Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Résumé

La capacité de l'endothélium enflammé de recruter leucocytes du débit est régulé par les cellules stromales mésenchymateuses. Nous décrivons deux modèles in vitro incorporant cellules humaines primaires qui peuvent être utilisés pour évaluer le recrutement des neutrophiles de flux et d'examiner le rôle que les cellules stromales mésenchymateuses jouent dans la régulation de ce processus.

Résumé

Les cellules stromales réglementer le recrutement de leucocytes circulants cours de l'inflammation par la diaphonie avec des cellules endothéliales voisins. Nous décrivons ici deux vitro "vasculaires" modèles pour étudier le recrutement de neutrophiles circulants de flux par les cellules endothéliales enflammées. Un avantage majeur de ces modèles est la capacité d'analyser chaque étape de la cascade d'adhérence des leucocytes dans l'ordre, comme cela se produirait in vivo. Nous décrivons également comment les deux modèles peuvent être adaptés à étudier le rôle des cellules stromales, dans ce cas cellules souches mésenchymateuses (CSM), dans la régulation de recrutement des leucocytes.

Cellules endotheliales primaires ont été cultivées seules ou conjointement avec MSC humain en contact direct sur microplaques Ibidi ou sur des côtés opposés d'un filtre Transwell pendant 24 heures. Les cultures ont été stimulées avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) pendant 4 heures et incorporés dans un essai d'adhérence flow-based. Un bolus de neutrophiles a été perfusésur l'endothélium pendant 4 min. La capture de neutrophiles et de leurs interactions avec l'endothélium fluide a été visualisé par microscopie à contraste de phase.

Dans les deux modèles, les cytokines stimulation augmente le recrutement de neutrophiles endothéliale se écoulant d'une manière dépendante de la dose. L'analyse du comportement des neutrophiles recrutés ont montré une diminution dose-dépendante de roulement et une augmentation dose-dépendante de la transmigration à travers l'endothélium. En co-culture, MSC supprimé l'adhésion des neutrophiles à l'endothélium de TNFa-stimulé.

Nos modèles d'adhésion basés sur le débit imitent les phases initiales de recrutement des leucocytes de la circulation. En plus de leucocytes, ils peuvent être utilisés pour examiner le recrutement d'autres types de cellules, comme les cellules tumorales circulantes MSC ou administrés thérapeutiquement. Notre modèle de co-culture multi-couches ont montré que les MSC communique avec endothélium de modifier leur réponse à des cytokines pro-inflammatoires, Altering le recrutement des neutrophiles. D'autres recherches utilisant ces modèles est nécessaire pour bien comprendre comment les cellules stromales de différents tissus et les conditions (troubles inflammatoires ou de cancer) influencer le recrutement des leucocytes pendant l'inflammation.

Introduction

L'inflammation est une réponse protectrice à une infection microbienne ou d'une blessure de tissu qui nécessite une réglementation stricte de l'entrée de leucocytes et la sortie de l'inflammation des tissus pour permettre la résolution ^1,2. Diaphonie entre les cellules endothéliales (CE) que les vaisseaux sanguins de la ligne, leucocytes circulants et les cellules stromales tissus-résident est essentiel de coordonner ce processus ^3. Cependant, le recrutement incontrôlée de leucocytes et de leur dédouanement inefficaces sous-tendent le développement de maladies inflammatoires chroniques ^4. Notre compréhension actuelle de recrutement des leucocytes dans la santé et la maladie est incomplète et modèles plus robustes sont nécessaires pour analyser ce processus.

Les mécanismes de soutien au recrutement de leucocytes du sang à travers vasculaire CE veinules post-capillaires ont été bien décrits ^1,2,5. Leucocytes circulants sont capturés par des récepteurs spécialisés (par exemple, VCAM-1, E-sélectine, la P-sélectine) quisont régulés à la hausse sur l'endothélium enflammé. Ces interactions transitoires permettent d'interagir avec les leucocytes surface lié chimiokines et médiateurs dérivés de lipides (soit stromales endotheliales ou d'origine) qui activent les intégrines exprimées par les leucocytes ^{6- 11.} Cela stabilise l'adhérence et la migration disques à travers l'endothélium et dans le tissu ^{12 15.} Dans le tissu, recrutés leucocytes sont soumis à des agents stromales dérivées qui influencent leur motilité, la fonction et la survie ^16,17. L'évidence croissante suggère fortement que les signaux reçus à chaque étape des conditions de processus de recrutement des leucocytes pour la prochaine. Cependant, notre compréhension de recrutement des leucocytes reste incomplète et très peu est connu sur le mouvement des leucocytes composants de mise en forme dans le tissu.

