Des mesures de haute précision Zinc isotopiques appliquées aux organes de souris

Résumé

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Résumé

Nous présentons une procédure pour mesurer avec des ratios d'isotopes de zinc de haute précision dans les organes de souris. Le zinc est composé de cinq isotopes stables ⁽⁶⁴ Zn, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn, Zn ⁶⁸ et ⁷⁰ Zn) qui sont fractionnés naturellement entre les organes de souris. Nous montrons d'abord comment dissoudre les différents organes afin de libérer les atomes de Zn; cette étape est réalisée par un mélange de HNO ₃ et H ₂ O _2. Nous purifions alors les atomes de zinc de tous les autres éléments, notamment des interférences isobariques (par exemple, NI), par chromatographie échangeuse d'anions dans un / HNO moyenne diluée de HBr _3. Ces deux premières étapes sont effectuées dans un laboratoire propre à l'aide de produits chimiques de haute pureté. Enfin, les rapports isotopiques sont mesurées en utilisant un multi-collecteur à couplage inductif plasma spectromètre de masse, en basse résolution. Les échantillons sont injectés en utilisant une chambre de pulvérisation et le fractionnement isotopique induite par le spectromètre de masse est corrected en comparant le rapport des échantillons pour le rapport d'une norme (technique de bracketing standard). Cette procédure typique pleine produit un rapport isotopique avec un 50 ppm (2 sd) reproductibilité.

Introduction

La mesure de haute précision (mieux que 100 ppm / unité de masse atomique) zinc composition en isotopes stables n'a été possible pendant environ 15 ans grâce au développement de multi-capteurs plasma source spectromètres de masse et a depuis été essentiellement appliquée dans la Terre et des sciences planétaires. Les applications dans le domaine médical sont nouveaux et ont un fort potentiel en tant que biomarqueurs pour les maladies qui modifient le métabolisme du zinc (par exemple, la maladie d'Alzheimer). Cet article présente une méthode pour mesurer avec une grande précision les ratios des isotopes stables naturels de zinc dans divers organes de la souris. La même chose pourrait être applicable à des échantillons humains. Le procédé comprend la dissolution des organes, la purification chimique de zinc par rapport au reste des atomes, et ensuite l'analyse du rapport isotopique sur un spectromètre de masse.

La qualité des mesures isotopiques de Zn est tributaire de la qualité de la purification chimique (pureté de Zn, faible échantillon viergeARED à la quantité de Zn présent dans l'échantillon, le rendement chimique élevée de la procédure) et sur le contrôle de la polarisation instrumentale. La grande pureté de la fraction Zn finale est nécessaire pour enlever les deux interférences isobares et les interférences non isobarique qui créent un effet de matrice. Nucléides isobariques créent des interférences directes (par exemple, ⁶⁴ Ni). Des interférences isobariques non génèrent l'effet dit "matrice" et modifier la précision des mesures d'analyse en modifiant l'état de l'ionisation par rapport à la norme de zinc pur à laquelle les échantillons sont comparés à ^une. Un faible vide (<10 ng) indique qu'il n'y a aucune contamination des échantillons par Zn externe qui biaiserait de la composition isotopique mesurée. Comme isotopes Zn peuvent être fractionnés au cours de la Chromatographie d'échange d'ions ^2, la collection de tous les atomes de Zn assure qu'aucun fractionnement isotopique se produit, ce qui implique que le procédé chimique doit avoir un rendement complet. Enfin, la correction du fractionnement isotopique instrumentale pendant la mesure de spectrométrie de masse se fait via la méthode "de bracketing standard".

Par conséquent, les principales difficultés pour obtenir des mesures précises sont le contrôle de la contamination externe (c.-bas blanc), la production d'une purification chimique de plein rendement qui est propre de tous les autres atomes ou de molécules, et la correction du fractionnement isotopique instrumentale sur le spectromètre de masse. Dans cet article, nous allons décrire notre protocole analytique pour séparer Zn à partir d'organes de la souris ainsi que les mesures de spectrométrie de masse.

