Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Résumé

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Résumé

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Introduction

Essais cellulaires fournissent un outil important pour le développement et la découverte de nouveaux médicaments anti-cancer. ^1,2 Historiquement, cultures monocouches de cellules cancéreuses ont été utilisées pour étudier l'efficacité de composés candidats contre certains types de cellules cancéreuses. La facilité d'entretien des cultures monocouches dans des plaques de culture standard, la compatibilité des plaques standard avec des outils robotiques commerciaux pour l'ajout de réactifs, et avec un équipement de dépistage pour l'analyse en aval de réponses cellulaires à des composés chimiques sont les principaux avantages qui rendent les cultures 2D un outil intéressant pour le dépistage des drogues. ³ Malheureusement, les dosages cellulaires monocouche omettent souvent de prédire l'efficacité des composés in vivo, ce qui rend le développement de médicaments et la découverte d'un processus extrêmement coûteux. ^4,5 Malgré des investissements considérables et des efforts par les compagnies pharmaceutiques et les unités académiques, seulement ~ 1% des médicaments anticancéreux dans les essais cliniques ont été approuvéspar la FDA au cours des deux dernières décennies. ⁶ disparité entre les cultures 2D et l'environnement 3D complexe de cellules cancéreuses in vivo est une lacune majeure des systèmes de culture en monocouche. ⁷ conséquent, le dépistage de composés candidats contre les cellules tumorales dans un cadre qui ressemble plus étroitement l'environnement tumoral 3D peut accélérer le développement de nouveaux médicaments de chimiothérapie. ⁸

sphéroïdes de cellules cancéreuses présentent un modèle de tumeur 3D pertinent in vitro. ^9,10 sphéroïdes sont des amas compacts qui forment par assemblage spontanée ou induite des cellules cancéreuses sur des surfaces non adhérentes ou en suspension en utilisant des techniques telles que la fiole centrifuge, revêtement liquide, micro- microfabriqué . et tableaux, la microfluidique, et des gouttes suspendues ^11-16 Sphéroïdes imitent principales caractéristiques de tumeurs solides, y compris la géométrie et le transport limité d'oxygène, des nutriments et composés de médicaments dans la zone centrale; par conséquent, ils se régénèrent plus étroitement drogues responsoi de tumeurs solides par rapport aux cultures en monocouche. ^17-19 Malgré cet avantage marqué, sphéroïdes sont pas couramment utilisés pour le criblage de composés chimiques contre les cellules cancéreuses. Difficulté de produire des sphéroïdes de taille uniforme dans un cadre à haut débit standard qui est compatible avec la robotique disponibles dans le commerce et les outils de dépistage / d'imagerie empêche l'incorporation de la culture sphéroïde en pipeline de développement de médicaments. Bien que les matériaux et les plaques personnalisées sont récemment devenus disponibles dans le commerce pour répondre à ce besoin, les considérations de coût dissuader leur utilisation généralisée.

Deux principales techniques avec la capacité de produire sphéroïdes taille cohérentes dans haut débit utiliser une nouvelle plate-forme de goutte suspendue et les micro-puits microfabriqués. ^13,16,20 Cependant, les deux approches nécessitent plaques et dispositifs qui sont coûteux à fabriquer et peu pratique pour les utilisateurs finaux spéciales dans les centres de recherche de base et les industries pharmaceutiques où le plus grand efforts pour la découverte de nouveaux médicaments anticancéreux sont faites. En dépit des améliorations dans la stabilité des gouttes contenant des cellules avec une conception récente d'accrochage des plaques de chute, que tous les deux trous de la plaque est encore utilisé pendant la culture pour éviter la propagation / fusion des gouttes. ¹⁶ Cela diminue considérablement le débit expérimentale. plus de drogues et le renouvellement est difficile avec manuel ou pipetage robotique et sphéroïdes doivent être transférés dans une plaque standard pour l'analyse biochimique car cette configuration de la plaque ne est pas facilement compatible avec les équipements de dépistage classique tel que des lecteurs de plaques. ²¹ micro-puits fabriqués en utilisant la lithographie douce aussi permettre taille contrôlée production sphéroïde. ^13,20 Toutefois, l'incompatibilité de cette plate-forme avec des outils standards de pipetage empêche le traitement de sphéroïdes individuels avec différents composés médicamenteux / concentrations, ce qui expose toutes les sphéroïdes à une condition de traitement unique. Ainsi, cette méthode ne est pas appropriée pour une grandecriblage de composés débit qui nécessite des tests simultanée de plusieurs composés / concentrations.

