L'utilisation de la haute résolution thermographie infrarouge (HRIT) pour l'étude de la glace et de la glace nucléation Propagation dans les plantes

Résumé

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Résumé

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

Introduction

Températures qui se produisent lorsque les plantes sont en pleine croissance de congélation peut être mortelle, surtout si la plante a peu ou pas de tolérance au gel. De tels événements gel ont souvent des effets dévastateurs sur la production agricole et peuvent également jouer un rôle important dans la structure des communautés dans les populations naturelles de plantes, en particulier dans les régions alpines, les écosystèmes subarctiques et arctiques ^1-6. Les épisodes de sévères gelées de printemps ont eu des répercussions importantes sur la production de fruits dans les États-Unis et Amérique du Sud au cours des dernières années ^7-9 et ont été aggravés par l'apparition précoce du temps chaud suivi par basses températures moyennes les plus typiques. Le temps chaud début induit bourgeons de rompre, l'activation de la croissance de nouvelles pousses, feuilles, fleurs et tous qui ont très peu ou pas de gel tolérance ^1,3,10-12. Ces aléas météorologiques ont été signalés à être un reflet direct du changement climatique en cours et devraient être un motif de météo commun pour les fores¹³ eeable avenir. Les efforts visant à fournir des techniques ou des produits agrochimiques gestion économiques, efficaces et respectueuses de l'environnement qui peuvent fournir une tolérance accrue au gel ont eu un succès limité pour une foule de raisons, mais cela peut être attribué en partie à la nature complexe de la tolérance au gel et le gel des mécanismes d'évitement dans les plantes. ¹⁴

Les mécanismes adaptatifs associés à la survie du gel dans les plantes ont toujours été divisés en deux catégories, la tolérance au gel et le gel évitement. La première catégorie est associée à des mécanismes biochimiques réglementés par un ensemble spécifique de gènes qui permettent aux plantes de tolérer les contraintes associées à la présence et l'effet déshydratant de glace dans ses tissus. Alors que la dernière catégorie est généralement, mais pas uniquement, associé à des aspects structurels d'une plante qui déterminent si, quand et où les formes de glace dans une usine ^14. Malgré la prévalence de l'évitement gel comme une annoncemécanisme aptive, peu de recherches ont été consacrés ces derniers temps pour comprendre les mécanismes sous-jacents et de la réglementation de l'évitement gel. Le lecteur est renvoyé à un examen récent ¹⁵ pour plus de détails sur ce sujet.

Alors que la formation de glace à basses températures peut sembler comme un processus simple, de nombreux facteurs contribuent à déterminer la température à laquelle la glace nucléation dans les tissus végétaux et comment il se propage dans la plante. Des paramètres tels que la présence de extrinsèque et intrinsèque de nucléation de la glace, contre les événements de nucléation hétérogènes homogènes, thermique-hystérésis (antigel) protéines, la présence de sucres spécifiques et d'autres osmolytes, et une foule d'aspects structurels de la plante peuvent tous jouer un important rôle dans le processus de congélation dans les plantes. Collectivement, ces paramètres influencent la température à laquelle une plante gèle, où la glace est initiée et comment elle se développe. Ils peuvent également affecter la morphologie des cristaux de glace qui en résultent.Diverses méthodes ont été utilisées pour étudier le procédé de congélation dans les plantes en conditions de laboratoire, y compris la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ^16, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ^17, cryo-microscopie ^{18 à 19,} et la microscopie électronique à balayage à basse température (LTSEM ). ²⁰ congélation de plantes entières dans les paramètres de laboratoire et de terrain, cependant, a été principalement contrôlé avec thermocouples. L'utilisation de thermocouples pour étudier le gel est basé sur la libération de chaleur (enthalpie de fusion) lorsque l'eau subit une transition de phase à partir d'un liquide à un solide. La congélation est alors comptabilisé comme un événement exothermique. ^21-23 Même si thermocouples sont la méthode typique de choix dans l'étude de congélation dans les plantes, leur utilisation a de nombreuses limites qui limitent la quantité de renseignements obtenus lors d'un événement de congélation. Par exemple, avec des thermocouples il est difficile de presque impossible de déterminer où la glace est engagée dans les plantes, la façon dont il se propage,si elle se propage à un rythme encore, et si certains tissus restent libres de glace.

Les progrès de la thermographie infrarouge à haute résolution (HRIT) ^24-27, cependant, ont augmenté de façon significative la capacité d'obtenir des informations sur le processus de congélation dans les plantes entières, surtout lorsqu'il est utilisé dans un mode d'imagerie différentielle. ^28-33 Dans le présent rapport, nous décrire l'utilisation de cette technologie pour étudier divers aspects du processus de congélation et de différents paramètres qui influent sur le lieu et la glace et à quelle température est initiée dans les plantes. Un protocole sera présenté qui permettront de démontrer la capacité de la bactérie glace nucléation-actif (INA), Pseudomonas syringae (Cit-7) pour agir comme un agent de nucléation extrinsèque initier le gel dans une plante herbacée à une température en dessous de zéro élevé.