A Birmingham, nous avons développé plusieurs in vitro "vasculaires" modèles pour étudier le recrutement de leucocytes^9,18,19 écouler. Nous comprenons maintenant que vasculaire acte CE régulateurs immédiats de recrutement des leucocytes répondre aux changements dans leur micro-environnement local. Plus précisément, les cellules stromales tissus-résident peuvent activement réguler la réponse inflammatoire, en partie en conversant avec vasculaire CE voisine d'influencer leur rôle dans le recrutement ^3. Nous avons précédemment montré que diverses cellules stromales modulent la capacité de CE pour soutenir l'adhérence et la migration des leucocytes d'une manière spécifique d'un tissu, et que ces effets deviennent altérée dans les maladies chroniques ^13,16,20,21. Ainsi, les cellules stromales établissent tissus 'adresse-codes »qui définissent le contexte de chaque réponse inflammatoire ^22. Plus récemment, nous avons démontré que la moelle osseuse provenant MSC (BMMSC) puissamment réguler à la baisse la réponse des CE à des cytokines, conduisant à une réduction dans le recrutement de deux neutrophiles et de lymphocytes ^23.

Les mécanismes GOVrecrutement Erning élucidé in vitro ont largement utilisé les essais comportant un seul type de cellule (par exemple, CE) ou de protéines dans l'isolement. Cependant, ces études ne prennent pas en considération les effets de l'environnement tissulaire locale (ce est à dire, la présence de cellules stromales) sur le recrutement des leucocytes et leur migration ultérieure dans le tissu. Nous décrivons ici deux méthodes basées sur les flux dans lequel les cellules stromales, cellules souches mésenchymateuses spécifiquement (MSC), sont co-cultivées avec des CE ^23. Ces modèles nous permettent d'examiner l'effet des cellules stromales sur les réponses endothéliales, en particulier leur capacité à soutenir le recrutement des leucocytes de l'écoulement.

