Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Résumé

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Résumé

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introduction

L'épithélium intestinal est l'un des tissus les plus proliférant rapidement corporels, qui a causé d'attirer un grand intérêt de la recherche sur les cellules cancéreuses et souches. En 2009, une technique a été publié pour générer cultures durables de petites cryptes intestinales dans matrigel, conserver une structure en 3 dimensions ^1. Ces structures, appelées organites intestinaux, peuvent être cultivées en utilisant des techniques standard, avec entourant milieu supplémenté avec un certain nombre de facteurs de croissance définis, y compris la BMP-signalisation inhibiteur de la voie noggine (cheville en bois), la voie Wnt-signalisation activateur rspondin 1 (Rspo1) et le facteur de croissance épidermique (EGF) tout trouvé pour améliorer la prolifération intestinal ^2-4.

Organites dépassent lignées cellulaires de cancer dans les aspects traditionnels qu'ils sont non mutée, ont maintenu hiérarchie de cellules souches, afficher polarisation cellulaire intacte et la différenciation d'exposition dans toutes les lignées cellulaires trouvés dans la petite int naissantépithélium Estinal. Comme ils peuvent être transduites pour mener transgènes ou interférence ARN constructions ^5, ils sont utilisés pour étudier des éléments génétiques spécifiques, l'emportant sur ​​des expériences utilisant des souris transgéniques en facettes de coût et de vitesse. L'expression transgénique dans organites peut être effectuée en utilisant soit retroviral murin ou vecteurs lentiviraux ^6,7. En raison des limitations de retrovirus murins, capables de transduire des cellules mitotiques exclusivement ^8, la transduction lentivirale est plus fréquemment utilisé pour des cellules qui sont difficiles à infecter, tels que les organites.

Virally transduction et exprimant de façon stable organoïdes transgéniques peuvent être utilisés pour une multitude d'analyses en aval, y compris ARN analyses quantitatives et immunohistochimie. Pris ensemble, la culture de organites de cellules épithéliales intestinales primaires a évolué pour devenir une technique de routine qui est facile à mettre en œuvre sans exigences spécifiques de laboratoire, et est devenu le roman standard CEll culture dans la recherche sur l'épithélium intestinal.

Techniques de transduction virale et l'analyse aval ultérieure dans organites sont fastidieux d'effectuer des expériences et d'aider organoïdes nous avons généré ce protocole vidéo, montrant des méthodes pour lentiviral transduction des organites culture. Nous montrons en outre la façon dont le traitement correct des organites peuvent augmenter le rendement et donc d'améliorer les performances de l'analyse en aval en utilisant des techniques d'ARN ou immunohistochimie. Dans le protocole, organites qui sont dérivés de petites cryptes intestinales ont été exclusivement utilisées, bien que les techniques décrites peuvent être appliquées aux organites côlon ainsi.

Protocole

1. Préparation de Polyéthylènimine (PEI) comme réactif de transfection

1. Dissoudre environ 150 mg de PEI dans 100 ml d'H ₂ O.
2. Réglez solution à pH 7,4 par addition de HCl jusqu'au solution devient limpide et remuer jusqu'à dissolution complète. Cela peut prendre entre 10 et 60 min et ajouter de l'eau à une concentration de 1 mg / ml final.
3. Lorsque claire, filtrer la solution à travers le filtre PEI 0,22 um stérile et stocker dans un congélateur à -80 ° C en aliquots de 5 ml.

2. Production de Particules Lentivirales

Jour 1:

1. Des cellules HEK293T Split à 60% -80% de confluence dans 162 cm ² fiole ou une grande boîte de Pétri dans un milieu de culture de lignée cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 1% de pénicilline / streptomycine et supplément de glutamine 2 mM).