Caméra infrarouge haute résolution

Le protocole et des exemples documentés dans ce rapport utilisent un infrarouge à haute résolutionvidéo radiomètre. Le radiomètre (figure 1) fournit une combinaison des images infrarouge et visible du spectre et des données de température. La réponse spectrale de la caméra est dans la plage de 7,5 à 13,5 um et fournit 640 x 480 pixels de résolution. Images de spectre visible générés par le haut-appareil photo peut être fusionnée avec l'IR-images en temps réel, ce qui facilite l'interprétation des images thermiques complexes. Une gamme de lentilles de la caméra peut être utilisée pour faire des gros plans et des observations microscopiques. L'appareil peut être utilisé dans un mode autonome ou en interface et contrôlée avec un ordinateur portable utilisant le logiciel propietary. Le logiciel peut être utilisé pour obtenir une variété de données thermiques intégrés dans les vidéos enregistrées. Il est important de noter qu'une grande variété de radiomètres infrarouges sont disponibles dans le commerce. Par conséquent, il est essentiel que le chercheur de discuter de leur application prévue avec un ingénieur de produit compétent et que le chercheur de tester la capacité de tout spécific radiomètre de fournir les informations nécessaires. Le radiomètre d'imagerie utilisée dans le protocole décrit est placé dans une boîte en acrylique (Figure 2) isolé avec polystyrène i n afin de dissuader l'exposition à la condensation pendant les protocoles de réchauffement et de refroidissement. Cette protection est pas nécessaire pour tous les appareils photo ou les applications.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Préparation des matières végétales

1. Utilisez feuilles ou plantes entières de matériel objet de la plante (Hosta spp. Phaseolus vulgaris) ou.

2. Préparation des solutions d'eau contenant de la glace nucléation actifs (INA) Bactéries

1. Culture de la bactérie INA, Pseudomonas syringae (Strain Cit-7) dans des boîtes de Pétri à 25 ° C sur Pseudomonas Agar F préparé avec 10 g / L de 100% de glycérol par la direction du fabricant.
2. Après cultures ont augmenté suffisamment, lieu à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire, mais garder à 4 ° C pendant deux jours avant d'assurer un niveau élevé d'activité de nucléation de la glace.
3. Racler bactéries à partir d'une seule plaque à partir de la surface de la gélose avec une matière plastique, jetable ou réutilisable spatule métallique au moment de l'emploi et dans 10 à 15 ml d'eau désionisée dans une cuvette jetable de 25 ml. La concentration doit être de l'ordre de 1 x 10 ⁷ à 1 x 10 ^{9 ·} Ml ^-1. La solution apparaît trouble. Il n'y a pas besoin de confirmer que la concentration en utilisant un hémocytomètre ou spectrophotomètre, en tant que concentration ne doit pas être approximatives.
4. Vortexer la cuve pendant un minimum de 10 secondes pour répartir les bactéries.
   Remarque: La concentration spécifique du mélange résultant INA est pas important et le protocole décrit fournira plus de un niveau adéquat de l'activité de nucléation de la glace. Ce mélange de bactéries INA et de l'eau sera utilisé plus tard dans les expériences de nucléation.

3. Mise en place une expérience de congélation

1. Placez la caméra infrarouge à haute résolution (SC-660) à l'intérieur de la boîte de protection en acrylique de sorte que les projets de lentille à travers l'ouverture à l'avant de la boîte et les fils de connexion de l'appareil photo à une sortie ordinateur portable ou dispositif d'enregistrement à travers l'ouverture arrière de la boîte . Fixez le couvercle de la boîte et placer la boîte à l'intérieur de la chambre de l'environnement ou au congélateur dans un endroit qui seront tousow la matière objet de l'usine pour être vu.
   1. Fournir un fond sombre autour de la matière végétale en alignant les parois de la chambre avec du papier de construction noir pour éviter les interférences de l'énergie infrarouge réfléchie.
   2. Monter la chambre avec un éclairage LED pour minimiser le chauffage de la source de lumière lorsque l'enregistrement d'images dans des longueurs d'onde visibles est nécessaire. Seul un minimum de l'éclairage, comme un placard ou un autre dispositif de lumière petite LED fonctionnant sur batterie, est nécessaire pour que les plantes soient visibles par la caméra.
      1. Une fois les images visibles de la matière objet de la plante sont prises, éteignez l'éclairage LED. Distribuer toutes les connexions externes filaires (connexion firewire à l'ordinateur, cordon d'alimentation, etc.) à l'appareil photo via un port ou une autre ouverture dans la chambre.
   3. Remplissez tout espace supplémentaire dans le port ou l'ouverture avec un matériau de mousse isolante pour éviter ou réduire les gradients de température dans la chambre. Réglez la température initiale de la chambre à 1 ° C.
2. Aligner les plantes ou parties de plantes de sorte que la matière végétale est au champ de vision de la caméra, et le matériel végétal est visible sur l'écran de visualisation à distance ou dans le logiciel choisie.
3. Permettre aux plantes à équilibrer à 1 ° C pendant 30 min à 1 h, en fonction de la taille de la matière végétale, avant de commencer une expérience de congélation contrôlée. Cela garantit que la température de l'usine ne sera pas à la traîne température de l'air par de nombreux degrés une fois l'expérience surgélation. L'équilibrage est réalisé lorsque la température de la matière végétale est à l'intérieur de 0,5 ° C de la température de l'air.
   1. Placez une couche d'isolation en polystyrène au-dessus du sol de plantes en pot si les plantes en pot sont utilisés. Une fois que les plantes ont équilibrée, commencera de refroidissement de la chambre.
      Remarque: La couche d'isolant sur la surface du sol du pot réduit la quantité de la perte continue de la marmite à l'air autour de l'usine de chaleur, et empêche les racines de freezing, car cela ne se produira pas habituellement lors d'un épisode de gel dans la nature en raison de l'énorme réservoir de chaleur résiduelle présente dans le sol.
4. Définissez les paramètres de la caméra souhaités (palette de couleurs, la gamme de température, domaines d'intérêt spécifiques, etc.), comme indiqué dans 3.4.1-3.4.4.
   1. Sélectionnez la palette d'arc en ciel pour afficher les variations de température tout en regardant l'image en direct.
   2. Régler la plage de température de 5 ° C par ajustement de la barre de température située juste en dessous de l'image dans le logiciel.
   3. Choisissez l'échelle linéaire (algorithme) pour convertir les données infrarouges dans l'image en fausses couleurs tel que défini par la palette sélectionnée (arc) et définir la plage de la température à 5 ° C et de suivre automatiquement en fonction de l'image. Alternativement, régler la plage de jeu manuellement tout en menant l'expérience.
      1. Utilisez la température d'un point spécifique ou une température moyenne dans la zone définie d'intérêt prévu par le softwsont. Récupérer les données de température de tous les pixels de la séquence vidéo enregistrée ou de l'information contenue dans le fichier image. La figure 3 montre une capture d'écran typique à partir du logiciel ResearchIR.
   4. Placez un curseur sur un emplacement sur le tissu végétal qui représente un point d'intérêt particulier. Définir la zone d'intérêt comme points (1 -3 pixels en taille), des boîtes, des lignes, des ellipses, ou des cercles. De multiples combinaisons de points ou de formes peuvent être situés sur l'image.
5. Enregistrement d'une séquence vidéo
   1. Réglez l'appareil photo pour enregistrer à 60 Hz et pour l'enregistrement d'être arrêté manuellement.
   2. Indiquez l'emplacement sur l'ordinateur ou disque dur externe où le fichier vidéo enregistré sera placé.
   3. Commencer l'enregistrement.
      Remarque: L'enregistrement sur un disque dur externe est fortement recommandée car de gros fichiers vidéo seront générés. Fichiers vidéo enregistrés peuvent être édités plus tard pour ne contenir que la partie contenant le necinformations néces-. Cela contribuera grandement à réduire la taille du fichier.
   4. Baissez la température de la chambre de manière incrémentielle de 0,5 -1.0 ° C. Attendez jusqu'à ce que la température de la plante équilibre avec la température de l'air et puis baisser à nouveau la température de 0,5-1,0 ° C. En fonction de la masse du tissu de la plante est observé et sa morphologie, l'équilibrage peut prendre 10 à 15 min. Ainsi, en donnant une vitesse de refroidissement d'environ 4 ° C / h.
   5. Continuer ainsi jusqu'à ce que la plante se fige et observations sont complétées. Terminez l'enregistrement lorsque le processus de congélation a été achevée.
      Remarque: le tissu végétal est équilibrée avec la température de l'air lorsque la matière végétale et de fond ont la même couleur, car ils sont à la même température. Etant donné que la température de fond et la température du tissu de la plante sont les mêmes, il peut être difficile de visualiser le matériel végétal à nouveau jusqu'à ce que plus la température et il ya différence de température entre le tissu de la plante et unetempérature ir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Activité Ice-nucléation de la glace + bactérie, Pseudomonas syringae (souche Cit-7)

Une goutte de 10 ul d'eau et 10 ul d'eau contenant P. syringae (Cit-7) ont été placés sur la surface abaxiale d'une feuille de Hosta (Hosta spp.) (Figure 4). Comme illustré, la goutte d'eau contenant des bactéries INA gelé premier et était responsable de l'induction de la feuille de geler tandis que la goutte d'eau sur la surface de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L'eau a la capacité de surfusion à des températures bien inférieures à 0 ° C et la température à laquelle l'eau va geler peut être très variable. ³⁶ La limite de température pour la surfusion de l'eau pure est d'environ -40 ° C et est défini comme le point de nucléation homogène. Quand l'eau gèle à des températures plus chaudes que -40 ° C, il est provoquée par la présence de hétérogène de nucléation qui permettent de petits embryons de glace pour former qui serven...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1