Protocole

1. Isolement et culture de cellules endothéliales humaines primaires et Cellules souches mésenchymateuses

1. cellules d'isolement et de la culture des droits de l'endothéliales de veine ombilicale (HUVEC):
   1. Mettez cordon ombilical sur un plateau avec des serviettes en papier et pulvériser avec 70% d'éthanol. Placez dans une hotte de culture de tissu. Identifier la veine et Cathétériser aux deux extrémités. Placez une attache de câble autour de l'extrémité canule pour le fixer.
   2. Laver sang veineux avec du PBS en utilisant une seringue. Remplir la seringue avec de l'air et de passer à travers la veine de retirer et jeter le PBS résiduelle.
   3. Décongeler 10 mg / ml de collagénase de type Ia et diluer 1:10 dans du PBS (avec du calcium et chlorure de magnésium) à une concentration finale de 1 mg / ml. Passez une solution de collagénase dans la veine jusqu'à ce que les canules sont remplis. Fermez les pinces sur canules aux deux extrémités.
   4. Couvrir le bac avec le tissu et pulvériser avec 70% d'éthanol. Placez le cordon dans un incubateur pendant 20 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
   5. Prenez le cordon surde l'incubateur et serrer des attaches de câble. Massez doucement sur le cordon pendant 1 min. Rincer la suspension cellulaire avec 10 ml de PBS et recueillir dans un tube de centrifugation de 50 ml.
   6. Remplir la seringue avec de l'air et de passer à travers la veine du PBS pour éliminer tout résidu deux fois, en recueillant le PBS dans un tube à centrifuger de 50 ml utilisé dans l'étape 1.1.5. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
   7. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de milieu complet CE. Se compose de milieu EC M199 supplémenté avec 35 ug / ml de sulfate de gentamicine, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain, 1 ug / ml d'hydrocortisone, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B, et 20% de sérum de veau foetal.
   8. Ajouter 4 ml de milieu CE et la suspension à un CE ² flacon de 25 cm. Changer le support le jour suivant, puis tous les deux jours.
   9. CE présentent une morphologie pavée comme (Figure 1AI). Pour les essais d'adhérence, CE sont généralement ensemencé quand ils atteignent 100% de confluence (voir section 1.4 ).
2. Isolement de cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton (WJMSC) à partir de cordons ombilicaux humains:
   1. Isoler le MSC de la gelée de Wharton dérivé (WJMSC) à partir de cordons ombilicaux frais ou de cordons qui ont déjà été utilisées pour isoler CE. Couper le cordon ombilical en 5 cm de long morceaux. Coupez chaque morceau longitudinalement pour révéler les vaisseaux sanguins (2 artères [blancs, rigide] et une veine [jaune, distendu]).
   2. Avec des ciseaux et des pinces stériles supprimer les vaisseaux sanguins et le jeter. Coupez tous les tissus en 2-3 mm ³ morceaux. En utilisant des pinces lieu de 2 à 3 mm ³ morceaux dans un tube de 50 ml de la centrifugeuse.
   3. Décongeler 100 mg / ml de type II stock collagénase et diluer 1: 100 dans 10 ml de PBS à une concentration finale de 1 mg / ml. Décongeler 20 000 U / ml Stock hyaluronidase et diluer 1: 400 à une concentration finale de 50 U / ml dans la solution de collagénase.
   4. Ajouter cocktail enzymatique dans le tube à centrifugation contenant les fragments de tissus. Incuber les tissus fragments pour 5 heures à 37 ° C sur un agitateur lente.
   5. Diluer la suspension cellulaire à 1: 5 dans du PBS. Placer un filtre à pores de 100 pm dans 50 ml d'un nouveau tube de centrifugation. Verser la suspension de cellules sur le filtre de pores de 100 um.
      REMARQUE: Restant fragments de tissus sera retenue sur le filtre et les cellules seront recueillis dans le tube 50ml centrifugeuse.
   6. Jeter le filtre. Centrifuger la suspension de cellules à 400 xg pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans WJMSC 12 ml du milieu de culture complet de WJMSC (DMEM glucose faible, 10% de FCS et 100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine mix).
   7. Ensemencer toutes les cellules dans un 75 cm ² flacon de culture tissulaire. Changer le milieu après 24 h avec 12 ml du milieu complet de culture WJMSC. Remplacer milieu tous les 2-3 jours. Les cellules doivent atteindre 70 à 80% de confluence dans les 2 semaines. Passage quand WJMSC atteindre 70 à 80% de confluence (voir section 1.4).
3. L'expansion de MSC dérivées de moelle osseuse (BMMSC):
   1. Isoler MSC humaines dérivées de moelle osseuse (BMMSC) comme précédemment décrit ^24. Ajouter 10 ml de milieu de croissance de MSC préchauffé (MSCGM) dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   2. Décongeler une fiole de p2 BMMSC en plaçant dans un bain d'eau à 37 ° pendant 2 min. Ajouter la suspension BMMSC au tube de centrifugeuse contenant MSCGM. Mélangez bien à la pipette.
   3. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant complètement.
   4. Resuspendre les cellules dans 1 ml MSCGM et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur cellulaire numérique tel qu'un Cellometer.
   5. cellules de semences dans 75 cm ² flacons de culture à une densité de 5000 - 6000 cellules par cm ² dans 12 ml MSCGM. Changer le milieu après 24 h avec 12 ml MSCGM. cellules d'alimentation avec 12 ml MSCGM tous les 2-3 jours.
   6. Passage quand BMMSC atteindre 70 à 80% de confluence (voir section 1.4). Les cellules présentent une morphologie fibroblastique (Figure 1Aii).
4. Détachement des CE et MSC:
   1. Aspirer milieu de 25 cm ² flacons de culture. Ajouter 2 ml d'EDTA à 0,02% à environ 2 min. Aspirer EDTA et ajouter 2 ml de trypsine (2,5 mg / ml). Vue au microscope jusqu'à ce que les cellules deviennent tour.
   2. Appuyez sur le flacon pour détacher les cellules. Inactiver la trypsine par addition de milieu de culture de 8 ml (selon le type cellulaire; CE milieu pour les cellules HUVEC, LG DMEM WJMSC et MSCGM pour BMMSC) dans le flacon de culture et de transfert suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 ml.
   3. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot comme décrit ci-dessous.
      1. Pour des passages de MSC, remettre le culot dans 3 ml de milieu de culture. Ajouter 11 ml de milieu de culture en trois flacons ^de 75 cm2 de culture distinctes. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque flacon de culture (1: 3 par division). Passage WJMSC BMMSC et 3 fois (P3) avant l'utilisation dans des essais de co-culture.
      2. Pour l'ensemencement CE ou MSC dans des essais d'adhérence - voir les sections 2 et 3.
5. MSC congélation:
   1. Au passage 3 détachement MSC comme décrit à la section 1.4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 3 ml glacée CryoSFM. Pipette aliquotes de 1 ml de suspension cellulaire dans 1,5 ml cryovials glacées. Mettre cryotubes dans un récipient de congélation.
   2. Entreposer le contenant à -80 ° CO / N. Transfert à l'azote liquide. Thaw flacon de MSC (Suivez les étapes 1.3.1 - 1.3.6). Remettre en suspension dans 5 ml MSC milieu de culture (choisir milieu approprié pour WJMSC ou BMMSC) et des semences dans un ² flacon de 25 cm.

