Contraste échographie amélioré pour l'évaluation de la moelle épinière flux sanguin dans la partie expérimentale Traumatisme médullaire

Résumé

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Résumé

Réduction du flux sanguin de la moelle épinière (SCBF) (c.-à-ischémie) joue un rôle clé dans une lésion traumatique de la moelle épinière (SCI) pathophysiologie et est donc une cible importante pour les thérapies neuroprotectrices. Bien que plusieurs techniques ont été décrites pour évaluer SCBF, ils ont tous des limitations importantes. Pour surmonter ce dernier, nous proposons l'utilisation du temps réel contraste amélioré échographie (CEU). Ici, nous décrivons l'application de cette technique dans un modèle de contusion de rat de SCI. Un cathéter jugulaire est d'abord implanté pour l'injection répétée d'agent de contraste, une solution de chlorure de sodium de l'hexafluorure de soufre microbulles encapsulées. La colonne vertébrale est alors stabilisé avec un 3D-cadre sur mesure et de la moelle épinière dure-mère est exposée par une laminectomie au THIX-ThXII. La sonde à ultrasons est ensuite positionné à la partie postérieure de la dure-mère (revêtue de gel d'ultrasons). Pour évaluer SCBF base, une seule injection intraveineuse (400 pi) de contrest agent est appliqué pour enregistrer son passage dans le système microvasculaire de la moelle épinière intacte. Un dispositif à chute de poids est ensuite utilisé pour générer un modèle de contusion expérimentale reproductible de SCI. agent de contraste est ré-injecté 15 minutes après la blessure pour évaluer les changements post-SCI SCBF. CEU permet en temps réel et in vivo évaluation des changements de SCBF suivante SCI. Chez l'animal indemne, échographie a montré le flux sanguin inégale le long de la moelle épinière intacte. En outre, 15 min post-SCI, il y avait ischémie critique au niveau de l'épicentre tandis SCBF resté conservé dans les zones les plus reculées intacte. Dans les régions voisines de l'épicentre (à la fois rostrale et caudale), SCBF a été significativement réduite. Cela correspond à la «zone de pénombre ischémique» décrit précédemment. Cet outil est d'un intérêt majeur pour évaluer les effets des thérapies visant à limiter l'ischémie et la nécrose tissulaire résultant à la suite de SCI.

Introduction

Lésion de la moelle épinière (SCI) est une maladie dévastatrice qui conduit à une altération significative du moteur, sensoriel et les fonctions autonomes. À ce jour, aucun traitement a démontré son efficacité chez les patients. Pour cette raison, il est important d'identifier de nouvelles techniques qui permettront d'améliorer l'évaluation des traitements potentiels et peut encore élucider blessures pathiophysiology ^1.

SCI est divisé en deux phases successives, dénommé blessures primaires et secondaires. La blessure primaire correspond à l'insulte mécanique initiale. Alors que les groupes de blessures secondaires une cascade d'événements biologiques différents (tels que l'inflammation, le stress oxydatif et l'hypoxie) qui contribuent à la suite de l'expansion progressive de la lésion initiale, des lésions tissulaires et donc le déficit neurologique ^2,3.

A la phase aiguë de la SCI, thérapies neuroprotectrices visent à réduire la pathologie de la lésion secondaire et should conséquence d'améliorer les résultats neurologiques. Parmi les nombreux événements de blessures secondaires, l'ischémie joue un rôle essentiel ^{de 4,5.} Au niveau de l'épicentre SCI, les microvaisseaux du parenchyme endommagés entravent le flux sanguin de la moelle épinière efficaces (FERC). En outre, SCBF est également significativement réduite dans la région entourant l'épicentre de blessure, une zone spécifiquement connu comme la «zone de pénombre ischémique». Si SCBF ne peut pas être rapidement rétablie dans ces régions, l'ischémie peut conduire à une nécrose parenchymateuse supplémentaires et des dommages aux tissus plus nerveux. Comme même la préservation des tissus moindre peut avoir des effets importants de la fonction, il est d'un intérêt majeur pour développer des médicaments et des thérapies qui peuvent réduire l'ischémie post-SCI. Pour mettre en évidence ce phénomène, travaux antérieurs ont montré que la préservation de seulement 10% des axones myélinisés était suffisant pour permettre la marche chez les chats post-SCI ^6.

Bien que plusieurs techniques ont été décrites pour évaluer SCBF, lay ont tous des limitations importantes. Par exemple, l'utilisation de microsphères radioactives ^7,8 et C14-iodopyrine autoradiographie ⁹ nécessite ultérieure sacrifice animal et ne peut être répétée à plus tard points de temps. La technique de dégagement d'hydrogène ¹⁰ dépend de l'insertion d'électrodes intraspinales, qui peut en outre endommager la moelle épinière. Alors que l'imagerie laser Doppler, photopléthysmographie ^14,15 et in vivo microscopie optique ¹⁶ ont une profondeur / zone très limitée de la mesure ^11-13.

Notre équipe a déjà montré que contraste amélioré ultrasons (CEU) imagerie peut être utilisée pour évaluer en temps réel et in vivo les changements de SCBF dans le parenchyme rat de la moelle épinière ^17. Il est important de noter que une technique similaire a été appliquée par Huang et al., Dans un modèle porcin de ¹⁸ SCI. CEU applique un mode spécifique d'imagerie par ultrasons qui permet d'associer im morphologique niveaux de grisâges (obtenus par le mode B classique) avec la distribution spatiale du flux sanguin ^19. L'imagerie de SCBF et la quantification repose sur l'injection intravasculaire de produits de contraste pour échographie. L'agent de contraste est constitué de microbulles d'hexafluorure de soufre (de diamètre moyen d'environ 2,5 pm et 90% d'un diamètre inférieur à 6 pm) stabilisées par des phospholipides. Les microbulles reflètent le faisceau d'ultrasons émis par la sonde améliorant ainsi l'échogénicité de sang et augmentant le contraste des tissus en fonction de leur flux sanguin. Il est donc possible d'évaluer le débit sanguin dans une région d'intérêt donnée fonction de l'intensité du signal réfléchi. Les microbulles sont également sans danger et elles ont été appliquées cliniquement chez l'homme. L'hexafluorure de soufre est rapidement effacé (la demi-vie terminale est de 12 min) et plus de 80% de l'hexafluorure de soufre administrée sont retrouvés dans l'air expiré dans les 2 minutes après l'injection. Ce protocole fournit un moyen simple d'utiliser CEU imvieillissement à évaluer les changements SCBF chez le rat.

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Protocole

NOTE: Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont été approuvés par le comité de bioéthique de l'École de médecine Lariboisière, Paris, France (CEEALV / 2011-08-01).

1. Instrument Préparation

1. Préparer et nettoyer les instruments suivants pour l'insertion du cathéter: micro-pinces, des ciseaux, des micro-micro-vasculaire, pince grands ciseaux, fils chirurgicaux (noir tressé de soie 4-0) et un cathéter 14 G. Hépariner le cathéter avec une solution d'héparine (5000 U / ml).
2. Préparer et nettoyer les instruments suivants pour la laminectomie: grands ciseaux, scalpel et d'un coupe-os. Effectuer laminectomie avec un coupe-os-mesure visant à réduire le risque de nuire à la moelle épinière au cours de la laminectomie (Figure 1).
3. Mise en place du cadre 3D utilisé pour le positionnement et la stabilisation de l'animal. Le cadre fait sur mesure est construit avec les éléments d'un fixateur externe Hoffman 3 en association avec forceps, which ont été courbé afin d'adapter la colonne lombaire de l'animal.
4. Préparez l'appareil à chute de poids (impacteur) utilisé pour la moelle épinière des blessures biomécanique.
   REMARQUE: Le dispositif d'impaction sur mesure a été conçu avec un logiciel 3D et imprimé en 3D.
5. Mettez la machine à ultrasons.
6. Préparation du kit pour la reconstitution de l'agent de contraste.
   NOTE: Le kit comprend 1 flacon contenant 25 mg de poudre lyophilisée, la seringue pré-remplie 1 contenant 5 ml de chlorure de sodium et un système de transfert mini-pic (Figure 2). Les étapes pour la reconstitution de l'agent de contraste sont détaillées ci-dessous (dans la section 5).

2. Veine jugulaire cathétérisme (Figure 3)

1. Anesthésier l'animal avec 4% d'isoflurane. Placez l'animal en position couchée. Confirmez anesthésie appropriée en veillant à ce que l'animal ne répond pas lorsque les pattes sont pincées avec une pince. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis under anesthésie.
2. Rasez le cou et nettoyer la peau. Faire une incision sur la ligne médiane du cou. Rétracter le muscle sternocleidomastoidian afin de trouver la veine jugulaire interne. Serrer une ligature à la partie rostrale de la veine.
3. Appliquer une pince microvasculaire sur la veine, 1 cm en dessous de la ligature. Passez un autre thread autour de la veine, juste en dessous de la pince avec le noeud prêt à être serrés lorsque la pince est libéré.
4. Ouvrez la paroi de la veine (veinotomie) entre la pince et la ligature rostrale. Introduire un cathéter 14 G dans la lumière de la veine et le pousser vers le cœur.
5. Quand il se heurte à la pince, libérer ce dernier et pousser le cathéter plus loin. Fixez le cathéter dans la veine, en serrant fermement le noeud sur la veine avec le cathéter à l'intérieur.
6. Évaluer la perméabilité du cathéter en retirant une petite quantité de sang veineux dans le cathéter et par la suite puis rinçage avec une solution saline héparinée. Cela empêche l'obstruction de la catheter par un caillot de sang potentiel.
7. Connectez tube flexible au cathéter pour injection supplémentaire d'agent de contraste (microbulles). Garder fermée (scellée) avant d'être prêt à l'emploi.

3. Accès à la colonne vertébrale, laminectomie et Rat de positionnement (dans le cadre de la 3D)

1. Placez l'animal dans une position horizontale sujettes plat. Rasage et nettoyer le dos (région thoracique) de l'animal.
2. Identifier la dernière côte (XIIIe chez le rat) par palpation (Figure 4). Ceci permet d'estimer la position de la vertèbre thoracique XIII (ThXIII).
3. Faire un 4 cm incision de la peau sur la ligne médiane, centrée sur ThXIII. Ouvrez l'incision de la peau ainsi que la bourse sous-jacent. Observez l'aponévrose des muscles du dos ainsi que les conseils des processus de colonne vertébrale.
4. Localiser attentivement le processus de la colonne vertébrale de ThXIII en palpant les nervures de XIIIe.
   NOTE: La nervure XIIIe est connecté à ThXIII et représente donc un outil facile à locarepère anatomique te pour l'identification des ThXIII. Cette étape permet la localisation de l'ThXII à THIX apophyse épineuse ainsi que L1 et L2 (première et deuxième vertèbres lombaires).
5. Couper l'aponévrose musculaire et détacher les muscles de chaque côté pour exposer les apophyses épineuses, les lames et les joints de facette de THIX à L2. Exposer les aspects latéraux de L1 et L2 en détachant les muscles des apophyses transverses.
6. Accrocher les incisives de l'animal sur le 3D-cadre pour fixer la position (Figure 5). Fixer les vertèbres L1 et L2 avec la pince modifiés. Branchez la pince modifiées au-cadre 3D afin de stabiliser l'animal.
7. Tirez doucement caudale la pince de fixation du rachis lombaire afin de resserrer l'ensemble colonne vertébrale et d'élever le thorax du banc.
   NOTE: Avec l'agencement décrit l'animal doit être capable de respirer. En outre, malgré les mouvements respiratoires de la cage thoracique, la colonne vertébrale et de la moellecordon devrait également rester immobile.
8. Retirez le processess épineuse de THIX à ThXII. Insérez délicatement la lame inférieure de la coupe de l'os sous la lame gauche de ThXII puis fermez la coupe osseuse afin de couper la lame (Figure 6).
9. Répéter la même manœuvre pour la lame droite et retirer successivement l'arc postérieur. Répétez les étapes précédentes pour la vertèbres ThXI à THIX afin de parvenir à une laminectomie à quatre niveaux. Retirez les deux joints de facette pour chaque vertèbre.
   REMARQUE: Tout au long de la procédure, nettoyer le champ opératoire d'une hémorragie locale. Pour cela, utilisez des tampons de coton et de l'irrigation avec une solution saline tiède. Hémostase se produit systématiquement quelques minutes.

4. CEU Probe Positionnement

1. Couvrir la dure-mère avec un gel à ultrasons. Ceci permet une transmission efficace des ondes ultrasonores entre la sonde et la moelle épinière (figure 7).
2. Stabiliser l'esprit de la sonde à ultrasonsha pince qui peut être connecté par la suite à la trame 3D par un bras articulé. Positionner manuellement la sonde. Assurez-vous que la sonde est orienté pour obtenir une coupe sagittale longitudinale oblique. En position correcte, la moelle épinière est strictement horizontal sur l'image et le canal central de la moelle épinière est visible le long du segment complet de la moelle épinière.
   NOTE: Positionnement devrait être guidée par l'image en temps réel en mode B affichée sur l'écran de la machine à ultrasons. La distance focale de la sonde à ultrasons doit être aligné avec le canal central de la moelle épinière. A ce moment, la face postérieure de la moelle épinière est accessible ce qui en fin de compte pour permettre le positionnement de l'élément de frappe.
3. Lorsque optimale, bloquer le bras articulé pour stabiliser la position.

5. Préparation de l'agent de contraste - Reconstitution de microbulles

1. En utilisant le contenu d'un kit de reconstitution commerciale et connecter la tige de piston en l'attachant tightly dans la seringue (sens horaire). Ouvrez le blister du système de transfert et enlever le capuchon de la seringue. Ouvrez le bouchon du système de transfert et connecter la seringue pour le système de transfert (fixer hermétiquement).
2. Retirez le disque de protection du flacon. Faites glisser le flacon dans le manchon transparent du
3. système de transfert et appuyez fermement pour verrouiller le flacon en place.
4. Vider le contenu de la seringue dans le flacon en poussant sur la tige de piston. Agiter vigoureusement pendant 20 secondes pour mélanger tous les contenus dans le flacon pour obtenir un liquide homogène d'un blanc laiteux.
5. Retourner le système et retirer soigneusement l'agent de contraste dans la seringue. Dévissez la seringue du système de transfert. Après reconstitution (comme indiqué), 1 ml de la dispersion obtenue contient de 8 pi de l'hexafluorure de soufre dans les microbulles. Dessinez la suspension de microbulles dans une seringue de 100 ml. Insérez le 100 ml seringue dans la pompe électrique. Fermez le couvercle.
6. Lancer une agitation constante de la rémicrobulles constitué. Obtenu sous agitation constante par rotation lente de la seringue, qui maintient la suspension de microbulles. Brancher la pompe au cathéter jugulaire à travers le tube flexible. Régler la machine à ultrasons pour "mode harmonique".
   REMARQUE: Cette dernière correspond à la manière dont les microbulles peuvent être spécifiquement détectées et visualisées. Ce mode a un faible indice mécanique, qui ne détruit pas les micro-bulles par rapport à la B-mode.
7. Purger le cathéter de perfusion de la première dose (400 pi) de l'agent de contraste. Au cours de cette première perfusion, vérifier que les microbulles ne apparaissent sur l'écran de l'échographie. Ceci confirme que l'ensemble du circuit (à partir de la seringue à la circulation sanguine du rat) est intacte et ouverte.
8. Réglez l'appareil à ultrasons à "mode B" pour visualiser le parenchyme de la moelle épinière et la destruction de ces microbulles restant dans la circulation sanguine. La fréquence élevée de la «B-Mode" tranhaute énergie smits les microbulles, qui leur permet de panne.
9. Laissez l'animal était encore environ 30 min. Cette période permet la stabilisation des paramètres hémodynamiques.

6. Évaluation du SCBF dans la moelle épinière Intact

1. Régler la machine à ultrasons pour le mode "Harmonic". Lancer la fois (1) la perfusion d'agent de contraste (400 ul) et (2) le chronomètre.
   Remarque: Au cours de la perfusion, la concentration de microbulles dans la circulation sanguine doit augmenter, ce qui permet l'imagination de contraste de la moelle épinière (figure 8). Etant donné que les microbulles sont rapidement détruites, la concentration sanguine de microbulles commence à diminuer dès que l'injection est terminée ce qui génère une diminution progressive de contraste visualisation de la moelle épinière.
2. Après le bouton "Clip Store" sur la machine à ultrasons 1 min, sélectionnez (de presse). Cela permettra un pour sauver 1 min de raw données de l'échographie et l'enregistrement vidéo d'imagerie (qui a été précédemment affiché sur l'écran de l'échographie).
3. Régler la machine à ultrasons pour "B-Mode". Cela permettra d'éliminer les microbulles restants.

7. expérimentale SCI

1. Utilisation du micromanipulateur relié à la trame 3D, positionner le dispositif de l'impaction de poids-goutte de sorte que la pointe de l'impacteur entre en contact avec la dure-mère (sur la ligne médiane de la moelle épinière), à la jonction entre THX et ThXI (Figure 9) .
   Remarque: Ce niveau doit correspondre au milieu du segment de la moelle épinière observée avec le dispositif à ultrasons. Le percuteur et le corps de l'élément de frappe sont de 8 mm de diamètre. La pointe de l'impacteur, qui va générer la blessure, est de 3 mm de diamètre.
2. Placez la baguette du dispositif de l'impaction à une position de 10 cm de haut. Induire la SCI expérimentale en libérant l'attaquant du dispositif de l'impaction. L'attaquant tombe et libère ee impacteur, blessant la moelle épinière. L'impaction sur mesure offre un impact équivalent à un poids de 10 g tombant d'une hauteur de 10 cm.

8. Évaluation des SCBF 5 min post-SCI

1. Répétez les étapes décrites dans la section 6 (Évaluation des SCBF). Les microbulles seront incapables de passer à travers la microvascularisation endommagé et l'épicentre de blessure restera sombre (Figure 10).

9. Sacrifice d'Animaux

1. Euthanasier l'animal avec une injection intraperitoneale létale de pentobarbital (100 mg).

10. Quantification des SCBF par Analyse Offline

1. Démarrez le logiciel Ultra-Extend utilisée pour la quantification (sur machine à ultrasons). Sélectionnez "Fichier" puis sélectionnez les données brutes préalablement enregistrés et ouvrir les fichiers associés. Activez le mode «quantification» en appuyant sur ​​le bouton "Chi Q" (sélection). Select "Set ROI" (bouton) et de choisir la forme circulaire.
2. Sélectionnez "Dessiner ROI" (bouton) et d'en tirer sept régions adjacentes circulaires d'intérêt (ROI) sur la moelle épinière (Figure 11). Ouvrez le menu "Montage" et choisissez la "valeur de la courbe" de fonction. Observez le logiciel affichant plusieurs courbes, correspondant chacun à des changements de concentration de microbulles l'intérieur d'un retour sur investissement.
   NOTE: Chaque courbe a une "perfusion deperfusion" profil. La première phase de la courbe est plate et correspond à la période avant l'arrivée des microbulles. Dans la deuxième phase, la concentration de microbulles augmente rapidement par suite de la perfusion. Dans la troisième phase, qui commence lorsque la perfusion est terminée, la concentration de microbulles diminue progressivement car ils disintegratse dans la circulation sanguine.
3. Placer la première ligne verticale au début de la deuxième phase de la cUrve et sélectionnez «SET». Ceci indique au logiciel où commencer analyse.
4. Placez la deuxième ligne verticale à la fin de l'enregistrement et sélectionnez à nouveau "SET". Ceci indique au logiciel où pour arrêter analyse.
5. Regardez le menu «Cv» et enregistrer la valeur "AUC", qui correspond à la "aire sous la courbe" analysé. Cette valeur est proportionnelle à la SCBF à l'intérieur de la ROI correspondant.

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Résultats

Avec le protocole décrit ci-dessus, il est possible de mapper le SCBF le long d'un segment de la moelle épinière sagittal longitudinal.

Dans la moelle épinière intacte, il semble y avoir des irrégularités de SCBF au sein du parenchyme (Figure 12). Ceci peut être expliqué par la répartition variable des artères radiculo-médullaire (RMA) d'un animal à l'autre. RMA se réfère à segmentaire artères qui atteignent l'artère spinale antérieure (ASA...

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Discussion

Bien que nous avons décrit comment utiliser CEU chez un rat SCI modèle de contusion, ce protocole peut être modifié pour tenir d'autres objectifs expérimentaux ou modèles SCI. Nous avons choisi de mesurer SCBF à seulement deux points dans le temps (avant la lésion et 15 min post-SCI), mais le nombre de points dans le temps et le retard entre les mesures de SCBF peuvent être adaptés pour répondre aux besoins d'autres études. Par exemple, dans notre travail précédent ^17, nous avons mesuré...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job