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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires (VE), de petites particules libérées par des cellules membranaires, d'aussi peu que 10 échantillons de sérum ul. Cette approche évite la nécessité d'ultracentrifugation, ne nécessite que quelques minutes de temps de dosage, et permet l'isolement des véhicules électriques à partir d'échantillons de volumes limités.

Résumé

Vésicules extracellulaires (VE), membraneuses particules libérées par divers types de cellules, détiennent un grand potentiel pour des applications cliniques. Ils contiennent cargaison d'acide nucléique et des protéines et sont de plus en plus reconnus comme un moyen de communication intercellulaire utilisé à la fois par eucaryote et les cellules procaryotes. Toutefois, en raison de leur petite taille, les protocoles actuels pour l'isolement des véhicules électriques sont souvent beaucoup de temps, lourde, et nécessitent de grands volumes d'échantillons et des équipements coûteux, comme une ultracentrifugation. Pour répondre à ces limitations, nous avons développé une plate-forme d'immunoaffinité à base de papier pour séparer les sous-groupes de véhicules électriques qui est facile, efficace et nécessite des volumes d'échantillon aussi faibles que 10 pi. Les échantillons biologiques peuvent être introduits à la pipette directement sur les zones de test de papier qui ont été chimiquement modifiés avec des molécules de capture ayant une affinité élevée à des marqueurs spécifiques de la surface d'exposition. Immunosorben lié à une enzyme, à base de papier Nous valider l'essai en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB)t essais (P-ELISA), et l'analyse du transcriptome. Ces dispositifs à base de papier permettront l'étude des véhicules électriques dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions EV en matière de santé et de la maladie.

Introduction

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

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Protocole

Un schéma général de la procédure d'opération est fourni à la figure 1. Utilisation de pratiques éthiques, nous avons recueilli des échantillons de sang de sujets sains, et obtenu des échantillons de l'humeur aqueuse de patients à travers le Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sous CISR protocoles approuvé ( CISR TCVGH n ° CF11213-1).

1. fabrication de dispositifs papier

  1. Couper le papier de Chromatographie en cercles de 5 mm de diamètre pour fournir la même disposition que une plaque de microtitrage à 96 puits. Sandwich ces morceaux de papier avec deux feuilles de polystyrène ayant son siège trous traversants, et stratifié.
  2. Modifier dispositifs de papier en utilisant le procédé de conjugaison chimique décrite dans ce qui suit les étapes 28.
    1. Traiter les dispositifs de papier avec un plasma d'oxygène (100 mW, 1% d'oxygène, 30 sec) dans une chambre à plasma.
      ATTENTION: Une attention particulière doit être prise lorsque vous travaillez avec 3-mercaptopropyltriméthoxysilane et-maléimidobutyryloxy de succinimide Nester (GMBS), car ils sont à la fois sensibles à l'humidité et toxique. Porter des gants de protection et éviter l'inhalation ou contact avec la peau et les yeux. Gardez le stock flacon hermétiquement fermé et le laisser se stabiliser à la température ambiante avant d'ouvrir pour éviter la condensation de l'eau. Vous pouvez également ouvrir la bouteille de l'intérieur d'un sac ou une boîte gants remplie d'azote. Aliquote en petits flacons pour éviter l'ouverture fréquente du stock bouteille.
    2. Immédiatement incubat traitée dispositifs de papier dans une (v / v) à 4% de 3-mercaptopropyltriméthoxysilane dans de l'éthanol (200 proof) pendant 30 min.
    3. Rincer les dispositifs de papier avec de l'éthanol et de les incuber avec 0,01 umol / ml dans de l'éthanol GMBS pendant 15 min.
    4. Rincer avec de l'éthanol (200 proof) et incuber dispositifs de papier avec 10 ug / ml d'avidine en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 1 heure à 4 ° C. Conserver à 4 ° C si nécessaire, et d'utiliser dans les 4 semaines.
  3. Mouiller chacune des zones de test de papier avec 10 ul de PBS contenant 1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) Pour 3 x 10 min avant de repérer 10 ul biotinylé molécules de capture pour 3 x 10 min. Utiliser anticorps anti-CD63 (20 ug / ml dans du PBS contenant 1% (p / v) de BSA et 0,09% (p / v) d'azoture de sodium) ou l'annexine V (01:20, v / v dans du tampon de liaison d'annexine V) comme molécules de capture.
  4. Rincer molécules d'anticorps ou l'annexine V anti-CD63 non liés en utilisant 10 ul correspondant PBS contenant 1% (p / v) de BSA ou de l'annexine V solutions de tampon de liaison pour 1 × 3 min, respectivement.

2. sérum et humeur aqueuse Prélèvement et traitement

  1. Collecte le sérum.
    1. Recueillir 10 ml de sang périphérique par ponction veineuse dans des tubes de séparation du sérum et inverser doucement le tube cinq fois. Réglez le tube en position verticale et attendre 30 min.
    2. Centrifuger à 1200 xg pendant 15 min. Transférer le sérum à partir de la couche supérieure dans un tube propre, et centrifuger à nouveau à 3000 g pendant 30 min.
    3. Passez le surnageant à travers un fil de 0,8 umter. Conserver l'échantillon à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  2. La collecte de l'humeur aqueuse: recueillir des échantillons d'humeur aqueuse de patients diagnostiqués par un ophtalmologiste directement par des procédures et des échantillons de magasins invasive à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Isolement de vésicules extracellulaires

  1. Échantillons ponctuels sur chaque zone de test de papier à un taux de 5 pi / min.
  2. Rincer VE non liées avec 10 pi correspondant PBS contenant 1% (p / v) de BSA ou de l'annexine V solutions de tampon de liaison pour 1 × 3 min pour les dispositifs de papier fonctionnalisées avec des anticorps anti-CD63 ou l'annexine V molécules, respectivement. Effectuez les tests suivants en aval.

4. Essai Exemple 1 en aval: Electromicrographs d'analyse

  1. Fix VE capturées sur la zone de test de papier fonctionnalisé en utilisant 10 ul 0,5 × fixateur de Karnovsky pendant 10 min.
  2. Rincer les échantillons avec une vaste PBS pendant 2 × 5 min.
  3. Déshydrater leles échantillons à la suite de l'éthanol à 35% pendant 10 min, éthanol à 50% pendant 2 x 10 min, de l'éthanol à 70% pendant 2 x 10 min, éthanol à 95% pendant 2 x 10 min et 100% d'éthanol pendant 4 x 10 min.
  4. Critical sec et pulvérisation enrober les échantillons avec du palladium / or, et d'examiner l'aide d'un microscope électronique à balayage fonctionnant à basse tension d'accélération des électrons (~ 5 kV).

5. aval Assay Exemple 2: ELISA à la version papier

  1. Ajouter une solution à 5 pi contenant l'anticorps primaire anti-CD9 à 1: 1000 dilution dans du PBS à chaque zone de test contenant VE capturées. Attendre 1 min.
  2. Rincer les échantillons avec 30 ml de PBS agité à 100 rpm pendant 30 s.
  3. Ajouter 5 ul solution contenant la peroxydase de raifort (HRP) lié en anticorps secondaire au 1: 1000 dilution dans du PBS et attendre 1 min.
  4. Rincer les échantillons avec 30 ml de PBS agité à 100 rpm pendant 30 s.
  5. Ajouter un substrat colorimétrique 5 ul contenant 1: 1 en volume d'un peroxyde d'hydrogèned 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et numériser à l'aide d'un scanner de bureau.

Exemple 6. En aval de test 3: Isolement de l'ARN

  1. Plonger les échantillons dans 35 ul d'aide d'isolement d'ARN à base de polyvinylpyrrolidone et 265 pl de lyse / tampon de liaison pour lyser les véhicules électriques capturées. Vortex vigoureusement.
  2. Ajouter 30 ul d'homogénat fourni dans le kit d'isolation au lysat. Vortex vigoureusement et mis sur la glace pendant 10 min.
  3. Extraire l'ARN en utilisant une séparation de l'acide phénol-chloroforme décrit dans les étapes suivantes.
    1. Prendre 330 ul de phénol-chloroforme à partir de la couche inférieure de la bouteille et ajouter à l'homogénat / lysat. Vortex vigoureusement.
    2. Centrifuger à 10 000 g pendant 5 min. Transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un tube propre et noter le volume enlevé.
  4. Précipiter l'ARN total avec 100% d'éthanol du volume qui est de 1,25 fois le volume de la phase aqueuse éliminée à l'étape précédente et collect l'ARN dans la solution d'élution préchauffé à 95 ° C.
  5. Concentrer et purifier davantage l'ARN en utilisant un kit de nettoyage de l'ARN selon le protocole du fabricant.

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Résultats

La capacité du dispositif de papier pour isoler les sous-groupes de VE se appuie de manière efficace sur la reconnaissance sensible et spécifique de marqueurs de surface EV. La modification stable de fibres de papier avec des molécules de capture est obtenue en utilisant la chimie de l'avidine-biotine tel que décrit ailleurs 28-30. L'efficacité de la conjugaison chimique et celle de la méthode de physisorption est évalué en utilisant les lectures basées sur la fluorescence. Les zones de test...

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Discussion

Les étapes les plus critiques pour l'isolement réussi de sous-groupes de vésicules extracellulaires sont: 1) un bon choix de papier; 2) une couverture stable et élevé de molécules de capture sur la surface des fibres de papier; 3) la manipulation correcte des échantillons; et 4) la pratique de l'hygiène générale de laboratoire.

Les matériaux poreux ont été utilisés dans de nombreux tests peu coûteux et sans équipement. Ils peuvent avoir une taille de pores accordable,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Ce travail a été financé en partie par NSC 99-2320-B-007-005-MY2 du Conseil national des sciences de Taiwan (CC) et NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) et le Veterans General Hôpitaux et University System of Programme conjoint de recherche de Taiwan (CC).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Références

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