2. Établir Stem Cell co-cultures endothéliale-mésenchymateuses sur Ibidi microplaques

1. Trypsiniser un cm ² flacon de CE confluentes 25 (~ 1,5 x 10 ⁶ Les cellules, comme la section 1.4). Remettre en suspension CE 380 pi MSCGM (1 x 25 cm ² flacon sera ensemencer deux microplaques 6 canaux Ibidi (~ 1,25 x 10 ⁵ / canal), pour des essais d'adhérence tout ty cellulairepes sont cultivées dans MSCGM). Ajouter 30 ul de suspension CE à chaque canal (ce couvrira la zone de croissance par capillarité). Incuber Ibidi microlame à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 1 heure.
2. Ajouter 140 ul MSCGM à chaque canal, puis aspirer le tout. Répéter deux fois pour un total de trois lavages. Ajouter 140 ul MSCGM et le placer dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 24 heures.
3. Pour les co-cultures détacher MSC (section 1.4). Effectuer une numération cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou Cellometer. Ajuster la concentration de MSC à 1,5 x 10 ⁵ cellules / ml.
4. Aspirer excès moyen à partir des canaux (Ibidi ne laissant que la zone du canal dans un milieu de croissance). Ajouter 30 ul du MSC suspension aux canaux Ibidi. Aspirer le milieu qui a été éjecté de la zone du canal de la croissance et ajouter encore 30 ul de suspension MSC. Répéter une fois de plus, puis placer la microplaque Ibidi dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO _{2 <}/ Sub> pendant 1 heure.
5. Ajouter 140 ul MSCGM à chaque canal, puis aspirer le tout. Répéter deux fois pour un total de trois lavages. Ajouter un volume final de 140 ul MSCGM à chaque canal et le placer dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 24 heures.
6. Décongeler 1 x 10 ⁵ U / stock ml de TNFa et diluer 1: 1000 dans MSCGM à une concentration finale de 100 U / ml (équivalent à ~ 10 ng / ml). Effectuer une dilution en série par dilution de 100 U / ml de TNFa par 01 heures 10 dans MSCGM pour obtenir 10 U / ml. Diluer 10 U / ml de TNFa par 01 heures 10 dans MSCGM pour obtenir 1 U / ml.
7. Traiter les canaux avec le TNFa à 37 ° C pendant 4 heures avant le dosage. fluctuations de température pendant le traitement de cytokines vont modifier les modes de recrutement des neutrophiles observés. Ajouter MSCGM frais à canaux non traités.