Pour surmonter ces obstacles, une nouvelle technique pour la production à haut débit de taille constante sphéroïdes de cellules cancéreuses dans des plaques à 96 puits standard a été développé. ^22,23 L'approche est basée sur un système aqueux à deux phases polymère (ATPS) avec du polyéthylène glycol ( PEG) et le dextrane (Dex) que des polymères de formation de phases. ²⁴ ATPSs ont été récemment utilisés dans une variété d'applications biologiques roman cellulaires pour permettre micromodelage cellulaire et localisée livraison de réactifs biologiques à des cellules dans des milieux fortement aqueux. ^25-32 Pour former une sphéroïde, les cellules cancéreuses sont mélangés avec la phase aqueuse et de DEX une baisse sous-microlitre de la suspension résultante est introduit à la pipette dans une solution aqueuse de PEG phase de l'immersion de puits contenant. La chute reste non miscible à partir de la phase d'immersion et confine les cellules pour faciliter la formation d'un sphéroïde. Lutinortantly, la phase d'immersion hautement aqueuse fournit des nutriments aux cellules de la sphéroïde et minimise le problème bien connu de l'évaporation de support commun à d'autres dosages qui provoque des changements dans l'osmolalité de médias et de fluctuations de concentrations de médicament. Cette technique permet la production sphéroïde et un traitement médicamenteux seulement en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce et les outils de pipetage dans des plaques à 96 puits standard. Fait important, l'analyse des réponses cellulaires des sphéroïdes est réalisée de la même plaque en utilisant des essais biochimiques standards et lecteurs de plaques. La facilité de travailler avec l'ATPS et l'adaptabilité de l'approche de la manipulation de liquides robotique rend génération à haut débit à la fois mono-culture et de co-culture Sphéroïdes une technique de laboratoire simple. Cette nouvelle approche sera un grand pas en avant vers l'intégration de sphéroïdes de cellules cancéreuses dans les processus de développement de médicaments et de découverte avec un débit amélioré de test et de rapport coût-efficacité (nombre de composés testés et Redu croissanteced consommation de réactifs) et l'efficacité (réduction de temps sur les mains).

Un protocole détaillé pour la production de sphéroïdes robotique de cellules cancéreuses dans des plaques à 96 puits en utilisant l'approche décrite ci-dessous est ATPS. En outre, les détails de traitement de la toxicomanie de sphéroïdes et l'analyse en aval de réponses cellulaires en utilisant un dosage biochimique commerciale résultantes sont présentées.

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Protocole

1. Préparation du polymère aqueuse système à deux phases (ATPS)

1. Peser 0,5 g de polyethylene glycol (PEG) (poids moléculaire: 35 000) et l'ajouter à 9,5 ml de milieu de croissance complet dans une conique de 15 ml stérile pour préparer 10 ml de 5% (p / v) de PEG phase aqueuse.
   Remarque: l'ajout de la moitié de la moyenne de la première conique suivie par l'addition du polymère et ensuite la quantité restante de médium minimise l'adhérence du polymère aux parois coniques et permet le polymère se dissout rapidement.
2. Peser 0,128 g de dextrane (DEX) (PM: 500 000) et l'ajouter à 0,872 ml de milieu de croissance complet dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml stérile pour préparer 1 ml de 12,8% (p / v) de la phase aqueuse de DEX.
3. Vortex deux solutions pendant environ 1 min pour dissoudre les polymères dans le milieu.
4. Garder les deux solutions dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 heure pour assurer la dissolution et des mélanges homogènes. Garder les bouchons au-dessus du niveau d'eau afin d'éviter toute possibilité de contamination des solutions de baineau.
5. Charger la solution à phase PEG dans une seringue en matière plastique stérile et le faire passer à travers un filtre à seringue de 0,2 um de taille de pores pour éliminer les impuretés.
   Remarque: Remplir la seringue avec la solution de PEG, le placer dans l'insert du filtre sur le dessus d'un tube conique et en utilisant la force, pousser lentement la solution à travers le filtre. Il est normal de ressentir une résistance contre le mouvement du piston de la seringue. Perte mineure de la solution de polymère a lieu en tant que partie de la solution reste dans le filtre, mais la concentration en polymère ne changera pas.
6. Introduire à la pipette 10 ul de la solution en phase DEX et diluer dans 10 ul de milieu dans un tube séparé pour conduire à 6,4% (p / v) d'une solution de phase de DEX. Aspirer 100 ul de la solution à phase PEG et le distribuer dans une boîte de Pétri.
   1. Distribuer 0,5 ul de la 6,4% (p / v) de solution en phase DEX dans la solution à phase PEG. Confirmer visuellement la formation réussie ATPS en observant une baisse de DEX sous un microscope. La limite de chutedevrait rester visible, indiquant la présence de deux phases aqueuses séparées, stables.
7. Stocker le stock aqueuse PEG et des solutions de phase de DEX dans le 4 ° C jusqu'à utilisation.
   Remarque: Il est recommandé que les solutions polymères sont fraîchement préparés avant chaque expérience et utilisés dans les 24 heures de stockage.

2. Préparation pour l'impression de cancer Sphéroïdes cellulaires

1. Cultiver les cellules cancéreuses d'intérêt (par exemple, les cellules MDA-MB-157 cancer du sein) à un 90% à 100% de confluence monocouche. Pour MDA-MB-157 cellules, en utilisant un milieu constitué de DMEM contenant 10% de FBS, 1% de glutamine et 1% d'antibiotique.
   1. Récolte des cellules en utilisant un tampon de dissociation cellulaire (selon le protocole du fabricant) et charger la suspension dans une 15 ml conique. Centrifuger pendant 5 min à 173,3 XG, retirez surnageant et remettre les cellules dans 1 ml de milieu de croissance complet.
2. cellules de charge sur un hémocytomètre et compter pour calculer le nombre requisdes cellules pour une densité souhaitée sphéroïde cellulaire. Une monocouche confluente de cellules MDA-MB-157 cellules cultivées dans un flacon T75 donne habituellement ~ 7 x 10 ⁶ cellules.
   Remarque:. Densité de cellules requises pour un volume de goutte afin de générer un seul sphéroïde dépendra du type de cellule ^22, par exemple, une densité de 1,5 x 10 ⁴ ou plus pour MDA-MB-157 cellules est recommandé par 0,3 ul phase de DEX goutte à assurer la formation d'un seul sphéroïde.
3. Centrifuger les cellules pendant une seconde fois pendant 5 min à 173,3 xg et les remettre en suspension dans un volume approprié de milieu de croissance pour concentrer la suspension à une densité cellulaire souhaitée.
   Remarque: Si, par exemple 7 x 10 ⁶ cellules cancéreuses ont été récoltées, le volume total de suspension de cellules requis pour former un sphéroïde densité de 1,5 x 10 ⁴ cellules dans une phase de baisse DEX 0,3 pi 140 pi sera. Cependant, en raison de la dilution avec la solution de phase de DEX à l'étape suivante, ne utiliser que 70 ul de milieu de culture cellulaire pour remettre en suspension les cellules.
4. Ajouter à la suspension de cellules résultante un volume égal de 12,8% (p / v) de solution en phase aqueuse DEX préparé en 1.2. Pour l'exemple de 1,5 x 10 ⁴ cellules sphéroïde densité, 70 ul de la solution de phase DEX est ajouté à 70 ul de suspension cellulaire.
5. Bien mélanger la suspension de cellules pour assurer une distribution uniforme de cellules et mélange de la solution DEX. Pipetage de haut en bas doivent être effectuées doucement pour éviter la formation de bulles.

3. Préparation pour l'impression des Sphéroïdes Co-culture

1. Cultiver les cellules cancéreuses (par exemple, MDA-MB-157 cellules de cancer du sein humain) et des cellules de soutien (par exemple, des fibroblastes humains) à 90% -100% de confluence monocouche. Récolter chaque type cellulaire en utilisant un tampon de dissociation cellulaire (selon le protocole du fabricant).
   1. Charger chaque suspension dans 15 ml d'une conique, les centrifuger pendant 5 min à 173,3 xg, et aspirer le surnageant de chaque conique. Resuspendre les cellules de chaque conique dans 1 ml de g completroissance moyenne.
      Remarque: Les colorants fluorescents tels que la calcéine AM (Teinture de cellules vivantes) et colorants nucléaires (Hoechst) peuvent être utilisés pour distinguer les deux types de cellules.
2. Charger chaque type de cellule séparément sur un hémocytomètre et les compter pour calculer le nombre requis de chaque type de cellule pour un rapport désiré de cellules cancéreuses à des cellules de soutien dans sphéroïdes co-cultivées. Des monocouches confluentes de cellules MDA-MB-157 et les cellules de fibroblastes cultivés dans des flacons T75 donnent généralement ~ 7 x 10 ~ ⁶ et 6 x 10 ⁶ cellules, respectivement.
3. Ajouter le volume approprié de la suspension de cellules de soutien pour les cellules cancéreuses suspension pour obtenir un rapport désiré entre le nombre de deux types de cellules. Par exemple, utiliser un ratio de 50 cellules cancéreuses à une cellule de fibroblastes.
4. Centrifugeuse de la conique contenant la suspension de cellules mélangé pendant 5 min à 173,3 cellules XG et remettre en suspension dans un volume approprié au résultat de la densité finale comprenant des volumes égaux de milieu de croissance et 12,8% (p / v) DEX aqueusesolution de phase (préparé en 1.2).
5. Pipette doucement la suspension de cellules résultant de haut en bas pour assurer l'homogénéité de la suspension.

4. Impression de Sphéroïdes tumorales dans une plaque de 96 puits

1. Un jour avant les expériences, manteaux, plaques non traitées à fond rond de 96 puits avec 1% (p / v) Pluronic à 37 ° C pendant 24 heures. Ce revêtement empêche la fixation des cellules sur la période de culture.
2. Distribuer 50 pi de la filtrée 5% (p / v) la phase aqueuse PEG dans chaque puits d'une plaque de 96 puits (plaque de destination).
3. En utilisant une pipette, mélanger la suspension de cellules (préparé dans l'étape 2 ou 3 pour la mono- et la co-culture, respectivement) et ajouter 20 ul de la suspension à chaque autre et d'une colonne d'une plaque à 384 puits (plaque de source) .
4. Allumez le manipulateur de liquides et de la «maison» la tête de pipetage pour enregistrer les coordonnées. Puis compilez un protocole défini précédemment (ci-dessous en 4.6) pour assurer le matériel de laboratoire et les paramètres sont définis correcteLy. Cette étape "homing" peut être différente pour différents manipulateurs de liquide.
   Note: Le flux du protocole, montre étape par étape ci-dessous dans 4,6, sera semblable quel que soit le manipulateur de liquides robotique utilisé; Toutefois, l'interface de programmation peut être différent en raison de l'utilisation de différents logiciels.
5. Placer la plaque de source, la plaque de destination, et des boîtes de pointes de pipettes à des positions définies sur le poste de travail du manipulateur de liquide comme représenté sur la Figure 1.
6. Exécuter le protocole qui comprend les étapes suivantes:
   1. Charger une colonne de barils de la tête de pipetage du manipulateur de liquide avec le mélange des embouts de pipette (8) Conseils du poste de travail (Figure 1).
   2. Mélanger la suspension de cellules dans des puits de la plaque de source (figure 1). Sélectionnez un volume de mélange inférieur au volume de suspension de cellules dans des puits pour éviter la formation de bulles.
   3. Ejecter conseils dans un des conseils de déchets case vide (Figure 1).
   4. Charger une colonne de barils de la tête de pipetage avec 10 pi de distribution des embouts de pipette (Figure 1).
   5. Aspirer 0,3 ul de la suspension de cellules à partir de la plaque de source (figure 1) dans chaque embout de pipette.
   6. Verser la suspension de cellules dans des puits d'une colonne de la plaque de destination (figure 1). Utiliser une hauteur de distribution de 0,5 mm et un débit de distribution de dimension inférieure à 1 pi / s.
   7. Répéter les étapes 4.6.1 4.6.6 à travers jusqu'à ce que l'impression colonne par colonne dans la plaque de destination ne est pas terminée.
7. Retirez délicatement la plaque de destination à partir de la surface du poste de travail et le placer dans un incubateur humide à 37 ° C et 5% de CO _2. Maintenir la plaque horizontale lorsque vous le transportez dans l'incubateur pour éviter de perturber de gouttes de phase DEX contenant des cellules.
8. Incuber la plaque pendant 24 heures pour permettre l'agrégation de cellules dans un sphéroïde à l'intérieur de la phase de chute de DEX.

5. Traitement de la toxicomanie de Sphéroïdes de Cancer Cell

Notez que le protocole suivant est pour un traitement de la toxicomanie de 4 jours et comprend un renouvellement à la drogue douce après jour 2. Il peut être modifié pour d'autres périodes de traitement.

1. Confirmer visuellement la formation sphéroïde dans des plaques à 96 puits après 24 h. Si nécessaire, image puits pour la mesure de la taille de sphéroïdes faisant la moyenne des diamètres plus petits et les plus grands de chaque sphéroïde.
2. Préparer la solution mère d'un médicament souhaité par dissolution dans un solvant recommandé par le fabricant à une concentration de solubilité prédéterminée. Par exemple, le cisplatine dissoudre dans l'eau à 2 mg / ml.
   Remarque: Protéger la solution mère de la drogue de la lumière si le médicament est sensible à la lumière.
3. En utilisant la technique de dilution en série, les concentrations de médicament préparer diluées avec du milieu de culture de cellules à partir de la solution mère préparée dans l'étape précédente. Chaque dilution devrait être deux fois la concentration désirée. Dilratios de ution varient en fonction de la concentration de matière de départ souhaitée et la concentration de travail.
4. Ajouter 50 ul de solution de médicament préparé à l'étape précédente dans chaque puits. Ceci peut être effectué par robot ou par pipetage manuel.
   Remarque: chaque concentration de médicament sera diluée de moitié à la concentration désirée par la phase aqueuse 50 pi de PEG déjà dans chaque puits.
   1. Utilisation des sphéroïdes de deux colonnes d'une plaque à 96 puits (n = 16) pour chaque concentration.
   2. Dans les puits témoins, ajouter à 50 pl de milieu de culture frais pour les 50 ul existantes de la phase aqueuse de PEG.
5. Incuber sphéroïdes avec le médicament pendant 48 heures à 37 ° C et 5% _de CO2, à l'abri de la lumière.
6. Après 48 h d'incubation, préparer des dilutions fraîches du médicament à des concentrations désirées et renouveler médicament par addition de 50 ul d'une solution fraîche de médicament à chaque puits.
   Remarque: Les puits contiennent déjà la concentration de médicament souhaité à partir du premier médicament traitement. Par conséquent, dans cette phase de renouvellement, chaque concentration est préparée à la concentration désirée puisque aucune dilution se produira.
7. Incuber sphéroïdes avec un autre médicament pour 48 heures à 37 ° C et 5% _de CO2, à l'abri de la lumière.

6. Analyse de viabilité cellulaire dans Sphéroïdes

1. Après 48 h d'incubation avec le médicament renouvelé (temps total de traitement de sphéroïdes avec un médicament est de 4 jours), mesurer le volume total de milieu dans un puits par pipetage manuel.
   Remarque: le volume typique dans un puits est d'environ 140 pi (une petite diminution est due à l'évaporation).
2. Calculer le volume de réactif de la viabilité des cellules (par exemple, PrestoBlue) en tant que concentration du volume total du puits est 10%. Ajouter ce volume de réactif de la viabilité des cellules dans chaque puits.
   Remarque: Avec un volume de médias existants de 140 ul dans un puits, un volume de 15,6 pi est nécessaire pour obtenir une concentration du total de 10% ainsi. Il est calculé endivisant le volume de médias existants par neuf (140 pl / 9 = 15,6 pi).
3. Incuber la plaque avec le réactif de viabilité cellulaire à chaque puits pendant 6 heures à 37 ° C, à l'abri de la lumière.
4. Placer la plaque dans un lecteur micro-plaque et lire le signal de fluorescence à 560 nm et 590 nm excitation et d'émission des longueurs d'onde, respectivement.
5. Calculer la viabilité des cellules pour cent en sphéroïdes en normalisant le signal fluorescent provenant de puits traités à celle des puits de contrôle après la moyenne des valeurs des mêmes conditions de traitement.

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Résultats

Le poste de travail du manipulateur robotisé liquide est représenté sur la Figure 1. La tête de pipetage et toutes les stations d'impression utilisés dans la robotique de sphéroïdes à l'article 4.6 sont marqués. L'image montre l'utilisation de deux stations différentes pour les boîtes de pointe (une série de conseils pour le mélange et le deuxième ensemble pour aspirer / distribution du mélange en phase DEX suspension aqueuse cellulaire). L'ensemble du montage est log?...

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Discussion

Sphéroïdes présentent un modèle réaliste de mieux comprendre la physiologie de la tumeur et l'efficacité des médicaments et de fournir un outil utile pour anticancéreux découverte de médicaments. Ces applications bénéficieraient grandement de techniques simples de génération de sphéroïde et d'entretien qui ne nécessitent que du matériel de laboratoire standard, des outils de manipulation de liquides et de criblage. L'utilisation d'un système à deux phases aqueuse cellules cancéreuses...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, MW: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Nunc	268200
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M