L'extraction se fait en utilisant une faible quantité d'acides dilués (HBr / HNO ₃ de médias) sur les micro-colonnes (0,5 pi et 0,1 pi) de résine échangeuse d'anions. Il dispose d'un plein rendement et les mesures ont une reproductibilité externe supérieure à 50 ppm sur le rapport Zn ^66/64 Zn. Un autre avantage de la méthod est qu'il est très rapide. La méthode est donc très bien adaptée aux sciences médicales, dans lesquels on a besoin d'analyser un grand nombre d'échantillons par rapport aux géosciences, où ces méthodes analytiques ont été développés.

Protocole

Nota: Les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université Paris Diderot.

1. Préparation des matériaux

1. Sous-distiller ébullition 1 litre d'acides (HNO _3, HBr) afin de les purifier de l'impureté.
2. Nettoyez les béchers et pourboire adaptateur dans un chaud (~ 100 ° C) concentrés HNO ₃ bain d'acide pour au moins deux jours.
3. Laver les embouts de pipette dans un froid 3 N HNO _{3 salles} de bain pendant plusieurs jours et rincer individuellement trois fois avec de l'eau déminéralisée.

Préparation de l'échantillon 2.

1. Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de kétamine et de xylazine. Évaluer l'anesthésie par la méthode orteil de pincement.
2. Recueillir le sang par une ponction cardiaque en présence d'héparine dans 1,5 ml tubes.
3. Séparer le plasma des globules par centrifugation (10 min, 1500 x g) et transférer le plasma de polypropylene cflacons ryogenic aide des conseils de polypropylène.
4. Retirer le reste du sang à partir d'organes en coupant la veine hépatique et l'injection DPBS à travers le cœur. Évaluer la mort de la souris par dislocation cervicale.
5. Récolter les organes avec des instruments en acier inoxydable stériles, les libérer de la graisse entourant le cas échéant, et Snap-les congeler dans des flacons cryogéniques en polypropylène.

3. Chemical Purification

1. Tout d'abord, dissoudre les échantillons dans un mélange de ~ 1 ml de concentré (30%) H ₂ O ₂ et ~ 1 ml de concentré (~ 15 M) HNO _3. Faire toutes ces étapes à l'intérieur d'une hotte.
   1. Placer l'ensemble organe d'intérêt dans un bécher de 15 ml en Teflon. Ensuite, ajouter le H ₂ O ₂ / HNO ₃ dans le bêcher ^5. Conserver le bêcher ouvert pendant quelques minutes afin d'éviter les éclaboussures dues à la réaction d'oxydation de la matière organique et la libération de CO _2.
   2. Enfin, mettre le bécher sur une plaque chaude à about 100 ° C pendant une couple d'heures ou jusqu'à ce que la solution est parfaitement clair.
2. Ouvrez le bécher et sécher la solution sur une plaque chauffante à environ 100 ° C.
3. Une fois que l'échantillon est sec, ajouter 1 ml de 1,5 N HBr aux échantillons; fermer le bêcher et laisser dissoudre sur une plaque chaude à 100 ° C pendant une couple d'heures.
4. Pendant ce temps préparer les 500 colonnes ul.
   1. Ajouter 500 ul de la résine de 200-400 mesh AG1X8 à la colonne et le mettre sur la crémaillère de la colonne avec un bêcher de déchets au-dessous. Laver la résine en alternant: 5 18,2 ml d'eau MQ ⋅ cm, 5 ml de HNO ₃ 0,5 N, 5 ml d'eau, 5 ml de HNO ₃ 0,5 N, puis 5 ml d'eau. Conditionner la résine avec 5 ml de 1,5 N HBr.
5. Retirez les béchers de la plaque chaude et mettez-les dans un bain à ultrasons pendant environ 30 min, puis laissez-les béchers refroidir à température ambiante.
6. Une fois que le récipient est refroidi et la résine est lavée, ouvrir le récipient. Mettez l'adaptateur de pointe à til seringue, ajouter une pointe de pipette; pipette de 1 ml de l'échantillon et le charger sur la résine (très lentement afin de ne pas agiter la résine).
7. Une fois que tout le liquide passe à travers la colonne, ajouter 5 ml de 1,5 N HBr.
8. Une fois les 5 ml de 1,5 N HBr passent à travers la colonne, remplacer le bécher de poubelle avec un chiffon propre 15 ml bécher.
9. Ajouter 5 ml de HNO ₃ 0,5 N 2,5 ml à la fois. A ce stade, le Zn est éluée de la résine.
10. Une fois 5 ml de HNO ₃ passe à travers la colonne, retirer le bécher et le placer sur une plaque chaude à 100 ° C jusqu'à ce que séché.
11. Retirer la colonne de support de la colonne; corbeille de la résine (utiliser une nouvelle résine pour chaque échantillon).
12. Une fois que l'échantillon est sec, répéter le protocole avec le même volume d'acides sur une colonne plus petite (100 pi), puis placez-le sur une plaque chaude jusqu'à séché. L'échantillon est maintenant prêt pour la spectrométrie de masse.