3. Établir endothéliale-cellules souches mésenchymateuses Co-cultures sur Filtres

1. Détachez WJ ou BMMSC comme décrit à la section 1.4. Reprendre le culotdans 1 ml MSCGM. Effectuez une des cellules de comptage cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou Cellometer.
2. Ajuster le volume de sorte que la concentration finale soit de 5 x 10 ⁵ MSC dans 500 ul de MSCGM.
3. Utilisation des pinces stériles inversent six puits, 0,4 um filtres Transwell PET et les placer dans une boîte stérile.
4. Graine 5 x 10 ⁵ MSC sur la surface extérieure des filtres. Incuber les filtres à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 1 heure.
5. Recueillir médias de la surface extérieure du filtre. Comptez le nombre de non-adhérent MSC dans les médias. Re-filtres inverti utilisant des pinces stériles et les placer dans une plaque à 6 puits correspondant contenant 3 ml MSCGM.
6. Ajouter 2 ml d'MSCGM sur la surface intérieure du filtre (figure 1B). Placer dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 24 heures. Trypsiniser un cm ² flacon de CE confluentes 25 (Figure 1AI, comme la section 1.4).
7. Reprendre CE dans 8 ml MSCGM (1 x 25cm ² flacon will graines de quatre filtres à 6 puits; ~ 5 x 10 ⁵ CE / filtre). Aspirer le milieu à partir du haut et en bas des filtres poreux. Ajouter MSCGM 3 ml frais dans la chambre inférieure (sous le filtre). Ajouter 2 ml de suspension CE à la surface intérieure de chaque filtre. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO _2.
8. Aspirer le milieu de se laver au large non adhérente CE et remplacer avec des produits frais MSCGM. Mettre en place des filtres mono-culture parallèles CE par ensemencement des cellules sur la surface intérieure sans premier MSC de semis. Incuber O / N à 37 ° C et 5% de CO _2.
9. Vérifiez que la monocouche CE est confluent et ne contient pas les lacunes. Des monocouches sous-confluentes peuvent pas être utilisées pour des essais d'adhérence (figure 1B).
10. Traiter les chambres supérieure et inférieure avec des filtres 1, 10 ou 100 U / ml de TNFa (équivalent à ~ 10 ng / ml) à 37 ° C pendant 4 heures avant le dosage (décrit dans la section 2).

4. Isolement de leucocytes

1. Prenez veineusesang de volontaires sains et aliquote immédiatement dans des tubes EDTA. Inverser les tubes doucement pour mélanger.
2. Couche 2,5 ml Histopaque 1077 SUR DES 2,5 ml Histopaque 1119 dans un 10 ml tube rond à fond. Couche 5 ml de sang total sur le gradient Histopaque. Centrifuger à 800 g pendant 40 min à température ambiante.
3. Récolte neutrophiles périphériques polymorphonucléaires (PMN) à l'interface de Histopaque 1077 et 1119 (au-dessus de la couche d'érythrocytes). Placer dans un tube de 10 ml à fond rond et porter à 10 ml avec LNPP. Retourner doucement le tube et centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Diluer la solution de BSA à 7,5% 01 heures 50 dans 100 ml de PBS (avec du calcium et chlorure de magnésium) à une concentration finale de 0,15% (p / v; LNPP). Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml LNPP. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
5. Remettre en suspension dans 1 ml LNPP. Prélever une partie aliquote de 20 ul de la suspension de cellules et ajouter 380 ul de PBSA (dilution 1:20). Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou Cellometer. Diluer à la conce nécessairentration (1 x 10 ⁶ / ml pour les filtres Transwell et Ibidi microlame) dans les pensions. Maintenir neutrophiles suspension à température ambiante jusqu'à ce que le dosage.

5. Montage de la Flow System

1. Mettre en place le système d'écoulement comme indiqué à la figure 1C. Allumer le chauffage et réglez à 37 ° C. Fixez une seringue de 20 ml (retirer le piston) et une seringue de 5 ml à un robinet 3 voies. Fixez le robinet à la chambre en plexiglas avec du ruban Micropore.
2. Mesurer et couper un long morceau de silicium 2/4 mm (épaisseur) tube qui est approximativement la distance entre la vanne et le 3-way robinet. Couper un 8-10 mm de long morceau de 1/3 mm (mince) tube et l'insérer dans une extrémité du tube d'épaisseur. Fixez le côté du tube d'épaisseur sur le 3-way robinet.
3. Connectez l'extrémité du tube mince sur un port de l'électronique 3-way microvalve. Ce est le «réservoir de lavage". Coupez un 6 - long morceau de tube épais et mince 8 mm.
4. Insérer le tube mince dans une extrémité du tube d'épaisseur. AttAch le tube épaisse fin sur une seringue de 2 ml (retirer le piston).
5. Connectez l'extrémité du tuyau mince de la seringue de 2 ml sur un port sur la microvanne électronique à faire la "réservoir d'échantillon". Raccorder la vanne à la chambre de circulation du filtre en mesurant et en coupe d'un long morceau de tube mince qui est la distance entre le micro-soupape et le centre de la platine du microscope.
6. Pour le modèle de microplaque, joindre un 8 - mm morceau de tube d'épaisseur 10 à l'extrémité du tube mince. Placer un connecteur en forme de L à l'extrémité de la tubulure d'épaisseur. Cela se connecter à la microplaque. Pour le modèle de filtre, joindre un 8 - mm morceau de Portex Blue Line manomètre 10 tubes de raccord à l'extrémité du tube mince.
7. Placez l'extrémité du tuyau mince sur la microvanne. Ce est la sortie commune pour laver et échantillons réservoirs. Remplir les réservoirs avec LNPP. Premier tube en se écoulant à travers eux LNPP pour enlever les bulles d'air.
8. Attacher Manomètre tubulure à une 29 mm (50 ml) de verreyringe. Premier la seringue en complétant avec 10 ml LNPP. Inverser la seringue de sorte que l'extrémité reliée à la tubulure orientée vers le haut et faire sortir toutes les bulles d'air. Remplir avec 5 ml LNPP.
9. Pour le modèle de microlame seulement, attacher un 10 - morceau de tube de 12 mm d'épaisseur à l'extrémité de la tubulure de manomètre conduisant à la seringue en verre. Placer un connecteur en forme de L sur l'extrémité de la tubulure d'épaisseur. Placer la seringue en verre dans une pompe à seringue pour perfusion / retrait.
10. Calculer le débit de remplissage (Q) nécessaire pour générer la contrainte de cisaillement de mur désiré (τ _w en Pascal, Pa) de 0,1 (filtres Transwell) Pa ou 0,05 (microplaques Ibidi) Pa en utilisant les formules suivantes:
    γ _w = (6.Q) / (wh ²⁾
    τ = n.γ
    Où w = largeur interne et h = hauteur intérieure du canal d'écoulement. n = viscosité de la solution qui se écoule; LNPP est n = 0,7 mPa.s. Pour la chambre d'écoulement de filtre à plaques parallèles, la largeur (w) est de 4 mm et la profondeur (h) est 0,133 mm. Le depth de la chambre peut varier légèrement en raison des différences dans l'épaisseur du joint d'étanchéité utilisé Parafilm. Pour la microlame Ibidi, la largeur est de 3,8 mm et la profondeur est de 0,4 mm.
    NOTE: En raison de différences dans les dimensions du canal d'écoulement, et la dynamique de capture différentes, nous utilisons des contraintes de cisaillement pour le modèle de microlame par rapport au modèle de filtre ^6.

6. Configuration de la plaque parallèle Chambre flux d'intégrer des filtres

1. Couper un morceau de Parafilm (la même taille que la lamelle de verre) à l'aide d'un modèle métallique. Découpez une fente 20 x 4 mm dans le Parafilm (pour créer le canal d'écoulement) en utilisant un modèle de métal. Utilisez le joint pour marquer le canal d'écoulement sur la lamelle de verre.
2. Aligner les bords du filtre 6 puits sur la lamelle de verre. Assurez-vous que le filtre couvre les marques pour les canaux d'écoulement. Découpez soigneusement le filtre à l'aide d'un scalpel type 10A.
3. Couvrir soigneusement le filtre avec un joint Parafilm, veiller à ce que le canal d'écoulementla fente se trouve au milieu du filtre (figure 1D). Utilisez un morceau de tissu propre et pousser les bulles.
4. Placer la lamelle dans l'évidement de la plaque de fond de la chambre d'écoulement Perspex. Positionner la plaque supérieure en plexiglas sur le dessus du joint et visser les plaques ensemble (figure 1D).
5. Tournez le robinet 3 voies pour permettre tampon de lavage (LNPP) de circuler à travers la vanne. Connectez manomètre tuyau à l'orifice d'entrée de la plaque de Persex dessus. Exécuter LNPP à travers le canal d'écoulement pour permettre aux bulles de passer à travers.
6. Raccorder la conduite du manomètre de la pompe de la seringue dans l'orifice de sortie de la plaque Perspex. Réglez la pompe seringue pour remplir et appuyez sur run. Nettoyez toute LNPP qui a coulé sur la plaque supérieure de la chambre.
7. Placez la chambre sur la scène d'un microscope à contraste de phase inverti. Réglez la mise à visualiser la CE au-dessus des filtres (figure 1B).

7. Configuration de microplaques pour débit

1. Placez la microplaque sur la scène d'un microscope à contraste de phase inverti. Branchez le connecteur en forme de L dans le port d'entrée d'un canal. Exécuter LNPP à travers le canal d'écoulement.
2. Placer le connecteur en forme de L à partir de la pompe de la seringue dans l'orifice de sortie du canal. Réglez la pompe seringue pour remplir et appuyez sur run. Nettoyez toute LNPP qui a coulé sur la microplaque. Réglez la mise à visualiser la monocouche CE.

8. perfusion de cellules endothéliales leucocytes fil

1. Mettre 2 ml de neutrophiles purifiés dans le réservoir d'échantillon et laisser se réchauffer pendant 2 min. Laver l'endothélium avec LNPP pendant 2 min.
2. Tournez la vanne ON pour perfuser neutrophiles sur l'endothélium. Livrer le bolus de neutrophiles pendant 4 min. Coupez le clapet et perfuser LNPP du réservoir de lavage pour le reste de l'expérience.
3. Veiller à ce que des bulles d'air ne passent pas par le canal d'écoulement à tout moment pendant le test car cela perturbera le monolay CEer et le détachement cause de neutrophiles adhérentes.

9. Enregistrement neutrophiles capture et Comportement

1. le recrutement des neutrophiles d'enregistrement soit pendant l'écoulement des neutrophiles ou post-perfusion.
2. Faire tous les enregistrements numériques d'au moins 5 à 10 champs dans le centre du canal d'écoulement. Identifier le centre du canal en déplaçant l'objectif au bord du canal à l'orifice d'entrée et l'identification du milieu de l'orifice.
   1. Pour l'enregistrement pendant l'écoulement des neutrophiles, prendre des images d'un seul champ toutes les 10 secondes pendant 1 min. Avancez le long du canal et enregistrer un autre domaine pendant 1 min. Répétez l'opération pour la durée du bolus.
   2. Pour l'enregistrement de post-perfusion, faire 10 sec enregistrement de 5-10 champs vers le bas au centre du canal d'écoulement pour l'évaluation du comportement des leucocytes (généralement de 2 min après la fin du bolus de neutrophiles). Prenez des photos chaque seconde dans l'intervalle de 10 sec. Cela permet un temps suffisant pour la capture de flux et le comportement des neutro adhérentephils à analyser.
   3. Enregistrez un champ unique contenant au moins 10 neutrophiles transmigré pendant 5 min, prendre des images toutes les 30 secondes. Ceci peut être utilisé pour calculer la vitesse de cellules ayant migré (au-dessus ou en dessous de l'endothélium).
   4. Enregistrer une autre série de 10 champs de sec (typiquement 9 min post-perfusion). Cela permet neutrophiles temps de migrer à travers la monocouche endothéliale.
   5. Arrêter la pompe de la seringue et retirer le tuyau. Désassembler la chambre d'écoulement et rincer le réservoir d'échantillons et de tubes. Répétez l'opération pour filtres / canaux de Microslide ultérieures.

10. Analyse des leucocytes recrutement et Comportement

1. Comptez le nombre de neutrophiles dans chaque domaine au cours des 10 enregistrements sec au point de temps de 2 min. Toutes les cellules doivent être présents dans la première seconde terrain afin d'être comptés. Les cellules qui sont partiellement dans le champ sur deux côtés (par exemple, en haut / frontières de droite) du champ de vue sont inclus dansLes chiffres, tant qu'ils restent dans le domaine de la pleine 10 sec.
2. Calculer le nombre moyen de neutrophiles adhérente par champ. Mesurer la longueur et la largeur du champ enregistré. Calculer la surface du champ. Calculer le nombre de champs il ya dans 1 mm ^2. Multiplier le nombre de neutrophiles moyenne par le nombre de champs dans 1 mm ^2.
3. Calculer le nombre total de neutrophiles perfusés en multipliant la quantité de polynucléaires neutrophiles perfusé (par exemple, 2 x 10 ⁶ / ml * Q [par exemple, 0,0999 ml / min pour la chambre d'écoulement à plaques parallèles]) par la durée du bol (par exemple, 4 min ).
4. Diviser le nombre de neutrophiles / mm ² par le nombre total de neutrophiles perfusés pour déterminer le nombre total de cellules qui ont adhéré (adhérent cellules / mm ^2/10 perfusé ^6).
5. Évaluer si les neutrophiles adhérents roulent, fermement adhérentes ou transmigré (vidéo supplémentaire 1 et 2).
   1. Unroulant neutrophiles est la phase lumineuse et se déplacera lentement le long de la monocouche endothéliale (1-10 um / sec; vidéo supplémentaire 1).
   2. Cellules adhérentes sont fermement la phase lumineuse et lié à la surface CE, soit en restant stationnaire (ce est à dire, ne bouge pas pendant l'enregistrement) ou ont subi des changements de forme et migrent sur ​​la surface CE (Figure 1Ei).
   3. Un neutrophiles est transmigré phase sombre et en dessous de la couche CE (Figure 1Eii).
6. Calculer le pourcentage de cellules adhérentes qui déploient, stationnaire et transmigré. En variante, le comportement des neutrophiles peut être exprimée comme le nombre total de cellules qui présentent des comportements différents en appliquant la même formule utilisée pour calculer adhérence totale (comme décrit dans les étapes 10.6 à 10.7).
   1. Marquez le bord d'attaque d'une neutrophiles roulement. Marquer le bord d'attaque de la même cellule à la fin de la séquence de 10 sec. Tracez une ligne pariween les 2 points et mesurer la distance que la cellule a voyagé.
   2. Diviser cette valeur par la durée de l'enregistrement, dans lequel la cellule est roulant (soit 10 sec). Essayez et sélectionnez neutrophiles qui sont dans le domaine de la totalité de l'intervalle de 10 sec.
7. Pour calculer la vitesse de migration des neutrophiles sur la surface (en forme de changement de phase lumineuse) ou sous l'endothélium (phase sombre) utiliser le 5 min d'enregistrement (vidéo complémentaire 2).
   1. Dessiner un contour de cellules ayant migré au début de la séquence et de suivre leurs mouvements tout au long de la séquence. Notez les positions X et Y du centroïde à chaque intervalle d'une minute pour chaque cellule. Soustraire les valeurs de la position X et Y à partir de la première image de la séquence à partir des valeurs de la seconde image. Ceci est basé sur le théorème de Pythagore.
   2. Soustraire les valeurs de la seconde image de la troisième image. Faites cela pour toutes les images de la séquence. Place til valeurs X et Y et ajoutez-les ensemble.
   3. La racine carrée de la valeur résultante. Calculer la vitesse de chaque cellule faisant la moyenne des vitesses calculées à chaque intervalle de minute. Track 10 migré neutrophiles et de calculer la vitesse moyenne.

Résultats

Initialement, nous avons analysé l'effet de stimuler la CE avec du TNFa sur le recrutement de neutrophiles de flux en utilisant le modèle de microplaque Ibidi (article 7-9). En l'absence de TNFa, peu ou pas de neutrophiles ont adhéré à la monocouche endotheliale (figure 2A). Ceci a été prévu, en tant que non traité / CE repos ne expriment pas les molécules d'adhérence nécessaires (les sélectines) ou à l'appui de liaison de chimiokines ^25,26. En r...

Discussion

Nous décrivons ici deux vitro "vasculaires" modèles pour étudier le recrutement de neutrophiles circulants par l'endothélium enflammé. Un avantage majeur de ces modèles est la capacité d'analyser chaque étape de la cascade d'adhérence des leucocytes dans l'ordre, comme cela se produirait in vivo. Nous avons déjà observé une augmentation dose-dépendante de l'adhésion des neutrophiles à travers transmigration et stimulée par le TNFa CE ^9,29.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.