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Résumé

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Résumé

Des modèles animaux expérimentaux de course sont des outils précieux pour la compréhension de la pathologie course et élaborer des stratégies de traitement plus efficaces. Un protocole 2 de semaine pour répétitif préconditionnement hypoxique (RHP) induit une protection à long terme contre les blessures du système nerveux central (SNC) dans un modèle de souris d'accident vasculaire cérébral ischémique focal. RHP se compose de 9 stochastiques exposition à l'hypoxie qui varient à la fois dans la durée (2 ou 4 heures) et l'intensité (8% et 11% de O 2). RHP réduit les volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) la perturbation, et la réponse inflammatoire post-AVC pendant des semaines après la dernière exposition à l'hypoxie, suggérant une induction à long terme d'un phénotype SNC-protection endogène. La méthodologie pour la quantification de double volume de l'infarctus et de rupture de la BHE est efficace dans l'évaluation de la protection neurovasculaire chez des souris avec RHP ou d'autres neuroprotecteurs putatifs. Souris mâles adultes Swiss Webster ont été préconditionnés par RHP ou expositions d'une durée équivalente à 21% O (c.-à-air de la pièce). A 60 min transitoire occlusion de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO) a été induite deux semaines après la dernière exposition hypoxique. Tant l'occlusion et la reperfusion ont été confirmées par Doppler transcrânien débitmétrie laser. Vingt-deux heures après la reperfusion, Bleu Evans (EB) a été administré par voie intraveineuse par une injection veine de la queue. 2 heures plus tard, les animaux ont été sacrifiés par sections de surdosage et le cerveau isoflurane ont été marqués par 2,3,5 chlorure de triphényltétrazolium (TTC). Volumes infarctus ont ensuite été quantifiés. Ensuite, EB a été extrait du tissu de plus de 48 heures pour déterminer rupture de la BHE après tMCAO. En résumé, RHP est un protocole simple qui peut être reproduit, avec un coût minimal, pour induire une protection neurovasculaire endogène à long terme des blessures de course chez les souris, avec le potentiel de translation pour d'autres états pathologiques pro-inflammatoires SNC-base et systémiques.

Introduction

Comme la première cause de handicap des adultes et la quatrième cause de décès, accident vasculaire cérébral est l'un des états pathologiques les plus débilitantes face à la population adulte des États-Unis. 1 Les modèles animaux d'AVC permettent pour une étude expérimentale de nouvelles méthodes de réduction de la lésion ischémique et améliorer la récupération post-AVC. Une nouvelle avenue pour une telle recherche translationnelle est préconditionnement. Préconditionnement est l'utilisation intentionnelle d'un stimulus non dommageable pour réduire les dommages causés par une suite, et plus grave, de blessure. 2 hypoxique préconditionnement a été montré pour produire des changements pléiotropiques dans le cerveau qui assurent une protection contre la course à la fois in vivo et des études in vitro . 3 Cependant, une seule exposition à l'hypoxie ne propose que la neuroprotection court terme, induisant moins de 72 heures de la tolérance contre l'ischémie chez la souris adulte. 4 Même après quatre semaines de 14 h expositions quotidiennes à l'hypoxie hypobare, Lin et al. found que neuroprotection n'a été maintenue pendant une semaine. 5 préconditionnement hypoxique répétitive (RHP) est caractérisée par des variations stochastiques fréquence, la durée et l'intensité des expositions hypoxiques. Contrairement à un défi de préconditionnement unique, RHP induit un phénotype cérébroprotecteur qui dure jusqu'à huit semaines chez la souris. 6 RHP réduit volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) perturbation, l'inflammation vasculaire, et la diapédèse des leucocytes pour semaines après l'exposition hypoxique finale . RHP spécifiquement réduit l'inflammation dans le cerveau ischémique en réduisant les lymphocytes T, les monocytes, et les populations de macrophages, tout en maintenant les populations de cellules B dans l'hémisphère ischémique. 7 En fait, RHP induit un phénotype immunosuppressive chez les souris avant toute lésion du SNC, y compris les accidents vasculaires cérébraux. Les cellules B-RHP isolées de souris traitées sain RHP traitées présentaient un phénotype anti-inflammatoire unique, avec une régulation à la baisse à la fois de la présentation d'antigène et la production d'anticorps. Leréduction globale des mécanismes immunitaires adaptatives pro-inflammatoires rend RHP une excellente méthode pour induire une immunodépression congénitale non seulement pour les maladies inflammatoires du système nerveux central spécifiques, mais également des modèles de blessures ou de maladies systémiques qui comprennent une pathologie pro-inflammatoire.

RHP réduit à la fois le volume de l'infarctus et rupture de la BHE après une occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO). Les modèles animaux d'AVC, comme l'couramment utilisés tMCAO, améliorer considérablement la compréhension de la physiopathologie de la course, ainsi que la conception de neurothérapeutiques plus efficaces. Première développé par Koizumi et al., En 1986, 8 la procédure tMCAO est une méthode largement utilisée d'induire AVC chez les rongeurs et l'une des méthodes privilégiées pour enquêter sur l'inflammation qui suit la reperfusion. Comme les méthodes de tMCAO évoluent, l'utilisation plus récente de filaments revêtus de silicone réduire davantage le risque d'hémorragie sous-arachnoïdienne par rapport aux autres <9,10/ Sup> et améliorer la fiabilité, mais malheureusement tMCAO produit souvent une grande variation du volume de l'infarctus. 11 à 13 La plupart de ces études délimiter des régions d'infarctus dans les sections coronales de cerveau par coloration avec du chlorure de 2,3,5- triphényltétrazolium (TTC), considéré comme un étalon-or pour l'infarctus quantification, car il est un moyen simple et peu coûteux à produire vives, les résultats reproductibles. TTC sert de substrat des déshydrogénases présents dans les mitochondries. Lorsque des tranches de cerveau sont exposés à la solution TTC, TTC est prise de manière sélective dans des cellules vivantes où son produit de réduction non-soluble, formazan, précipite à une couleur rouge foncé dans les mitochondries viables. En raison de la dysfonction mitochondriale dans le tissu ischémique, ce tissu reste blanche, permettant la différenciation des tissus endommagés et en bonne santé. 14

RHP réduit également BBB perturbation dans l'hémisphère ischémique. 6 Par conséquent, la double quantification de BBB intégrité au sein de la même bpluies que le volume de l'infarctus base-TTC déterminations de 15 fournirait des informations utiles sur la pleine efficacité de la protection endogène, et les relations de cause à effet possibles entre rupture de la BHE et d'infarctus chez les animaux traités et non traités. L'afflux de sang périphérique à travers un BBB perturbé, secondaire à un AVC, augmente les populations de leucocytes, les cytokines pro-inflammatoires, stress oxydatif, oedème vasogénique et transformation hémorragique dans l'hémisphère ischémique, finalement, l'augmentation des taux d'infection et de mortalité chez les patients ayant subi un AVC ischémique . 16,17 Un procédé courant de rupture de la BHE de mesure dans des modèles animaux se fait par la quantification de bleu d'Evans (EB) de fuite de colorant dans le cerveau. 15,18-21 EB se lie sélectivement à l'albumine sérique, une protéine globulaire (PM = 65 kDa) qui ne traverse pas la BHE chez les animaux non lésés. 22 Après un AVC ischémique, EB infiltre le cerveau, et émet une fluorescence à 620 nm, ce qui permet pour la mesure de la densité optique within le parenchyme blessés perfusé. 22 La densité optique est directement proportionnelle à la perméabilité de la BBB lorsque EB a été lavé de la vascularisation corticale post-mortem par perfusion transcardiaque. Avec la transformation immédiate des cerveaux TTC colorées chez l'animal avec l'administration EB, à la fois le volume de l'infarctus et rupture de la BHE peuvent être efficacement quantifiés. Il convient de noter, toutefois, que les lésions neuronales et rupture de la BHE sont pas des processus concomitants dans le cerveau post-AVC, 23,24 sorte que la sélection du temps de sacrifice est une considération importante.

Le protocole qui suit détaille la méthode RHP, la méthode tMCAO pour induire une occlusion artérielle temporaire qui modèles intermédiaires occlusions de l'artère cérébrale chez des patients humains, et les méthodes à double histologiques pour déterminer neuronaux et vasculaires extrémités des blessures de course. TTC mesure la mort cellulaire et des lésions tissulaires cumulative, ce qui permet la quantification d'un infarctus volume globalume, tandis EB fournit pour la quantification hémisphérique de dommages Bureau.

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Protocole

NOTE: Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'UT Southwestern Medical Center qui demeure par les Instituts nationaux de la santé politique (NIH) pour l'utilisation des animaux d'expérimentation.

1. répétitive hypoxique préconditionnement

  1. Conception sur mesure quatre débitmètres sur les régulateurs de gaz et fixez à la norme 15 L induction chambres avec des tubes en PVC pour permettre au gaz comprimé à partir de l'oxygène (O 2) réservoirs de circuler dans les chambres via un port d'entrée. Voir équipements et matériaux pour plus de détails sur la conception personnalisée.
  2. Diviser souris en 2 groupes: répétitive hypoxique préconditionnement (RHP) Groupe, qui reçoivent les expositions à 8% et 11% d'O 2 et le groupe de contrôle, qui reçoivent des expositions à 21% O 2 (air ambiant) simultanément. Voir le tableau 1 pour les variations de la fréquence, l'intensité (8 et 11% de O 2 ou O 2 21%) et la durée (2 ou 4 h) de l'exposition RHP.
  3. Retirer le couvercle de chaque cage du filtre haut et placer la cage, avec des bouteilles d'eau et de nourriture intacte, dans les chambres reliées à leurs réservoirs respectifs O 2. Fermer et verrouiller le couvercle de la chambre.
    1. Ouvrez le robinet de gaz principal pour les chars et régler le débit initial pour chaque chambre d'induction à 2 L par minute (LPM) pour les 5 premières minutes d'exposition. Réduire le débit à 1 LPM pour le reste de l'exposition.
    2. À la fin de l'exposition, de réduire le débit à 0 LPM et fermer le robinet de gaz pour les réservoirs.
    3. Ouvrez les couvercles des chambres et remplacer le couvercle supérieur du filtre sur chaque cage. Placez les cages dans le logement standard jusqu'à ce que l'exposition hypoxique prochaine.
  4. Vaporiser vers le bas chaque chambre d'induction avec NPD (Steris) ou un désinfectant équivalent / désodorisant après chaque utilisation.
  5. Expose à la fois 21% et souris RHP au même moment de la journée au cours de deux semaines, comme décrit dans le tableau 1.

2. transitoireCerebral Artery Occlusion Moyen (tMCAO)

  1. Voir discussion pour plus de détails sur le calendrier de la course suite à une exposition de RHP finale.
  2. Préparer un milieu de travail aseptique de la chirurgie. Lieu de travail environnant propre avec 70% d'éthanol ou un désinfectant équivalent et autoclave tous les outils chirurgicaux.
    1. Mettre en place l'instrument laser Doppler (LDF) pour mesurer les changements relatifs dans le flux sanguin cérébral (CBF). Allumez le coussin chauffant à 37 ° C. Allumez l'incubateur à 34 ° C.
  3. Anesthésier les souris par une brève exposition à un mélange de 4% d'isoflurane / 70% NO 2/30% de O 2 dans une petite chambre d'induction. Confirmez anesthésie appropriées en pinçant légèrement la patte. Si la souris retire sa patte, retourner la souris vers la chambre d'induction et de continuer l'exposition isoflurane.
  4. Retirer les souris de la chambre d'anesthésie d'induction et insérer rapidement le nez de la souris dans le cône de nez. Ouvrez le flux de gaz vers le cône de nez, fermant flux aux anessie chambre d'induction.
    1. Sans changer les 70% NO 2 O mélange de gaz 2/30 de%, isoflurane fixer à 1,8% que la dose d'entretien pour le reste de la procédure. La respiration doit rester lente et régulière tout au long de la procédure, mais si la respiration devient rapide et superficielle, augmenter la dose de l'isoflurane. La dose d'entretien peut varier entre la fabrication de l'équipement et des animaux utilisés dans l'expérience.
  5. Utilisation d'un microshaver, raser les cheveux sur la région temporale entre le coin de l'œil et l'oreille ainsi que la ligne médiane ventrale du cou. Enlever l'excès de fourrure et appliquer du lubrifiant oculaire avec un coton-tige stérile pour garder les cornées de se dessécher durant la procédure. Essuyer la zone d'incision avec des tampons d'alcool et écouvillon providone-iode avec un coton-tige stérile pour maintenir des conditions aseptiques.
  6. Administrer des analgésiques selon les directives chirurgicales rongeurs.
  7. Faire une incision à travers la peau temporel entre l'oeil et l'oreille.Exposer le muscle temporal. Utilisation de micro-ciseaux chirurgicaux, couper le ligament muscle temporal à la crête temporale dans la zone de blanc strié muscle.
    1. Poussez délicatement la masse musculaire latéralement avec une pince pour visualiser l'artère cérébrale moyenne (MCA) à travers le crâne. Après incision du muscle temporal, la zone peut se remplir de sang. Utiliser doucement un coton-tige pour endiguer toute hémorragie potentielle.
    2. Cibler la pointe de la sonde de LDF à la zone MCA. Enregistrez le navire choisi comme cette zone varie entre souris.
    3. Maintenez la LDF en place et rincer avec le crâne jusqu'à ce qu'un rouge flux de globules stable est lu et enregistrer cette valeur comme CBF de base. Idéal CBF base sur un laser Doppler sont> 600 flux, mais cela peut varier avec le fabricant. Si la ligne de base CBF est <400 flux, l'enregistrement de flux est le plus susceptible d'une veine à proximité, ou un placement incomplète de la sonde sur le vaisseau cible.
  8. Après base CBF est établie, repositisur la souris de sorte que le col est exposée. Soutenir sa tête et de garder la souris sous anesthésie constante de la coiffe.
  9. Faire une incision médiane ventrale juste en dessous de la mandibule à la clavicule.
    1. En utilisant des pinces, Blunt disséquer tous aponévrose superficielle pour exposer l'artère carotide commune gauche (CCA). Séparer CCA du tissu conjonctif et le nerf vague.
    2. Permanence ligaturer le CCA avec une suture de soie 6.0. Placer la suture proximale ligature comme possible de laisser suffisamment de place pour occlure placement du filament.
    3. Boucle et vaguement attachent une seconde soie 6.0 suture autour de la CCA distale à la suture d'occlusion. Veillez à ne pas obstruer l'artère comme le filament d'occlusion sera ensuite enfilé à travers la carotide.
    4. Utilisez une pince micro serrafine areterial 8 x 2 mm pour serrer la lumière distale CCA à la suture de soie vaguement lié. Soulevez doucement la CCA avec une pince et faire une petite incision longitudinale, comme à proximité de la suture de ligaturepossible avec 3 mm Vannas.
    5. Enfiler une jauge de 6,0 mm 12 d'occlusion filament de nylon revêtu de silicium à travers l'incision pour entrer dans la lumière de l'artère, puis avancer de quelques mm. Serrer légèrement la deuxième suture de soie lâche autour de la pointe du filament d'occlusion pour assurer l'écoulement de sang ne poussez pas le filament de la CCA et retirer la pince artérielle.
    6. A la première bifurcation de la CCA dans l'artère carotide interne (ACI) et l'artère carotide externe (CEA), enfiler le filament d'occlusion dans la branche droite de la première bifurcation à entrer dans le ICA.Advance le filament d'occlusion 9 à 10,5 mm passé le deuxième fil de suture de soie dans l'artère carotide interne gauche (ICA).
    7. Peu de temps après être entré dans l'ICA, avancer le filament d'occlusion dans la branche de gauche à la deuxième bifurcation entre l'ICA et l'artère pterogopalantine (PPA). Visualisation de la PPA est peu probable alors procéder jusqu'à ce que vous sentez une légère résistance en pleine placement du filament d'occlusion.La levée de l'ICA avec une pince peut aider le filament d'enfiler plus facilement dans la branche gauche de la deuxième birfurcation. Serrer la deuxième suture de soie.
    8. Tournez la souris pour l'incision sur le MCA est visible. Avec l'équipement de LDF, confirmer que la CBF est bloqué par des lectures de FDL. Une occlusion réussie est une réduction de CBF référence> 80%.
    9. Serrer complètement et double-noeud de la deuxième suture de soie autour du filament d'occlusion lorsque la position correcte est obtenue. Si nécessaire, pousser légèrement ou tirez sur le filament d'occlusion pour atteindre critères CBF pour une occlusion succès (par exemple une diminution du niveau de référence CBF> 80%).
    10. Fermez l'ouverture du cou et de la tête avec des sutures de nylon 6.0.
  10. La place les souris dans les 34 ° C incubateur pendant toute la durée de l'occlusion. La longueur recommandée de l'occlusion est de 60 min, mais cela varie de l'âge, les différences de souches dépendant de l'anatomie vasculaire cérébral, 25 et l'étendue de injury souhaité (léger, modéré, sévère). Assurez-vous que les animaux reprennent conscience dans les minutes à venir hors de l'anesthésie.
  11. Re-anesthésier les animaux avec de l'isoflurane, comme décrit dans l'étape 2.3, 5 min avant la fin de la période d'occlusion pré-défini, ouvrir l'incision du cuir chevelu et de confirmer que la perfusion MCA est toujours réduite en utilisant des lectures de FDL transcrânienne. Si CBF est pas suffisamment réduit (par exemple <20% de base CBF), le MCA a reperfusés à un certain moment au cours de l'occlusion et la souris devrait être exclu de toute expérimentation.
  12. Ouvrir l'incision du col de la ligne médiane et de façon lâche attacher un troisième fil de suture en soie autour de l'ACC, distale par rapport au deuxième fil de suture en soie mais en amont de la bifurcation CCA pour faire en sorte que l'artère carotide externe (CEA) reste viable après que le filament est retiré.
    1. Couper ou défaire le nœud qui détient le filament d'occlusion (ie, deuxième suture de soie) et retirer le filament d'occlusion lentement. Une fois retiré, fermer rapidement letroisième suture de soie autour de la CCA pour minimiser le reflux de sang de l'ICA. Double-noeud cette suture et fermer l'incision avec des sutures de nylon 6.0.
    2. Repositionner la souris pour quantifier le niveau de CBF après 5 min de reperfusion. Reperfusion réussie est généralement défini comme un CBF de> 50% du niveau de référence CBF, mais, comme avec les flux de l'occlusion, les enquêteurs peuvent établir leur propre critère. Si les animaux présentent une CBF en dessous de 50% de leur niveau de référence, il est probable que le MCA est 'définitivement' occlus, et représente donc un autre critère d'exclusion de l'étude.
    3. Fermez les deux incisions avec des sutures de nylon 6.0. Fournir une solution saline, un anesthésique (lidocaïne), et des antibiotiques selon les directives de rongeurs. Toutefois, certaines petites doses d'antibiotiques (3 mg / kg de minocycline) ont été trouvés à être neuroprotecteur course suivante. 26
  13. Après avoir repris conscience dans l'incubateur chauffé suivant la chirurgie, placez la souris dans une cage propre et stérile. Fournir foo humidifiéd ou nutritionnels hydratation des suppléments alimentaires de gel et une boîte de Pétri d'eau que les animaux auront une mobilité restreinte suite à un AVC. Surveiller de près les animaux lors de la récupération de la douleur et de la mort post-chirurgicale excessive.

3. Bleu Evans (EB) Injection

  1. Injecter EB 22 heures après la reperfusion et devrait circuler dans la circulation sanguine pendant 2 heures avant le sacrifice et la coloration TTC.
  2. Faire une solution pour injection EB (EB 2% dans une solution saline) et mélanger délicatement à la température ambiante. solution de filtre à travers un papier filtre ou pousser à travers un filtre de 0,2 um attaché à une petite seringue pour enlever non dissous EB et stocker à température ambiante.
  3. Préparer la quantité d'EB nécessaire pour injection (4 ml / kg de poids corporel) Dessinez la quantité désirée de colorant dans une seringue à insuline 0,3 cc avec une aiguille de calibre 29 et veiller à ce que la solution est à la température ambiante
    1. Retenez souris à l'aide de contention fond plat. Tenez la queue de sorte que la nervure latérale est uppla plus éloignée. Nervures latérales sont situées de chaque côté de l'axe de la queue. Maintenez la pointe de la queue de garder la souris stable pour injection.
    2. Insérez l'aiguille dans la veine d'environ 3,5 mm, en faisant attention de ne pas perforer la veine. Assurez-vous que l'aiguille est dans la veine en tirant sur la seringue et la recherche de traces de sang.
    3. Injecter la totalité de la teinture au cours de 1 min. Si la solution va dans la veine il devrait y avoir une résistance minimale que la pression est appliquée à la seringue. Confirmez succès administration veineuse systémique de EB par un changement de couleur immédiate dans la queue, des membres et des yeux de la souris.
    4. Retirez l'aiguille de la queue et appliquer doucement pression en utilisant de la gaze propre afin d'arrêter le saignement.
  4. Commencer à chronométrer quand la peau de la souris devient bleu. Permettre à l'EB de circuler pendant 2 heures pour pénétrer la BHE affaibli.

4. 2,3,5 triphényltétrazolium Chloride (TTC) Coloration

  1. Perfusion et TTC coloration devraient produire 24 heures après la reperfusion.
  2. Préparer une solution de 2% TTC avant l'heure prévue du sacrifice. Ajouter 10 g de poudre pour 500 ml TTC 0,01 M de tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4. Chauffer la solution à 37 ° C dans un bain d'eau pour faciliter la solubilisation du TTC. ATTENTION: poudre TTC et la solution sont une peau, du poumon, et irritant pour les yeux. Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de ces matériaux.
    1. Une fois que la poudre est complètement dissoute, transférer immédiatement à une bouteille, couvercle en feuille, et conserver à 4 ° C. TTC et le tissu taché de TTC sont sensibles à la lumière.
  3. À 24 h après tMCAO et 2 heures après l'administration EB, sacrifier l'animal avec une overdose d'isoflurane dans une petite chambre d'induction. Perfusion doit commencer immédiatement après sacricice afin de minimiser l'autolyse qui commence en l'absence d'oxygène après la mort.
  4. Sécuriser rapidement l'animalsur une plate-forme de styromousse avec les avant-bras épinglés par les pattes. Couper une incision latérale à travers la paroi abdominale de la ligne médiane juste en dessous de la cage thoracique. Découpez soigneusement à travers le diaphragme pour exposer le coeur.
    1. Démarrer la pompe de perfusion à 5 ml / débit min avec une seringue de 60 cc remplis avec de la glace à 0,01 M de PBS froid et raccordé à une aiguille d'injection à ailettes 27 de la jauge. Placez la pointe de l'aiguille d'environ 0,5 cm dans le ventricule gauche du coeur et couper l'oreillette droite. Progressivement sang veineux diluée doit couler de l'oreillette pendant la perfusion jusqu'à ce que le sang veineux apparaît incolore. Transcardiaque perfuser 30 ml 0,01 M tampon phosphate salin (PBS) à travers le cœur.
  5. Ajouter 5 ml de solution TTC transparentes dans 20 flacons de scintillation.
  6. Immédiatement après la perfusion, décapiter les animaux et disséquer les cerveaux à l'aide de petits ciseaux et une spatule si nécessaire. Examiner les cerveaux d'exclure les animaux qui ont subi hemorrha méningéege au Cercle de Willis, secondaire à un placement de suture. Vérifiez que l'hémisphère controlatéral à la MCA occlusion apparaît pâle, sans fuite EB notable ou un oedème.
  7. Verser PBS dans une matrice de cerveau acrylique conçu pour rendre 1,0 mm d'épaisseur des coupes coronales d'un cerveau de souris. Placez le cerveau, côté dorsal haut, dans la matrice et verser immédiatement PBS sur le cerveau. Gardez le cerveau humide.
    1. Retirer les bulbes olfactifs par insertion d'une lame d'épaisseur 0,21 mm en acier inoxydable dans la deuxième fente depuis le côté rostral de la matrice.
    2. Retirer le cervelet par insertion d'une lame dans la quatrième fente du côté caudal de la matrice.
    3. Insérez une lame dans la fente du milieu des créneaux restants dans la matrice. Insérez les lames restantes, uniformément coupant le tissu restant pour assurer le plus, même la distribution des tissus pendant le tranchage.
    4. Une fois que toutes les lames ont été insérés, ajouter 1 à 2 gouttes de PBS dans le cerveau pour l'humidifier.
    5. Retirez la lames une à la fois de la matrice en commençant par la région rostrale. Gardez les 7 premières tranches pour l'analyse TTC après tMCAO. Utiliser une spatule pour transférer soigneusement les tranches de la lame dans le flacon TTC-rempli.
  8. Après toutes les sections sont dans le flacon, et couronner le placer dans un bain d'eau chaude jusqu'à ce que les sections deviennent roses. Tournez doucement la bouteille dans le bain si nécessaire pour éviter la section de chevauchement, ce qui pourrait conduire à une coloration inégale. Ensuite, disposer de la TTC et versez une solution de paraformaldéhyde à 4% dans le flacon pour couvrir des coupes de cerveau de mettre fin à la réaction chimique TTC.
  9. Organiser immédiatement les sections sur un 1 "x 3" lame de verre propre et orienter les sections de rostrale à caudale.
    1. Lorsque les sections sont disposées sur la diapositive, numériser la diapositive en utilisant un scanner standard. Définissez la résolution dans un minimum de 600 dpi pour l'analyse d'image. Veillez à inclure le nom de l'animal et une règle métrique dans l'image numérisée.
    2. Retournez sur la lameet de numériser l'arrière pour assurer que toutes les données sont collectées.

5. volume de l'infarctus Quantification

  1. Quantifier le volume de l'infarctus en utilisant un logiciel d'analyse d'image standard (par exemple, ImageJ).
  2. Numérisation des images à haute résolution (par exemple 600 dpi) pour une analyse adéquate. Recadrage d'images. Uniformiser l'échelle pour toutes les images à l'aide de la règle métrique inclus dans l'image numérisée.
  3. Calculez le volume total de l'hémisphère controlatéral utilisant la formule suivante. Répétez cette formule pour calculer le volume total de l'hémisphère ipsilatéral.
    Somme de l'hémisphère controlatéral total de chaque épaisseur x tranche de tranche
  4. Calculer le volume de l'infarctus indirecte. . Contrôle d'œdème ipsilatéral de course en utilisant le, hémisphère controlatéral comme contrôle 27 Utilisez la formule suivante pour calculer le volume de l'infarctus indirecte:
    Le volume total de l'hémisphère controlatéral -
    (Volum totale de l'hémisphère ipsilatéral -Moyenne volume de 3 mesures de l'infarctus)

6. barrière hémato-encéphalique (BHE) Intégrité Quantification

  1. Pour se préparer à EB quantification, d'abord peser 2,5 pouces pèse bateaux. Noter le poids et étiqueter deux bateaux peser pour chaque animal: l'un pour l'hémisphère ipsilatéral et un pour l'hémisphère controlatéral.
  2. Après avoir numérisé les sections TTC colorées, bissecter chaque section avec une lame de rasoir jetable en hémisphères ipsilatéraux et controlatéraux. Placez les hémisphères ipsilatérales de tous les 7 sections dans un bateau peser et enregistrer le poids. Répétez l'opération pour l'hémisphère controlatéral.
  3. Transférer immédiatement les bateaux de poids à un ensemble four à 56 ° C pendant 48 heures.
  4. Peser les sections sèches. Transférer les deux hémisphères dans 1,5 ml microtubes séparés.
    1. Calculer la quantité de formamide nécessaire pour chaque hémisphère (8 ml / g de tissu sec), et ajouter à leur microcentrifug respectivetubes électroniques. Le formamide est sensible à la lumière et couvrent tous les échantillons de formamide traité en feuilles partir de ce point.
    2. Transférer les microtubes à un incubateur réglé à 56 ° C pour un autre 48 heures.
  5. Après 48 h, la pipette le surnageant bleu dans un autre ensemble de microtubes étiquetés. Pousser tissu au fond du tube pour maximiser le volume de surnageant extrait. Gardez les tubes de surnageant et de disposer de tous les tissus.
  6. Préparer les dilutions exponentielles de EB dans le formamide pour la courbe standard. Inclure une vierges (formamide uniquement) puis 10 solutions exponentielles de 0,125 ug / ml par 64 ug / ml de EB dans le formamide.
    1. Pipeter 300 ul de dilutions effectuées pour la courbe d'étalonnage dans une plaque à 96 puits. Pipeter 300 ul du surnageant dans les puits correspondants.
    2. Mesurer l'absorbance au spectrophotomètre à 620 nm.
    3. Comparer la courbe standard des dilutions EB avec l'absorbance of les échantillons de surnageant. La densité optique est directement proportionnelle à l'intégrité de la BHE.
    4. Supposons que la densité optique de l'hémisphère controlatéral comme arrière-plan et utiliser la formule (ipsilatéral-controlatéral) / controlatéral pour déterminer facteur de changement. Pour plus de détails sur l'analyse statistique voir Martin et al., 2010. 18

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Résultats

Cette étude a inclus 25 souris mâles Swiss-Webster qui étaient 10 semaines d'âge au début de la randomisation dans RHP (n = 10) ou 21% 2 (n = 15) des groupes O. Deux semaines après l'exposition finale RHP, les procédures chirurgicales ont été réalisées, avec des groupes et aveuglés contrebalancés entre les jours. Après tMCAO, 1 souris est morte lors de la récupération post-opératoire et une souris a été exclu de l'étude parce qu'il ne respectait pas le critère de reperfusi...

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Discussion

Une seule exposition à l'hypoxie systémique (soit 2 h de 11% O 2) chez la souris protège "transitoire" le cerveau de tMCAO, 29 signifie la réponse épigénétique à la hypoxique défi préconditionnement est de courte durée, et le phénotype de base est rétablie dans jours. Présentations répétitives de la relance préconditionnement hypoxique étendent considérablement la durée du phénotype neuroprotecteur. 6 De nombreuses études ont montré que la fr...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Flowmeters, regulatorsVetEquip, IncSpecialty orderFour flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
21% O2 tankAirGasOX USP200
11% O2 tankAirGasSpecialty order
8% O2 tank AirGasSpecialty order
15 L induction chambersVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HP0.8 mm diameter probe 
High Intensity Illuminator NikonNI-150
Zoom Stereo Microscope NIkonSMZ800Other surgical microscopes may be used. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDiscontinuedRecommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-EOur model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
V010 Anesthesia system VetEquip901807Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
250 ml isoflurane Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer Andis #23905Replacement blades are available from Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsMultiple sellers Catalog number not available 
Gauze PadsFisher Scientific67622
Surgical drapeFisher ScientificGM300 
Silk Sutures Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Nylon SuturesLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 forceps (2) Fine Science Tools 11251-35Angled 45°
Surgical ScissorsFine Science Tools 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Straight blade
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Occluding filamentsWashington UniversitySpecialty orderFilaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
Filter Paper Sigma AldritchWHA1001150150 mm, circles, Grade 1 
Weigh BoatsFisher Scientific02-202-1012.5" diameter
0.9% Sodium Chloride Injection USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needleBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrainer Braintree Scientific FB M2.0" diameter
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
Water BathMultiple sellers Catalog number not available Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
Styrofoam boardMultiple sellers Catalog number not available 
Large Syringe KitPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Perfusion PumpPumpSystems IncNE-300 
60 cc syringeFisher ScientificNC9203256
27 gauge winged infusion setKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 ml scintillation vialFisher Scientific50-367-126
Stainless steel spatulaFisher Scientific14-373-25A
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronalCellPoint Scientific Catalog number not available 
0.21 mm stainless steel blades, 25 pkCellPoint Scientific Catalog number not available Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
4% paraformaldehydeSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Superfrost microscope slides Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Multiple sellers Catalog number not available Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
ImageJ National Institute of HealthCatalog number not available 
Analytical BalanceMettler Toledo XSE 205U
Precision Compact Oven  Thermo Scientific PR305225M
1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamideFisher ScientificBP228-100
96-well platesFisher Scientific07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Catalog number not available 

Références

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