4. spectrométrie de masse Mesure

1. Analyser le compo isotopique Znsition sur un spectromètre multi masse à plasma à couplage inductif-collecteur (MC-ICP-MS).
   1. Utilisez les paramètres de la machine résumées dans le tableau 1.
2. Placez les cages de Faraday pour recueillir à la messe (m / z) de ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, Zn ^{66, 67} et ⁶⁸ Zn Zn.
3. Préparer une solution contenant 500 ppb Zn dans 0,1 M HNO ₃ à l'analyse isotopique.
4. Analyse de la solution de 500 ppb de Zn à l'aide d'une chambre de pulvérisation associé à un 100 ul / min téflon nébuliseur. Pour chaque échantillon, mesurer 30 balayages (1 bloc de 30 cycles) dans lequel le temps d'intégration de chaque balayage est 8.389 sec.
5. Corrigez l'arrière-plan en soustrayant les sur-intensités crête zéro à partir d'une solution à blanc (M HNO ₃ de solution à 0,1 utilisé pour re-dissoudre les échantillons).
6. Le contrôle et la possible interférence ⁶⁴ Ni isobare correct en mesurant l'intensité du pic ⁶² Ni.Supposons que le / ^{62 64} rapport Ni Ni est naturel (0,2548), cette valeur correcte de la polarisation de la masse instrumentale, puis retirez le ⁶⁴ Ni sur la masse 64 que:
   ⁶⁴ Zn _réelle = ⁶⁴ Zn _mesurée - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _mesurée - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni) _naturelle x ⁶² Ni _mesurée.
7. Corrigez le biais de masse instrumentale par bracketing chacun des échantillons avec une solution 500 ppb niveau de la norme JMC Lyon Zn (ou un autre standard disponibles comme IRMM-3702). Effectuer le bracketing norme en divisant le ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn de l'échantillon par la moyenne des ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn des deux normes mesurées avant et après l'échantillon moins 1 et multiplié par 1.000 (voir l'équation 1). Précision externe typique sur la norme JMC Lyon Zn est de 0,05 permil / uma (2 écart-type, 2 sd).

Résultats

Dans 1,5 N HBr, les principales espèces de zinc (ZnBr3-) de forme des complexes très forts avec la résine échangeuse d'anions, tandis que la plupart des autres éléments ne interagissent avec la résine. Le zinc est récupéré puis en changeant le milieu de HNO ₃ dilué, en changeant la spéciation du Zn à Zn ²⁺ qui est libéré à partir de la ^6,7 de résine.

les rapports isotopiques sont en général exprimés en parties par mille déviations par...

Discussion

La reproductibilité des mesures est évaluée par des analyses répliquées des mêmes échantillons effectuées au cours des différentes sessions d'analyse. Par exemple ^6, nous avons reproduit la même roche terrestre 7 fois et nous avons obtenu les résultats présentés dans le Tableau 2.

Comme prévu à partir de la théorie de fractionnement isotopique ¹⁰ et mesurée dans tout matériel du système solaire jusqu'à présent (par exemp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon