Électrorétinogramme Analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves

Résumé

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Résumé

L'électrorétinogramme (ERG) est une méthode non invasive électrophysiologique pour déterminer la fonction rétinienne. Grâce à la mise en place d'une électrode sur la surface de la cornée, l'activité électrique généré en réponse à la lumière peut être mesurée et utilisée pour évaluer l'activité des cellules rétiniennes in vivo. Ce manuscrit décrit l'utilisation de l'ERG pour mesurer la fonction visuelle chez le poisson zèbre. Poisson zèbre ont longtemps été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés raison de la facilité de la suppression de gènes par des oligonucléotides morpholino et la manipulation pharmacologique. A 5-10 dpf, seuls les cônes sont fonctionnelles dans la rétine des larves. Par conséquent, le poisson zèbre, la différence d'autres animaux, est un puissant système modèle pour l'étude de la fonction visuelle cône in vivo. Ce protocole utilise l'anesthésie standard, micromanipulation et protocoles stéréomicroscopie qui sont communs dans les laboratoires qui effectuent des recherches de poisson zèbre. Les méthodes décrites font usage de l'équation d'électrophysiologie normeATION et une caméra basse lumière pour guider le placement du micro-électrodes d'enregistrement sur la cornée larvaire. Enfin, nous démontrons comment un ERG stimulateur / enregistreur disponible dans le commerce à l'origine conçu pour une utilisation avec des souris peut facilement être adapté pour une utilisation avec le poisson zèbre. ERG de poisson zèbre larves fournit une excellente méthode de dosage cône fonction visuelle chez les animaux qui ont été modifiés par injection d'oligonucléotides morpholino ainsi que des techniques d'ingénierie des génomes plus récents tels que Zinc Finger nucléases (ZFN), Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALENs), et cluster régulièrement espacées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9, qui ont tous fortement augmenté l'efficacité et l'efficacité du ciblage de gène chez le poisson zèbre. En outre, nous profitons de la capacité des agents pharmacologiques pour pénétrer larves de poisson zèbre pour évaluer les composants moléculaires qui contribuent à la photoréponse. Ce protocole décrit une configuration qui peut être modifié et utilisé par les chercheursavec différents objectifs expérimentaux.

Introduction

L'électrorétinogramme (ERG) est une méthode électrophysiologique non invasive qui a été largement utilisé en clinique pour déterminer la fonction de la rétine chez les humains. L'activité électrique en réponse à un stimulus lumineux est mesuré en plaçant des électrodes d'enregistrement sur la surface externe de la cornée. Les caractéristiques du modèle de stimulus et la forme d'onde de réponse définissent les neurones rétiniens qui contribuent à la réponse. Cette méthode a été adaptée pour une utilisation avec un certain nombre de modèles animaux, y compris les souris et le poisson zèbre. La réponse ERG vertébrés typique a quatre composantes principales: l'une d'onde, qui est un potentiel de cornée négatif provenant de l'activité des cellules photoréceptrices; la b-ondes, un potentiel de cornée positif dérivé de l'ON cellules bipolaires; le d-ondes, un potentiel de cornée positif interprété comme l'activité des cellules bipolaires OFF; et c-ondes, qui se produit quelques secondes après le b-ondes et reflète l'activité dans la glie Müller et retInal épithélium pigmentaire ^1-4. Références supplémentaires pour comprendre l'histoire et les principes de l'analyse ERG chez les humains et les animaux modèles sont le manuel en ligne, WebVision, de l'Université de l'Utah et des textes tels que les Principes et pratique de électrophysiologie clinique de Vision ^{4, 5.}

Danio rerio (poisson zèbre) a longtemps été privilégiée comme un modèle pour le développement des vertébrés, en raison de sa maturation et la transparence rapide, ce qui permet pour l'analyse morphologique non invasive de systèmes d'organes, les tests comportementaux et les deux avant et arrière écrans génétiques (pour revue, voir Fadool et Dowling ^6). Larves de poisson zèbre sont prêtent très bien à la manipulation génétique et pharmacologique, qui, lorsqu'il est couplé avec leur taux de fécondité élevé, en font un modèle animal excellente pour les analyses biologiques à haut débit. Le ratio plus élevé de cônes à des tiges chez le poisson zèbre larves - environ 1: 1 par rapport à des souris (~ 3% cônes) - rendent particulièrement utile pour l'étude de la fonction de cône ^7-9.

