Mosaïque poisson zèbre transgénèse pour l'analyse génomique fonctionnelle des gènes candidats de coopération dans la tumeur pathogenèse

Résumé

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Résumé

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Les cancers sont des maladies évolutives marquées par l'accumulation de mutations pathologiques, des suppressions et des gains de chromosomes au cours du temps. Ces anomalies génétiques peuvent influer sur des processus cellulaires multiples allant du cycle cellulaire, la mort cellulaire, le métabolisme énergétique et l'assemblage du cytosquelette d'insister sur les réponses telles que l'hypoxie. Par conséquent, la tumorigenèse reflète les actions collectives de multiples aberrations génétiques à travers un éventail de processus biologiques. Des efforts récents d'intégration génomiques de recherche, y compris l'ensemble du séquençage du génome, le séquençage de l'exome, le séquençage ciblé, le séquençage profond et études d'association pangénomique, ont identifié un nombre croissant d'altérations génétiques dans pratiquement tous les nouveaux types de tumeurs ^1-4. Dans de nombreux cas, les lésions génétiques se produisent ensemble d'une manière non aléatoire ^8/5, ce qui suggère leur coopération dans la pathogenèse de la maladie. Disséquer les rôles oncogéniques de la vaste gamme de gènes exprimés de façon aberrante résultant felon ces lésions génomiques est nécessaire de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de comprendre les réponses des cellules tumorales à ces agents, mais cela se est avéré être une tâche ardue, nécessitant des systèmes de modèles animaux très robustes pour la conduite de l'analyse génomique fonctionnelle à haut débit dans vivo.

Bien que les mammifères, notamment les rongeurs, des modèles favorisées en biologie du cancer, du poisson-zèbre est commencé à attirer une attention considérable. Le téléostéens poisson zèbre (Dario rerio) a été utilisé comme un organisme modèle pour l'étude de développement depuis les années 1960 et a été appliquée à l'étude de la pathogenèse de la tumeur première fois en 1982 ^9-11. Facilité de maintenance, de petite taille du corps, et une fécondité élevée rendre le poisson zèbre, un modèle robuste pour les grands écrans génétiques à terme pour identifier les mutations qui confèrent des phénotypes anormaux et pathologiques ^10. La transparence optique des embryons de poisson zèbre est un autre élément clé de soutien plus large utilisation de ce modèle de cancer,il permet l'imagerie in vivo être menées pour localiser le développement de la tumeur en temps réel ^9, une application qui est relativement difficile chez les rongeurs ^12. Génomique comparative récente analyse du génome de référence poisson zèbre (Zv9) a révélé 26 206 gènes codant pour des protéines, avec 71% ayant orthologues humains, dont 82% sont corrélés avec des gènes associés à la maladie de la ligne mendélienne héritage à Man base de données (OMIM) ^{13, 14.} Par conséquent, le poisson-zèbre a été utilisé pour modéliser différents types de cancers humains, y compris le neuroblastome ^8, des cellules T de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL-T) ^{15,16, 17,18} mélanome, le sarcome d'Ewing ^{19, 20,21} rhabdomyosarcome, le carcinome du pancréas ^22, carcinome hépatocellulaire et ²³ tumeurs malignes ^24,25 myéloïde, et a été choisi comme un modèle de cancer pour la xénotransplantation étudie ^11,26.

Un transgénique stableapproche chez le poisson zèbre est couramment utilisé pour étudier l'effet de gain de fonction des gènes dans le développement normal ou maladie pathogenèse ^27,28. Pour développer un tel modèle (figure 1A), on injecte un produit d'assemblage d'ADN contenant le gène d'intérêt dirigé par un promoteur spécifique d'un tissu dans une des cellules d'embryons de type sauvage. Trois à quatre mois après l'injection, lorsque les embryons injectés atteignent la maturité sexuelle, ils sont par croisement avec des poissons sauvages pour dépister ceux qui décrivent l'intégration de la construction d'ADN dans leur lignée germinale, qui les licences que les poissons fondateur. De nombreux facteurs, tels que le nombre de copies et le site d'intégration du transgène, affectent l'expression du transgène dans des lignées transgéniques stables. Ainsi, afin de développer un modèle de tumeur transgénique, plusieurs lignées transgéniques stables surexprimant un seul oncogène doivent être générés premier et projeté de la ligne exprimant le transgène à un niveau qui pourrait conduire à l'induction de tumeurs. Cependant, si la surexpression d'un candidat oncogene est toxique pour les cellules germinales, il est difficile de générer une lignée transgénique stable directement en surexprimant le transgène ^29. Par conséquent, cette approche peut prendre beaucoup de temps, avec un risque élevé d'échec pour générer un modèle de cancer approprié.

Ici, nous montrons une stratégie de rechange sur la base de la transgenèse mosaïque transitoire (figure 1B) qui fournit des avantages uniques par rapport transgénèse classique stable pour l'étude génomique fonctionnelle in vivo. Dans cette approche, un ou plusieurs constructions transgéniques sont injectés dans le stade d'une cellule d'transgéniques ou de type sauvage embryons. Les constructions d'ADN injectés contenant des transgènes sont alors mosaically et aléatoirement intégrés dans le poisson injecté primaire, résultant en génotypes mixtes au sein des populations de cellules multiples dans chaque poisson ^30. De plus, la co-injection d'ADN dans des embryons multiples construit une des cellules conduit à la co-intégration dans la même cellule dans des sites aléatoires, ce qui permet à une traCE les cellules avec une expression de transgènes et d'explorer les interactions des gènes différents au cours pathogenèse de la maladie chez les animaux mosaïque ^31. Comme preuve de principe, nous transitoirement surexprimé ALK par mutation activée (F1174L) avec le gène rapporteur mCherry dans le système nerveux sympathique périphérique (SNPS) sous le contrôle du hydroxylase dopamine bêta (d βh) de promoteur en poissons sauvages et poissons transgéniques surexprimant MYCN. ALK, qui code pour un récepteur tyrosine kinase, est le gène le plus fréquemment muté dans le neuroblastome à haut risque ^5-7,32,33. ALK (F1174L), comme l'un des mutations activatrices somatiques les plus fréquentes et les plus puissants, est sur-représentée dans MYCN- amplifié patients de neuroblastome à haut risque et en synergie avec MYCN surexpression d'accélérer neuroblastome tumorigenèse chez les souris transgéniques stables et des modèles de poisson zèbre transgénique ^8,34,35. Par mosaïquela surexpression transitoire de ALK (F1174L) avec mCherry dans le poisson transgénique MYCN, on a récapitulé l'accélération de l'apparition de la tumeur observée dans le poisson transgénique stable surexprimant la fois ALK (F1174L) et MYCN, ce qui suggère que la stratégie de transgénèse mosaïque peut être utilisé pour rapidement et efficacement évaluer les contributions respectives de plusieurs oncogènes dans l'initiation de la tumeur in vivo.

Protocole

NOTE: Toutes les études de poisson zèbre et l'entretien des animaux ont été effectuées en accord avec la Mayo Clinic Institut IACUC approuvé le protocole # A41213.