Jour 2:

2. Préparer la solution de transfection d'ADN contenant 45 pg d'ADN de plasmide total, additionnerles vecteurs lentiviraux d'emballage (7 pg de pVSVg; 5 ug de pRSV rev; 13 pg de PMDL) et 20 ug de plasmide lentiviraux codant pour le gène d'intérêt ou shRNA d'intérêt. Ajuster à un volume de 1 ml en utilisant du DMEM.
3. Préparer la solution de transfection PEI en ajoutant 90 ul de 1 mg / ml de PEI à 930 pl de DMEM et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Ajouter la solution de transfection de l'ADN à la solution PEI. Vortex ou inverser un certain nombre de fois et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour obtenir une solution de transfection de l'ADN.
5. Goutte à goutte 2 ml de la solution de transfection de l'ADN sur les cellules HEK293T et incuber pendant 4 h dans un incubateur humidifié de culture de cellules à 37 ° C.
6. Après 4 h, rafraîchir le milieu de culture pour éliminer PEI. Il ne est pas nécessaire de laver les cellules avant d'ajouter nouveau média.
   REMARQUE: PEI est cytotoxique et d'incubation fois plus longtemps que 4 heures peuvent causer des dommages aux cellules HEK293T.

Jour 4:

7. Remplacer supernatant avec le nouveau milieu de culture. Gardez surnageant (contenant le virus); il sera utilisé dans l'étape 2.10.
8. Mettez surnageant dans 15 ml flacon. Pour éliminer les cellules mortes, centrifugeuse pendant 5 min à 500 x g.
9. Poussez surnageant de 0,45 um filtre utilisant une grande seringue de 60 ml. Conservez une nuit à 4 ° C.

Jour 5:

10. Recueillir le deuxième lot de surnageant; centrifugeuse et le filtre comme dans les étapes 2.8 à 2.9.
11. Mutualiser les surnageants des étapes 2,9 et 2,10 dans des tubes d'ultracentrifugation et centrifuger à 50 000 xg dans une ultracentrifugation pendant 90 min.
12. Sortez capsules contenant très soigneusement les tubes d'ultracentrifugation et de mettre dans une hotte à flux laminaire, se souvenant de l'orientation du tube à l'intérieur de la centrifugeuse.
13. Ouvrir le tube de maintien de capsule soigneusement ultracentrifugeuse milieu décanter et de telle façon que la pastille est sur le côté supérieur du tube. Depuis pellets viraux peuvent être difficiles à visualiser, rappeler dans quellecôté du tube une pastille sera formée. Prenez une micropipette et retirez dernier bit de milieu tout en prenant soin de ne pas agiter le culot brun opaque qui est visible sur le côté de la partie inférieure du tube d'ultracentrifugation.
14. Remettre en suspension cette pastille dans 500 ul de milieu de culture additionné de nicotinamide organoïde 10 mM, 10 pM Chir99021, 10 uM Y27632 et 8 ug / ml de polybrène. La remise en suspension dans ce milieu est important car le virus à titre élevé est utilisé pour transduct directement organites.
15. Optionnellement: geler le virus dans ce milieu aliquotés en deux lots de 250 pl dans -80 ° C.

3. Lentiviral transduction des organites

Jour 0:

1. Diviser une pleine 0,95 cm ² et des organites deux jours avant de transduction dans un nouveau puits, visant à obtenir environ 50 petits organites. Diviser organoïdes selon le protocole précédemment publié ^une (figure 3A, B).
2. Supplément organoïde milieu de culture avec 10 uM Chir99021 et 10 mM de nicotinamide pour obtenir hyper prolifératives kystique cryptes (figure 3C).
   REMARQUE: cryptes kystique développeront mieux quand organoïdes fraîchement fendus sont cultivées en présence de Chir99021.

Jour 2:

3. Organoïdes récolte par aspiration et refoulement du matrigel et moyennes, perturbant ainsi le mélange avec une micropipette P1000. Placer le mélange dans un tube de 15 ml.
4. Perturber outre l'utilisation d'une pipette Pasteur dans lequel l'ouverture distale a été diminué par fusion. organoïdes à centrifuger pour sédimenter pendant 5 min à 100 x g.
   NOTE: En fonction de la taille de la centrifugeuse, utiliser une vitesse de centrifugeuse différente. Il est nécessaire de trouver la vitesse exacte dont perturbés organites sont séparés du mélange.
5. Eliminer le surnageant et ajouter 500 ul de trypsine 1x préchauffé (similaire à la trypsine 0,25%). Remettre en suspension dans de la trypsine organites et incuber3 min dans un bain d'eau à 37 C °.
6. Inactiver la trypsine par addition de 3,5 ml de milieu de culture de lignée cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 1% de pénicilline / streptomycine et glutamine). Centrifuger pendant 5 minutes à 500 x g.
7. Eliminer le surnageant de quitter culot dans environ 20 pi de milieu. Transférez les organites dans cette dernière petite quantité de milieu dans un puits sur une plaque de 48 puits.
8. Ajouter haute lentivirus du titre en milieu de transduction comme décrit à l'étape 2.14, remettre en suspension et passez à l'étape 3.10. En rencontrant une faible efficacité de transduction, l'étape 3.9 peuvent être ajoutés.
   NOTE: Pour la transduction efficace, ajouter généralement une aliquote de 250 pi de haute lentivirus de titre à un puits d'organites. Cela représente 50% de tous les lentivirus récolté dans une seule production comme décrit dans l'étape 2 de ce protocole.
9. En option: pour améliorer l'efficacité de transduction, effectuez spinoculation en mettant les 48 et plaques contenant organites dans une centrifugeuse préchauffé sur 326; C et tourner à 600 g pendant 1 h.
10. Mettre mélange organoïde-virus en culture incubateur et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur de culture pour permettre la transduction.
11. En option: pour améliorer encore l'efficacité transduction, incuber organoïdes pour supplémentaire de 3 heures à 37 ° C dans un incubateur de culture.
12. Ajouter 1 ml de milieu de culture organoïde et remettre le mélange organoïde-virus, transférer dans un tube à centrifuger et centrifuger dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 850 xg pour sédimenter organites.
13. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 20 ul d'glacée matrigel. Comme le matériau se solidifie quand il devient plus chaud, utiliser des embouts de pipette qui sont refroidis par aspiration et refoulement PBS glacé pour un certain nombre de fois.
14. Mettez la goutte au milieu d'un puits dans une plaque de 48 puits et incuber dans la culture incubateur à 37 ° C pendant 15 min pour solidifier.
15. Après 15 min, ajouter avec précaution 250 ul de milieu de culture supplémenté avec organoïdeNicotinamide 10 mM, 10 uM et 10 uM Chir99021 Y27632. Fragments organoïdes perturbé petits feront en petits organites kystiques dans les 24 heures.

Jour 5:

16. Actualiser moyen et compléter avec un antibiotique de sélection (pour puromycine, utiliser 4 pg / ml).

Jour 7:

17. Remplacer milieu pour milieu de culture organoïde standard, complétée par le choix des antibiotiques.
    REMARQUE: en herbe sera terminée 2-3 semaines après le retrait Chir99021. Après la sélection, organites peuvent être cultivées sans sélection antibiotique.

4. Organoid ARN Préparation de RT-PCR quantitative ou puces à ADN

1. Pour la préparation d'ARN, en utilisant un kit commercial selon le protocole du fabricant. Retirer le support de organites et ajouter 350 ul de tampon RLT, complétées par des β-mercaptoéthanol droite sur le dôme de matrigel contenant organites. Reprendre les material dans RLT par pipetage utilisant p1000 micropipette.
2. Effectuer d'autres ARN préparation selon le protocole du fabricant.
3. Optionnellement: augmenter le rendement en ARN par amplification en utilisant le système Ovation Pico WTA, nécessitant l'apport initial de 50 ug d'ARN total selon le protocole du fabricant.
4. En option: contrôle de la qualité avant ARN microarray, échantillons se exécutent sur ​​un bioanalyseur 2100 en utilisant une puce ARN nano eucaryote totale, visant un certain nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) de 8,5 ou plus (Figure 5) selon le protocole du fabricant.

5. Traitement organoïdes pour inclusion dans la paraffine et immunohistochimie

1. Avant l'instauration du organoïde intégration pré-chauffer un bloc d'aluminium avec des trous de 12 mm tubes de verre de diamètre de montage en incubateur à 70 ° C pour empêcher le liquide de paraffine.
2. Prenez un seul bien avec organoïdes plein grandi et éliminer le milieu, laissant les organites embarqués intacte.
3. Ajouter 1 mlde 4% de paraformaldehyde dans PBS directement à bien et fixer à 4 ° C allant de 1 heure à une nuit.
4. Remplacer paraformaldéhyde avec 1 ml de PBS glacé.
   En option: garder organoïdes fixes dans du PBS jusqu'à 1 semaine à 4 ° C après cette étape.
5. Remettre en suspension organites fixes dans 1 ml de PBS et les placer dans un flacon de verre.
6. Laissez organites se enfoncent vers le bas pendant 1 min, décanter et remplacer avec du PBS 70% d'éthanol dans laquelle un couple de gouttelettes de solution d'éosine sont dissous pour permettre la visualisation des organites au long du processus d'enrobage.
7. Laisser organites dans 70% d'éthanol à température ambiante. Après 30 min, retirez 70% d'éthanol par décantation attentivement, être en mesure de visualiser les organites à l'oeil à cause de légère couleur rose éosine. Remplacer solution intégrant avec 96% d'éthanol.
8. Répétez l'étape 5.7, à chaque fois que le remplacement de la solution enrobage avec la suivante. Passez organoïdes travers les solutions suivantes: par la suite 70% d'éthanol, 90% d'éthanol, 96% d'éthanol, 100% ethanol, éthanol à 100%, le xylène, le xylène.
9. Décanter le dernier lavage de xylène et versez la paraffine dans le tube. Mettez immédiatement le tube dans le bloc d'aluminium pré réchauffé à 70 ° C pendant 30 min et remplacer la paraffine avec le nouveau paraffine propre.
10. Verser de paraffine et organites pipette dans le moule du bloc de paraffine à l'aide d'une pipette Pasteur préchauffé à grande ouverture. Gardez Pasteur pipette tiède avec un bec Bunsen. Placez les organites dans le moule du bloc de paraffine dans une petite couche de paraffine liquide.
11. Autant que possible, essayer de manipuler tous les organites vers le centre du moule de bloc de paraffine en utilisant une aiguille de dissection réchauffé. Gardez dissection aiguille chaude en utilisant un brûleur Bunsen.
12. Lorsque localisation des organites dans le moule est satisfaisante, lingotière légèrement pour solidifier la couche de paraffine.
13. Terminez le bloc en versant plus de paraffine sur le dessus et ajouter une cassette d'intégration histologique standard.

Résultats

Transduction lentiviral Organoid

La technique de transduction organoïde utilisant des particules lentiviraux dépend de manipulation correcte des organites avant et pendant la transduction. Organites (figure 3A) ont été cultivées et ils ont été perturbés dans cryptes simples (figure 3B). Comme indiqué précédemment, ces cryptes simples, lorsqu'elles sont cultivées en présence de l'inhibiteur de GSK3 Chir99021 cryptes sont devenues...

Discussion

Le protocole vidéo actuel décrit transduction lentiviral des organites de l'épithélium intestinal primaire et l'analyse en aval de ces organites en utilisant des techniques d'ARN quantitatifs et immunohistochimie.

Transduction lentivirale est souvent réalisée dans des cellules adhérentes ou flottantes dans des plaques de culture. Étant donné que la structure tridimensionnelle des organites les rend difficiles à pénétrer par des particules virales, un certain nombre de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025