Dans la rétine de vertébrés, cônes se développent avant ¹⁰ tiges. Fait intéressant, les cônes de poisson zèbre sont opérationnels dès 4 dpf, permettant une analyse électrophysiologique sélective des cônes à ce stade ^{6, 11,12.} En revanche, les réponses ERG en tiges apparaissent entre 11 et 21 dpf ^13. Par conséquent, larves de poisson zèbre à 4-7 servir dpf fonctionnellement comme une rétine tout-cône. Cependant, la réponse ERG photopique natif de 4-7 larves de DPF est dominée par la b-ondes. Application des agents pharmacologiques, tels que la L - (+) - 2-amino-4-phosphono-butyrique (L-AP4), un agoniste de glutamate métabotropique (mGluR6) récepteur exprimé par les cellules conductrices bipolaires, bloque efficacement la génération de la b-ondes et révèle le potentiel de masse isolée de cône du récepteur, (la «une vague») ^14-17.

Nous décrivons ici un simple et reliablméthode de e pour l'analyse ERG en utilisant l'équipement disponible dans le commerce ERG conçu pour une utilisation avec des souris qui ont été conçus pour être utilisés avec des larves de poisson zèbre. Ce système peut être utilisé sur des larves de poisson zèbre divers milieux génétiques, ainsi que ceux traités avec des agents pharmacologiques, pour aider les chercheurs à l'identification des voies qui contribuent à la sensibilité visuelle et adaptation à la lumière ¹⁶ signalisation. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole guideront les enquêteurs dans l'utilisation de l'analyse ERG pour répondre à une variété de questions biologiques relatives à la vision, et de démontrer la construction d'une configuration souple ERG.

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Protocole

l'entretien des animaux et des protocoles expérimentaux ont été approuvés par les soins et l'utilisation des comités institutionnels animales de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, et répondent à toutes les exigences de l'Office NIH de laboratoire bien-être animal et de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International.
NOTE: Pour obtenir des larves pour l'analyse ERG, publié protocoles pour l'élevage du poisson zèbre standard et l'entretien ont été employées ^18. Les larves sont obtenus grâce à la sélection naturelle et logé sous un / 10 h cycle d'obscurité 14 heures de lumière. Ce protocole a été optimisé pour les larves à 5-7 jours après la fécondation (DPF), mais pourrait idéalement être effectuées sur les poissons plus âgés avec de petites modifications de la procédure. Ici, utilisez la souche TL de type sauvage larves de poisson zèbre à 5 dpf.

1. Micropipette production

1. Tirez plusieurs micropipettes utilisant 1,5 x 0,86 mm (diamètre extérieur par diamètre intérieur) capillaires en verre borosilicate poli-feu avecfilament (température de fusion, 821 ° C) et un P-97 Flaming / Brown Micropipette Extracteur équipé filament boîte de chaleur. Utilisez le programme pour façonner micropipettes décrits dans le tableau 1.
2. Vérifiez chaque micropipette sous un microscope avec un dirigeant du réticule appropriée pour assurer que les pourboires sont de 10 à 15 m de diamètre et a un embout lisse ouverture (ie, sans bords dentelés).
3. Stocker soigneusement micropipettes pour prévenir les dommages de la pointe et l'exposition à la poussière. Les options de stockage comprennent des boîtes de Pétri avec du ruban de laboratoire, boîtes de mousse bordée, ou disponibles dans le commerce des conteneurs de stockage de micropipette.
   NOTE: D'autres extracteurs de micropipette et de verre capillaires peuvent être utilisés aussi longtemps que le diamètre correct de la micropipette et une pointe de haute qualité est atteint.

Pression	Chaleur	Tirer	Vitesse	Temps
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

Tableau 1: Programme pour la production de micro-pipettes l'aide d'un P-97 Flaming / marron Micropipette Extracteur équipé d'un filament boîte de chaleur Micropipettes sont faites en utilisant 1,5 x 1,0 mm ² (diamètre extérieur par diamètre intérieur) capillaires en verre borosilicate poli-feu avec filament. (température de fusion, 821 ° C).

2. Tampon Préparation

1. Utilisation filtré, le tampon de Ringer oxygénée poisson rouge ¹⁹ dans le capillaire de micro-électrodes et pour saturer l'éponge alcool polyvinylique (PVA), sur lequel les larves sont placés pour les expériences. Vous pouvez également utiliser l'E3 médias d'embryons ou solution saline équilibrée de Hank.
2. Préparer la solution de Ringer 10x poissons rouges comme décrit dans le tableau 2. ajuster le pH à 7,8 et stériliser l'aide d'un filtre de 0,22 um et stocker le 10x stock à 4 ° C.
3. Créer une solution de travail le jour de l'expérience en diluant la solution de Ringer à 1x 10x avec de l'eau distillée déminéralisée. Filtrer au moyen d'un système de filtre de 0,22 um. Oxygéner par barbotage avec 95% O _2/5% CO ₂ gazeux pendant 10 minutes. Couvercle de la cuvette par la suite pour se assurer que la solution reste oxygéné.

NaCl	1,25 M
KCl	26 mM
CaCl 2	25 mM
MgCl 2	10 mM
glucose	100 mM
HEPES	100 mM

jove_content »> Tableau 2: Préparation de la solution de Ringer 10x poissons rouges.

3. Plateforme Électrorétinogramme

1. Réaliser des expériences ERG sur une table anti-vibration à l'intérieur d'une cage de Faraday pour améliorer le rapport signal sur bruit. Fixez une plate-forme en acier personnalisé à la table anti-vibrations en utilisant les écrous hexagonaux. Placez une plate-forme en plastique mobile avec un polymère d'uréthane amortisseur viscoélastique fond sur la table sous la source de lumière.
2. Placez la caméra avec un stand aimanté, visant vers le bas à la plate-forme en plastique mobile. Placez le micromanipulateur (qui tiendra la microélectrode d'enregistrement) avec une deuxième cage aimantée à la droite de la plate-forme en plastique mobile. Assurez-vous que la caméra et micromanipulateur ne seront pas perturbés par le mouvement des autres équipements et qu'ils ne bloquent pas l'éclairage de la source lumineuse.
3. Branchez l'appareil photo à un moniteur vidéo et le positionner pour voir l'œil de lalarve pour placer l'électrode dans la position correcte.
4. Assurez-vous que l'installation est correctement mise à la terre avec du fil de cuivre. Pour vérifier le bruit, placer l'électrode de référence et la pointe de la microélectrode d'enregistrement dans une boîte de Pétri 35 mm rempli de la solution de Ringer. Vérifiez les niveaux de bruit électrique de l'installation avec un oscilloscope ou d'une fonctionnalité intégrée de l'appareil ERG. Les niveaux de bruit ne devraient pas être plus de ± 10 mV par rapport au départ.

4. Préparation éponge

1. Coupez un petit rectangle d'éponge de PVA sec qui se ajuste bien dans un plat de 35 mm de Pétri. L'épaisseur de l'éponge ne doit pas être supérieure à la profondeur de la cuvette. Utilisez un couteau avec une lame de rasoir propre pour couper.
2. Faire une coupe supplémentaire dans l'éponge pour accueillir l'électrode de référence (soit une coupe peu profonde de la longueur sur le fond de l'éponge ou un papillon couper verticalement à travers l'une des extrémités plus petites).
3. Utilisez un marqueur résistant aux produits chimiquespour marquer un petit point sur l'éponge (où la larve sera placé) qui peut être utilisé pour positionner la caméra vidéo.
4. Tremper l'éponge PVA dans la solution de Ringer jusqu'à saturation. Retirer et éponger rapidement sur une serviette de papier 2-3 fois. Placez l'éponge dans un endroit propre 35 mm boîte de Petri.
5. Positionner la boîte de Pétri contenant de l'éponge sur la plate-forme de matière plastique de telle sorte que la marque peut être visualisée par la caméra.