1. Constructions d'ADN pour la transgenèse

1. Amplifier un 5,2 kb dopamine beta hydroxylase (d βh) région promotrice ⁸ en utilisant le clone CH211-270H11 BAC (de BACPAC centre de ressources (BPRC)) comme une matrice d'ADN. Utilisation d'un système approprié de PCR pour l'amplification par PCR de matrices d'ADN longues de long et précis et les programmes de cycles suivants pour la PCR: 94 ° C pendant 2 min, 10 cycles de (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), suivie de 30 cycles de (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (amorce sens 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' et amorce anti-sens 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
2. Créez le d βh -pDONRP4-P1R entrée cloNE ⁸ en utilisant le système de clonage recombinant commercial comme passerelle multisite. Mélanger 1 pl de produit de DßH purifiée PCR (172 ng / pl), 1 pi (150 ng / ul) vecteur donneur pDONRP4-P1R (avec d'autres vecteurs de passerelle sont des dons généreux du Dr Chi-Bin Chien, Univ. De l'Utah) , 4 pi de tampon TE (pH 8,0) avec 2 pi de BP clonase mélange enzymatique, incuber pendant 1 heure à 25 ° C, puis se transforment en un TOP10 Shot E. compétente coli selon le protocole du fabricant.
3. Générez le d βh: transgénique EGFP-MYCN construire ⁸ en utilisant le système de clonage recombinant mentionné dans l'étape 1.2. Mélanger 1 ul de chaque clone d'entrée (150 ng / ul) comprenant un 5,2-kb promoteur de DßH (DßH -pDONR P4-P1R construction), EGFP manque un codon d'arrêt (PME-EGFP construction), et MYCN humaine ADNc (un don généreux du Dr Hogarty à l'Hôpital pour enfants de Pennsylvanie, MYCN-pDONRP2R-P3 construction), 1 pi (150 ng / pl) du vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne), 4 pi de tampon TE ( pH 8,0) avec 2 ul de mélange enzymatique Clonase LR, incuber pendant 1 h à 25 ° C, puis à transformer chimiquement compétente E. coli comme un haut de tir 10 et suivre le protocole du fabricant.
4. Assurez-MITF: transgénique MITF construire ^huit en digérant le vecteur PNP-MITF avec Notl et Sali enzymes de restriction pendant 2 h à température ambiante, et en sous-clonant le libéré 2,65 kb (un don généreux de Dr. D. Raible, Univ of Washington.) Fragment d'ADN qui contient le promoteur de MITF et la séquence codante du gène MITF poisson zèbre dans les sites Notl et Mlul d'un vecteur pBluescript modifié contenant flanquant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux du Dr. Hui Feng, Boston University), en utilisant la ligase d'ADN T4 selon le protocole du fabricant.
   NOTE: Pour augmenter l'efficacité de la génération de lignées MYCN dites-vous stables, d βh: EGFP-MYCN et MITF:. Constructions d'ADN MITF sont co-injectés dans l'une des cellules d'embryons de nacre étape Nacre désigne un type de poisson mutant manquant d'un crête neurale dérivés mélanophores ³⁶ au cours du développement. Ainsi, l'apparition de cellules de pigment dans les embryons injectés suggère l'intégration de MITF: MITF construit ADN dans le génome. Il a été démontré que deux ou trois constructions d'ADN peuvent être co-injectés co-intégrées dans le génome de poisson ^31. Ainsi, la pigmentation causée par l'expression MITF peut servir de marqueur pour l'intégration de la DßH: transgène EGFP-MYCN et pour faciliter l'identification des MYCN lignée transgénique stable.
5. Mélanger le d βh: EGFP-MYCN et MITF: ADN MITFdes constructions à un rapport de 3: 1 dans un volume total de réaction de 15 ul avec 1 ul d'enzyme I-Scel et 0,75 ul de tampon. Assurez-vous que la quantité totale d'ADN dans la réaction ne dépasse pas 750 ng.
6. Effectuer la digestion I-Scel à température ambiante pendant 4 h ou O / N. Le deuxième jour, l'I-SceI- ADN digéré sont prêts pour la micro-injection ou peuvent être conservés à -20 ° C pour l'injection dans le futur. Stocker l'enzyme I-Scel à -80 ° C en petites aliquotes à maintenir son efficacité enzymatique.
7. Sous-cloner l'ALKF1174L humaine et le gène ALK-type sauvage à partir du vecteur pcDNA3 (un don généreux de M. George au Dana-Farber Cancer Institute) ⁷ dans les sites EcoRI et Notl d'un vecteur pENTRY1A (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne) en utilisant l'ADN ligase T4 selon le protocole du fabricant.
8. Générez le d βh: ALKF1174L </ Em> ou DßH: constructions transgéniques ALKWT utilisant le système recombinant comme mentionné dans le protocole 1.2. Brièvement, combiner trois clones d'entrée, DßH -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (ou ALKWT -pENTRY1A) et P3e-polyA, dans le vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne), en utilisant LR Clonase enzyme Mix, selon le protocole du fabricant.
9. Mélanger le d βh: ALKF1174L (ou DßH: ALKWT) et DßH: mCherry constructions d'ADN à un ratio de 3: 1 et les linéarisent avec I-Scel enzyme comme décrit dans le protocole 01/05 au 01/06.

2. microinjection

1. Utilisation micropipettes en verre d'un diamètre de 1,0 mm pour toutes les injections ^37. Casser la pointe des micropipettes de verre avec une lame de rasoir avant l'injection. Calibrer le volume d'injection par injectioning H ₂ O dans une goutte d'huile minérale. Mesurer le diamètre des gouttelettes obtenues et régler le micro-injecteur (pression ou la durée d'impulsion de pression) afin d'assurer que le volume d'injection est inférieure à 10% du volume total de la pile de cellules d'embryons une étape.
2. Ajouter un 0,5 pi supplémentaires de frais enzyme I-Scel (5 unités / ul) dans 5 pi de solution injectable contenant de l'ADN construit juste avant l'injection pour augmenter l'efficacité de la transgénèse ^38. Injecter 50 à 80 pg de constructions d'ADN linéarisées dans le cytoplasme des embryons de stade unicellulaire. Pour assurer le succès de l'injection, mélanger l'échantillon avec 0,25% de phénol rouge pour la visualisation. Si les cellules deviennent rouges après l'injection, il indique la micro-injection est réussie. Afin d'assurer un taux de réussite élevé pour générer des poissons transgéniques, nous injectons généralement jusqu'à 500 embryons.
3. Pour générer poissons transgéniques exprimant de manière stable MYCN, coinject linéarisé d βh: EGFP-MYCN et MITF: constructions d'ADN MITF (à un ratio de 3: 1) dans des embryons de la pigmentation mutant nacre poisson zèbre au stade unicellulaire. L'expression de Mitf sert en tant que journaliste pour l'intégration des constructions transgéniques dans le génome du poisson.
4. Pour surexpression mosaïque de ALK dans le type sauvage ou MYCN embryons transgéniques, co-injecter le linéarisé d βh: ALK F1174L (ou DßH: ALKWT) avec DßH: mCherry constructions d'ADN (à un ratio de 3: 1) dans l'une des cellules embryons résultant de l'élevage de la F1 hétérozygotes Tg (DßH: EGFP-MYCN) poisson transgénique de type sauvage AB poissons. Ainsi, la moitié des enfants sont transgéniques pour MCYN et la moitié sont de type sauvage.

3. écran pour le poisson transgénique stable ou en mosaïque

1. Pour augmenter l'efficacité de l'identification des lignes de MYCN dites-vous stables, anesthésier embryons de nacre principalement injectés avec tricaïne (0,02%) at jours 3-5 de post-fécondation et l'écran de la pigmentation. Transférer les embryons avec une pigmentation d'une nouvelle boîte de Pétri avec de l'eau d'oeuf frais et de les élever à la maturité sexuelle pour un examen plus poussé pour le poisson fondateur, qui portent le d βh: transgène EGFP-MYCN dans les cellules germinales.
2. Pour identifier le fondateur avec transmission germinale de EGFP-MYCN, poissons F0 adulte pigmentée outcross de type sauvage AB poissons et de l'écran pour les embryons de EGFP positif à 1-2 jours après la fécondation pour plus génotypage. Placez une seule F1 embryon de EGFP positif dans un tube PCR et éliminer tout le liquide. Ajouter 50 ul de tampon d'extraction ADNg qui contient 12,5 pi de tampon de lyse 4x, 35 ul H ₂ O et 2,5 pl de proteinase K (10 mg / ml) à seul embryon. Incuber le mélange réactionnel pendant 3/2 heure à 55 ° C, suivi par 10 min d'incubation à 98ºC pour inactiver la proteinase K. Pour 50 ml de tampon de lyse 4x, ajouter 500 ul de Tris 1 M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl to 47 ml de H ₂ O. NOTE: Après F0 MYCN stable poissons transgéniques sont élevés avec le type sauvage AB poissons, tous les descendants sont pigmentée. Ainsi, la pigmentation peut pas servir de marqueur pour l'identification des poissons MYCN- positive. Alors que dans le poisson transgénique MYCN, la protéine de fusion EGFP-MYCN est exprimé dans la SNPS, y compris les neurones sympathiques du ganglion cervical supérieur et séquentielle segmentaire ganglion de la chaîne sympathique et les neurones dopaminergiques non-PSN, telles que le bulbe rachidien et ⁸ ganglions crâniens. Ainsi, l'expression de EGFP peut servir de marqueur pour l'identification des embryons transgéniques stables MYCN.
3. Utilisez 2 pi de gDNA extraites de l'embryon F1 pigmentée comme matrice, les amorces MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 », et l'esprit de programme suivanth, le GC-RICH système de PCR: 1 cycle de 95 ° C pendant 3 min, 25 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 58 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 3 min. Nous génotype généralement de 14 à 16 embryons pigmentées à partir d'un seul accouplement pour confirmer la présence du transgène MYCN intégré dans les embryons pigmentées, plus de 6 fondateur poissons surexprimant MITF et MYCN ont été identifiés par cette méthode.
4. Levez le reste des embryons F1 EGFP-positif. Nageoire et le génotype eux à 2-3 mois de l'âge en utilisant le protocole ci-dessus pour confirmer davantage l'intégration des MYCN transgène dans le poisson. F1 Race MYCN poisson transgénique stable avec de type sauvage AB poissons. Co-injecter le d linéarisé βh: ALK F1174L (ou DßH: ALKWT) avec DßH: mCherry d'ADN dans les cellules des embryons une comme décrit dans le protocole 2.4.
5. Trier le MYCN dites-vous embryons dans l'expérience décrite dans le protocole 2.4 utilisant un fluor stéréoscopiqueescence microscope et dépister les embryons principalement injectés à jour 1-3 de post-fécondation pour l'expression de EGFP-MYCN dans le SNPS. Puis, au cours de 2-5 jours de post-fécondation, les embryons avec anesthésier tricaïne (0,02%) et de trier les embryons MYCN- positifs ou négatifs de nouveau sur la base de l'expression de mCherry dans les SNPS fluorescence en utilisant un microscope stéréoscopique. L'expression de mCherry sert de marqueur pour la co-expression de ALK dans les tissus des animaux injectés primaire mosaïque.
   REMARQUE: ~ 600 progéniture résultant de l'élevage de MYCN poisson transgénique stable avec de type sauvage poissons ont été injectés par groupe avec les constructions d'ADN linéarisées, y compris d βh: ALK F1174L et DßH: mCherry, DßH: ALKWT et DßH: mCherry ou DßH : mCherry seul, respectivement. Mosaïque de mCherry expression peut être observée dans 70-90% des poissons principalement injecté. La moitié de ONE-tiers des poissons injecté survécu par le stade de larves pour montre de la tumeur.
6. Relevez tous les mCherry + MYCN + et + mCherry MYCN - embryons selon les protocoles standards du livre poisson zèbre ³⁹ et de surveiller l'apparition de la tumeur à partir de 5 semaines post-fécondation.

4. tumeur Watch à Mosaic poissons transgéniques

1. Surveiller mCherry- positif poissons principalement injecté tous les deux semaines à partir de 5 semaines post-fécondation des preuves de l'apparition de la tumeur.
2. Anesthésier poisson avec tricaïne (0,02%) et l'écran de la présence de mCherry - et dites-vous EGFP tumeurs dans les SNPS sous le Nikon SMZ-1500 fluorescence stéréoscopique microscope équipé d'un viseur d'appareil photo numérique DS-U1.
3. Pour vérifier si les tumeurs expriment le transgène de ALK, isoler la mCherry- et des masses de EGFP positif pour ALK génotypage PCR.
4. En utilisant la PCR, l'ADN génomique à amplifierextrait de tumeurs développées avec les amorces suivantes: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'et ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' et la réaction PCR suivant: 1 cycle de 94 ° C pendant 5 min, 30 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 60 secondes). Ensuite, la séquence du produit PCR avec ALK P7 amorce pour confirmer encore l'existence de mutant ou de type sauvage ALK dans les tumeurs mCherry-positifs.

Résultats

Afin de déterminer si la surexpression de F1174L ALK par mutation activée ou de type sauvage ALK pourrait collaborer avec MYCN dans le neuroblastome induction, nous avons surexprimé soit ALK humaine activée ou de type sauvage ALK humaine sous le contrôle du promoteur d de βh dans le SNPS des poissons transgéniques surexprimant MYCN. Chacune des constructions suivantes, DßH - ALKF1174L ou DßH - ALKWT, ont été co-...

Discussion

Dans cette étude représentative, nous avons utilisé co-injection transitoire et co-expression de ALK activé avec le gène rapporteur mCherry dans MYCN dites-vous les poissons transgéniques à montrer que ces gènes coopèrent pour accélérer nettement le début de neuroblastome, conformément à notre constatation précédente composé stable coexprimant de poissons transgéniques deux ALK et MYCN ⁸ activé. Cette approche transgénique mosaïque possède plu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY