coussin chauffant de recirculation de l'eau mince pour maintenir la température du corps pendant la chirurgie. Appliquer un lubrifiant oculaire. Administrer le médicament non stéroïdien anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), carprofène (5 mg / kg), par injection intraperitoneale avant d'effectuer des incisions et avant l'insertion de canules intra-orales. Utiliser une technique aseptique en tout temps.
   3. Appliquer la bétadine suivie par 70% d'éthanol pour nettoyer la peau. Répétez 3 fois.
   4. PlaCE du rat sur son dos, et d'ouvrir la bouche en utilisant un coton-tige stérile. Trouver la première molaire supérieure.
   5. Insérez l'aiguille dans le tissu entre la joue et la première molaire supérieure jusqu'à ce que l'aiguille sort juste derrière et médiale pour les oreilles.
   6. Pierce l'aiguille à travers la peau jusqu'à ce que le tube de PE sort de la peau et est accessible.
   7. Tirez sur la canule (préhension par la canule elle-même et non de l'aiguille) et fixer la rondelle de polytétrafluoroéthylène dans les molaires sorte que le cathéter reste en place.
      REMARQUE: La coupe de la rondelle en forme de trapèze et la sécurisation contre les molaires avec le côté plat vers la joue rend cette étape plus facile.
   8. Prenez un autre polytétrafluoroéthylène rondelle et faites-le glisser sur l'aiguille exposée, sur le tube en plastique, et buter contre l'incision.
   9. Pour sécuriser la rondelle de polytétrafluoroéthylène, utilisez du ruban stérilisé pour créer un "drapeau" triangulaire sorte que la rondelle ne glisse pas. Fixez le lavageer contre la peau du rat et de la bande stérilisée.
   10. Couper le cathéter exposé pour permettre à 2-4 cm de tube d'être exposée au-dessus de la tête du rat.
   11. Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.10 pour l'autre côté de la bouche.
3. La chirurgie intracrânienne pour voltammetry
   1. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique et nettoyer le cuir chevelu de l'animal à l'aide d'un gommage deux de scène (un gommage de la bétadine suivi d'un gommage d'éthanol à 70%, jouer avec une répétition 3 du cycle).
   2. Utilisez stérilisés aiguilles pinces de nez et des ciseaux chirurgicaux pour couper une section de 15 x 15 mm de tissu cuir chevelu.
   3. Nettoyez délicatement la surface du crâne à l'aide stérilisés applicateurs de pointe de coton. En outre nettoyer le crâne en appliquant 2 à 3 gouttes de 3% de peroxyde d'hydrogène.
   4. Utilisez une perceuse stéréotaxique de faire 3 petits (1 mm de diamètre) trous dans le crâne pour l'insertion ultérieure de vis, 1 trou pour la canule de guidage, 1 trou pour l'électrode de stimulation, et 1 trou pour les élus de référencerode.
   5. Pour les enregistrements dans le noyau NAc, positionner la canule de guidage à 1,2 mm et 1,4 mm antérieure latérale Bregma. Abaisser le dispositif de canule jusqu'à ce que la base en plastique est aligné avec le crâne.
   6. Placer l'électrode de référence stérilisé dans l'hémisphère controlatéral à la canule de guidage. Abaissez la référence d'environ 2 mm sous la dure-mère.
   7. Placez le électrode de stimulation à 5,2 mm et 1,0 mm postérieure latérale Bregma et réduit 8,0 mm au-dessous dure pour cibler l'aire tegmentale ventrale (ATV).
   8. Utilisez un petit tournevis chirurgical stérilisé pour fixer les vis sur le crâne. Ensuite, insérez l'électrode de référence, électrode de stimulation, et de guider la canule. Enfin, fixez tous les composants en utilisant du ciment Cranioplastic.
   9. Pour les premières 48 heures de soins post-opératoires, administrer le non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) Carprofène par injection sous-cutanée (5 mg / kg). Prévoyez au moins 1 semaine pour la récupération chirurgicale complète avant d'effectuer Voltamenregistrement métrie.
      1. Au cours de soins post-opératoires, cathéters orale quotidienne Rincer avec de l'eau. Fournir de la nourriture saturée en eau pendant 2 jours pour aider l'animal à mâcher et à manger. Assurer le suivi quotidiennement les signes potentiels de stress de la douleur (due à une infection bénigne ou déshydratation) et offrir des interventions appropriées qui sont nécessaires (y compris l'administration de fluides, l'administration topique des antiseptiques, et ou l'administration AINS Carprofène à 5 mg / kg).

3) Voltammetric Recordings dans Awake, se déplacer librement Rat

1. Abaisser l'électrode et l'acquisition d'un ensemble d'apprentissage DA.
   1. Le jour de l'expérience, vérifier la perméabilité de la canule orale en infusant 200 pi d'eau et en observant les réponses oro-faciales (pour vérifier que le rat est goûtant l'eau).
   2. Attacher le FSCV headstage chez le rat par l'insertion, l'électrode de stimulation (sur la headstage) dans la stimulation bipolaire électrode Cannula (sur le rat). Ainsi, la headstage (miniaturisé convertisseur courant-tension) se connecte directement à la stimulation de l'électrode bipolaire.
   3. Retirer la canule factice à partir de l'appareil de canule et appliquer deux gouttes d'une solution d'héparine à 50% dans la canule. Ensuite, insérer doucement une canule factice (un peu plus longue que la canule fictive qui a été précédemment retiré) pour effacer les caillots de sang ou de la cicatrisation gliale qui se sont produites, qui briseront électrodes en fibre de carbone qui seront ensuite insérées pendant l'expérience. Elargir la canule utilisée pour dédouaner caillots 3-4 mm en dessous du crâne (au moins 2 mm au-dessus du site d'enregistrement).
   4. Insérez le micromanipulateur, avec l'électrode, dans la canule de guidage et de placer la bague oméga dans une position "verrouillée".
   5. Connectez le fil de l'électrode de référence de la headstage à la broche appropriée. Ensuite connecter le fil de travail de l'électrode du micromanipulateur au fil approprié sur le headstage.
   6. Abaisser les electrode à environ 4-4,5 mm en dessous de crâne.
   7. Utilisez un potentiostat pour appliquer une forme d'onde triangulaire (400 V / s, de -0,4 à 1,3 V). Appliquer la forme d'onde à l'électrode à 60 Hz pendant au moins 10 min, puis modifiez la fréquence d'application de forme d'onde à 10 Hz pour les enregistrements expérimentaux ultérieurs.
      Remarque: L'application de forme d'onde étape 60 Hz produit une surface de fibre de carbone stable et aidera à prévenir la dérive électrique
   8. Appliquer une stimulation électrique au VTA utilisant des fréquences différentes (de 10 à 60 Hz) des impulsions (10 à 30 impulsions) et des courants (50 à 150 uA), toutes avec une largeur d'impulsion de 2 ms / phase d'évoquer différentes concentrations de la libération de DA et le pH changements. Acquérir au moins 5 concentrations différentes de la libération de DA et 5 variations de pH différentes. Attendre (2 - 3 min minimum) entre les stimulations pour permettre le rechargement vésiculaire [14].
      Remarque: Il est important d'obtenir des stimulations qui produisent des concentrations DA sur toute la gamme qui seront recueillies au cours de la suiteexpérience, car ils seront utilisés comme un ensemble de formation pour l'analyse en composante principale (voir rubrique 5.1).
   9. Abaisser l'électrode dans le noyau NAc (6,3 mm ventral Dura). Par la suite abaisser l'électrode à 100 um incréments au sein du noyau jusqu'à ce que NAc DA événements de relâchement transitoire sont observées à des fréquences d'au moins 1 par minute.
   10. Connecter le tube (diamètre intérieur 1/32 ', diamètre extérieur 3/32 ") pour une seringue de 20 ml, relié à une pompe à seringue. À l'autre extrémité du tube, en utilisant une aiguille 23 G biseauté pour raccorder le tube à la canule du rat. Assurez-vous que le tube est complètement rempli de l'exhausteur de goût désiré et vérifier qu'aucune bulle existent dans le tube.
       Remarque: En règle générale, d'administrer une petite quantité d'exhausteur de goût dans la bouche du rat avant l'enregistrement de sorte que le premier enregistrement pour perfusion délivre la totalité de perfusion et pas d'eau ou de l'air résiduel dans le tube. En outre, cela permet à l'animal de l'esprit d'avoir une certaine expérience préalableh l'exhausteur de goût depuis nouveaux sapides, même ceux appétitives, peut être aversif d'abord en raison de sa nouveauté.
   11. Pour la collecte des données, infuser 200 pi d'exhausteur de goût (6,5 sec à l'aide d'une pompe et de tubes décrit précédemment). Infuser l'exhausteur de goût tous les 1-3 min. Infuser un total de 25 fois par exhausteur de goût. Chaque perfusion délivre 200 pi de solution.
   12. Si plusieurs sapides sont livrés en une seule expérience, rincer le cathéter par voie orale avec de l'eau après la collecte de données pour une exhausteur de goût et d'attendre au moins 20 minutes avant la perfusion de la nouvelle exhausteur de goût.
   13. Après la session d'enregistrement DA, se préparer à la vérification histologique par la création d'une petite lésion au niveau du site d'enregistrement. Afin de préserver l'électrode en fibre de carbone pour l'étalonnage ultérieur, rétracter la première électrode et retirer le micromanipulateur. Ensuite, utilisez une nouvelle micromanipulateur avec une micro-électrode de verre et un fil de tungstène (étendant 100 um au-delà de la pointe de verre) à la même profondeur (ci-dessous dure) que le f de carbone d'originemicroélectrodes iber.
   14. Pour la vérification histologique, créer une petite lésion en appliquant 3 V au fil de tungstène et l'augmentation de la tension à 1 V par incréments, toutes les 10 secondes, jusqu'à ce que le paramètre 10 V soit atteinte.
   15. Si une courbe de concentration standard a déjà été créé en utilisant de multiples électrodes en fibres de carbone, effectuer l'étape de lésion ci-dessus (03/01/14) en appliquant directement le potentiel de l'électrode en fibre de carbone.
       Remarque: Cette méthode de lésion peut endommager la fibre de carbone et empêcher étalonnage ultérieur avec cette électrode spécifique.
   16. Euthanasier l'animal en utilisant une injection létale de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Déloger la coiffe de la canule en utilisant une pince en tirant vers le haut directement sur la coiffe. Ne tordez pas la coiffe car cela provoquera des dommages inutiles au cerveau et rendre difficile pour identifier l'emplacement de l'électrode lors de l'histologie.
       1. Retirez le cerveau et dans 4% de formol pendant 3 jours, suivie par 30% suCROSE pour 1 semaine. Créer 30 um tranches en utilisant un cryostat, monter sur des lamelles et d'examiner les tranches sous un microscope optique pour identifier l'emplacement de la fibre de carbone ou d'une lésion de tungstène.
          Remarque: Perfusion est facultative pour 3.1.17.

4) Calibrage des électrodes

1. Utilisation de la cellule d'écoulement pour créer un facteur de conversion courant-concentration.
   1. Afin de déterminer la sensibilité de l'électrode, calibrer électrodes après chaque expérience en utilisant un flux appareil "t-cellule». Abaisser l'électrode dans le "t-cellule», tandis que le tampon Tris, de pH des solutions, ou des solutions DA sont lavés sur la surface de l'électrode (à un taux de 2 ml / min). Utiliser un à six positions solénoïde d'air actionneur pour basculer entre le tampon et le pH ou la solution DA.
   2. Pour chaque étalonnage, recueillir des données voltamétriques pendant 5 sec application de tampon Tris (de base), suivie par 5 application sec de pH ou une solution DA, suivi par un 20 secpplication de tampon Tris (fichier totale de 30 sec). Répétez chaque course 3 fois pour chaque concentration étalon, contrebalançant entre les différentes concentrations de chaque norme.
   3. Pour chaque prélèvement d'échantillons, de mesurer le pic DA ou le courant de pH-évoquée. La moyenne du courant de crête dans chaque essai pour obtenir une concentration en fonction du rapport de courant de crête. Pour des instructions plus détaillées, voir [12] et [13].

5) Analyse de données

1. L'utilisation d'un ensemble d'apprentissage en analyse en composantes principales (ACP)
   Remarque: Au cours d'une expérience de voltamétrie, est produit en tant que sortie de courant, qui est le résultat de l'oxydation et de la réduction de la dopamine, des changements de pH, et le bruit électrochimique. PCA permet la séparation de ces facteurs de sorte que l'on peut isoler les composants souhaités (DA et pH) et supprimer des composants supplémentaires qui pourraient fausser les signaux souhaités (pour une description plus détaillée, voir ^{15, 16).}
   1. Attribuer un facteur d'étalonnage à THe courant de sortie (environ 5 à 10 nA / uM) pour permettre PCA après les valeurs de concentration des analytes à déterminer.
   2. Utilisez l'ensemble de la formation obtenue lors d'une expérience de «former» le modèle PCA de dissocier les DA, le pH et d'autres facteurs. PCA prend la formation mis voltammogrammes cycliques (recueillies dans la section 3.1.8) et détermine les caractéristiques essentielles du voltamogramme peuvent être utilisés pour identifier chaque analyte recueillies lors des enregistrements in vivo de voltampérométrie.
   3. Pour déterminer le nombre de composantes principales à garder, utiliser un test F Malinowski. Typiquement, ne garder que 2 ou 3 composantes principales qui expliquent normalement environ 95-99% de la variance dans les données. Pour plus de détails sur la mise en œuvre du test F Malinowski, voir ^17.
      Remarque: Une fois que le nombre de composants sont déterminées, l'analyse PCA sera effectivement projeter les voltammogrammes mesurées à partir de DA et de la formation de pH fixe sur les principaux éléments qui ont été retenus.Le résultat est un ensemble de données qui a été filtré de sorte que seule DA (ou pH) des données reste et les données résiduelle qui ne ressemble pas DA ou le pH est retirée (Voir résultats représentatifs pour la sortie attendue). Pour une explication plus détaillée et étape par étape instruction pour l'utilisation de l'APC pour l'analyse voltampérométrique voir fiche Matériaux et ^{16, 17.}

Résultats

FSCV combinée avec l'implantation du cathéter intra-orale a été utilisé pour examiner comment le saccharose, un exhausteur de goût appétit, module la libération phasique DA dans le noyau du CNA. Avant la perfusion exhausteur de goût, la stimulation électrique (150 uA, 60 Hz, 24 impulsions; indiqué par la barre rouge) de l'ADV produit de fortes hausses dans la libération phasique DA dans le NAc (Figure 1) Figure 1 montre un tracé de couleur avec potentiel sur. l'axe des ordonnée...

Discussion

Livraison intra-orale combinée avec exhausteur de goût FSCV permet l'analyse du «temps réel» des réponses DA à aromatisants oraux. Il ya trois étapes critiques dans le protocole qui sont nécessaires pour les mesures DA succès. Tout d'abord, une bonne implantation du cathéter par voie orale est essentielle pour la réalisation des aromatisants. Veiller à ce que le cathéter est inséré derrière la première molaire et coincée en place empêche le cathéter de perdre la perméabilité et empêche le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass capillary	A-M systems	624503
Carbon fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	i.e., Nafion
Silver paint	GC Electronics	22-023
Power supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air actuator	VICI	A60	6 position digital valve interface
Digital valve interface	VICI	DVI	230 VAC
Quad headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant syringe pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sodium chlroide	Sigma	S7653
Perchloric acid	Sigma	244252
Hydrochloric acid (4 M)	Sigma	54435
Soidum hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Dopamine hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page