5. Préparation de l'électrode

REMARQUE: L'installation se compose d'un poisson zèbre électrode de référence en contact avec une solution saturée de PVA éponge de Ringer et une électrode d'enregistrement en contact avec la cornée. L'électrode de référence est constituée d'une pastille Ag / AgCl. L'électrode d'enregistrement est une micro-pipette de verre tiré rempli de la solution de Ringer et détenus par un détenteur de microélectrodes contenant un fil Ag.

1. Chlorure électrodes en les trempant dans 9.6% d'hypochlorite de sodium (eau de Javel) pendant 5 minutes (le micr d'enregistrementoelectrode fils) ou 15 min (l'électrode de référence). Sécher à l'air sur une Kimwipe pendant 5 min.
   1. Selon le style de coupe faite à l'étape 4.2, placez le culot Ag / AgCl de l'électrode de référence dans (pour la coupe papillon vertical) ou moins (pour la coupe peu profonde de la longueur sur le fond) l'éponge. Attacher le fil d'électrode de référence au système d'enregistrement.
   2. Alternativement, si la configuration ERG a des contraintes d'espace ou il sont particulièrement fortes artefacts photovoltaïques de l'électrode Ag / AgCl, connectez l'électrode de référence à l'éponge par un pont de sel et d'agar pour déplacer l'électrode sur le chemin de lumière.
2. Fixez ~ 40 cm de tube de taille appropriée à une 5 ml non luer lock seringues. Remplir la seringue avec la solution de Ringer. titulaires de microélectrodes possédant ports de pression sont généralement livrés avec des adaptateurs pour accueillir des tubes avec des diamètres intérieurs de 1/16 ", 3/32", 1/8 "ou 5/32".
3. Remplissez un 1 ml non luer lock seringue avecLa solution de Ringer et, en utilisant un micro-fil, remplissez soigneusement le titulaire de microélectrodes. Éviter la formation de bulles.
4. Fixer la seringue de 5 ml à l'orifice de pression du support de microélectrodes avec des tubes et l'utiliser pour faire en sorte que le support de micro-électrodes est rempli de la solution de Ringer. Utilisation de la Micro-fil et de 1 ml seringue remplie de solution de Ringer, remplir le verre de micropipette de la pointe et de se assurer qu'aucune bulle sont présents.
5. Fixez la micropipette de verre pour le titulaire de microélectrodes, en faisant attention de garder la ligne droite de fil d'électrode. Une fois fixé, utilisez la seringue de 5 ml pour forcer attentivement la solution de Ringer à travers le micro-électrodes jusqu'à ce qu'une petite quantité de solution est visible sur la pointe. Occasionnelle de pression à la seringue (lorsqu'il ne est pas appliqué à la cornée) permettra d'éviter la formation de bulles d'air, ainsi que des occlusions dues à la poussière ou l'accumulation de sels, dans la pointe de la micropipette.
   1. Si la solution apparaît comme un flux, remplacer le gmicropipette lass, que l'ouverture de la pointe est trop grand ou est endommagée.
6. Placez délicatement la microélectrode d'enregistrement dans le micromanipulateur et fixer le fil au système d'enregistrement.

6. Analyse Électrorétinogramme

NOTE: En raison de la dominance de cône de la rétine larvaire, les résultats ERG de haute qualité peuvent être obtenus lorsque les préparatifs pour l'enregistrement sont effectuées sous de faibles niveaux de lumière blanche indirecte (<1 lux) ou avec de courtes périodes (<1 min) d'intensité supérieure ( ≤250 lux) lumière de travail. Une courte période d'adaptation sombre est toujours nécessaire avant l'enregistrement (voir l'étape 6.7). Cependant, les expériences peuvent être effectuées sous une lumière rouge ou infrarouge dim aide d'une caméra sensible à l'infrarouge. Toutes les expériences ont été réalisées dans (0,22 um) de l'eau du système de filtration stérilisé de la Facilité UNC poisson zèbre AquaCulture mais les médias d'embryons alternatives peuvent être utilisées.

1. Couper des carrés de serviettes en papier mesurant environ 1cm ^2.
2. Si la mesure de potentiel isolée du récepteur de la masse de cône, incuber 3-5 larves dans de l'eau du système avec 500 pM (±) -2-4-phosphonobutyrique-amino acides (APB) pendant 5 min.
   REMARQUE: Pendant APB est un mélange racémique de l'actif (L) et inactifs (R) formes de AP4, il est aussi efficace que la L-AP4 et est moins coûteux.
3. Anesthetize 3-5 larves dans de l'eau du système à 0,02% (p / v) jusqu'à ce que tricaïne répond pas, environ 1-2 min.
4. Utilisez une pipette et pipette Pasteur pompe pour transférer attentivement larves individuelle sur des carrés de serviettes en papier sous un stéréoscope dissection en utilisant un éclairage minimal (≤250 lux pour <1 min). Vérifiez la position de chaque larve et choisir un candidat qui est dorsale vers le haut avec un oeil non occlus.
   1. Pour les enregistrements étendus (> 30 min), garder la larve humide en vitrage le corps jusqu'à mais ne incluant pas la tête avec 3% de méthylcellulose l'aide d'un pinceau fin en poils de chameau.
5. En utilisant des pinces, transférer le squar de serviette en papiere avec la larve à l'éponge PVA humide.
   1. Pour les enregistrements étendus (> 30 min), appliquer un flux continu d'saturé d'eau 100% O ₂ gaz sur la larve par barbotage du gaz à travers un airstone dans un flacon bras latéral contenant de l'eau distillée. Placez le tuyau sortant du flacon bras latéral qui transporte l'oxygène humidifié près de la tête de la larve.
      REMARQUE: L'étape 6.4.1 et 6.5.1 seront pas prolonger la vie du poisson ^16.
6. Sous un éclairage minimal, utiliser le micromanipulateur et la caméra de positionner la pointe de microélectrodes au milieu entre le nez et extrémités caudales de l'œil et appuyez doucement sur la limite dorsale de la cornée.
   NOTE: Le mauvais positionnement de la pointe de l'électrode aux zones distales loin de la cornée peut entraîner des formes d'onde ERG de polarité inversée.
7. Laisser larve foncé adapter pendant 5-10 min.
8. Enregistrez le flash de test réponses à la lumière fournie par une source de lumière LED ou stimulateur optique utilisant le avaimatériel de stimulation et l'enregistrement étiquette. Réglez les paramètres de protocole tels que l'intensité du flash, flash longueur, la couleur flash, l'intensité de fond et couleur et les réglages de filtre pour se adapter à l'expérience.
9. Lorsque vous avez terminé avec l'expérience, euthanasier larves selon les directives de l'AVMA / IACUC.

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Résultats

Typiquement, ERG sont enregistrées à partir de larves de poisson zèbre à 5 dpf, depuis un certain nombre d'études ont publié des enregistrements ERG à ce stade ^{neuf, 16,20.} Réponses larvaires ont été mesurés dans des conditions adaptés à l'obscurité sans éclairage de fond en utilisant un stimulus 20 msec de lumière LED blanche. Nous avons utilisé un système ERG disponible dans le commerce constitué d'un stimulateur de lumière Ganzfeld et l'ordinateur contrôleur / enregistr...

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Discussion

Dans ce protocole, une procédure simple pour les enregistrements ERG de poisson zèbre larvaire est détaillé. Cette procédure permet une analyse rapide et complète de Visual function.There sont plusieurs étapes critiques tout au long de la procédure qui doit être gardé à l'esprit. Les larves de poisson zèbre doit être en bonne santé avant l'expérience pour éviter la mort au cours des traitements potentiels de la drogue et de se assurer des moyens de subsistance prolongée pendant les enregistremen...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard