Transfecter des cellules RAW264.7 avec un gène rapporteur de la luciférase

Résumé

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Résumé

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Introduction

La transfection d'acides nucléiques dans des cellules a une application variée dans la recherche scientifique. Des exemples comprennent (1) des gènes rapporteurs pour étudier le rôle des éléments de différents gènes dans l'expression génique, (2) les plasmides d'expression de protéine de surexpriment la protéine d'intérêt, et (3) de petit ARN interférent régulent à la baisse l'expression du gène. En manipulant le niveau de certains gènes d'expression et de mesurer l'effet différentiel de ces manipulations, les chercheurs peuvent déduire les fonctions des gènes dans les systèmes biologiques choisis. Toutes les méthodes de transfection fournissent les mêmes efficacités de transfection, et même le même procédé de transfection ne transfecter pas tous les types cellulaires également ^une. Par conséquent, différents procédés de transfection ont été développés tel que le procédé au phosphate de calcium, DEAE-dextrane, transfection lipide cationique, la transfection de polymère non-lipide cationique, une électroporation, et nucléofection ^2,3.

Transfection dans les macrophages est ESPEciellement difficile en raison du fait que les macrophages sont des phagocytes professionnels qui sont très sensibles à des matières étrangères, y compris les bactéries dérivées (méthyle) ⁴ ADN. L'introduction d'ADN étranger active la voie Toll-like récepteurs 9 (TLR9) conduisant à la production de cytokines et de ^5,6 d'oxyde nitrique. Ces macrophages activés peuvent alors être moins sensibles au traitement que les chercheurs entendent examiner.

Notre laboratoire transfecte régulièrement la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 avec des gènes rapporteurs luciférase, et nous avons développé un protocole qui est suffisamment robuste pour activer le signal luciférase significativement plus élevé que de fond, mais aussi assez doux pour les macrophages de rester à leur état de repos. Les comportements des cellules transfectées ont été évaluées par un gène rapporteur de luciférase de luciole-porteuse de la région de promoteur de IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expression est régulée positivement par le composant lèvre de la paroi cellulaire bactérienneopolyssacharide (LPS) ^7,8, et régulée à la baisse par la cytokine anti-inflammatoire, l'interleukine-10 (IL-10) ^8. Pour tenir compte de la variation entre les puits transfection, nous avons co-transfecter un plasmide témoin contenant le gène de la luciférase de Renilla (par exemple, phRL-TK) à des fins de normalisation. Le protocole décrit est optimisée après l'essai de divers paramètres, y compris le moment de la transfection, le type de réactifs de transfection, des quantités de réactifs de transfection et de l'ADN de plasmide, ainsi que le rapport de réactif de transfection de l'ADN plasmidique. Les deux réactifs de transfection inclus dans ce protocole sont (1) un réactif de transfection à base de lipides et (2) une protéine / réactif de transfection à base de polyamine.

Protocole

1. L'ADN de plasmide Purification

1. Extraire l'ADN plasmidique en utilisant un kit de maxiprep selon le protocole du fabricant. Remettre en suspension l'ADN de plasmide dans 500 ul de tampon TE.
2. Effectuer un phénol: chloroforme: extraction de l'alcool isoamylique et précipitation à l'isopropanol pour éliminer les contaminants bactériens résiduels. La présence de LPS interfère avec la transfection ^9.
   1. Ajouter 500 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1, pH 8) à l'ADN plasmidique et agiter vigoureusement pendant 15 sec. Phénol provoque de graves brûlures de la peau et est un anesthésique afin brûlures ne sont pas toujours senti jusqu'à ce qu'il y est des dommages graves. Effectuer extraction au phénol: isoamyle dans la hotte et faire preuve de prudence: chloroforme.
3. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer 350 ul de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml de collection.
4. Ajouter 350 pi de tampon TE au tube contenant la phase organique inférieure. Agiter vigoureusement pendant 15 sec. Centrifuger à 13 000 g pendant 5 min à température ambiante. Transférer 350 pl de la phase aqueuse supérieure à 1,5 ml du même tube de collecte.
5. Ajouter 70 ul d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et bien mélanger. Ajouter 700 pi d'isopropanol à 100%. Mélangez bien et incuber 10 min à température ambiante. Centrifugeuse à 13.000 g pendant 10 minat 4 ° C. Retirer le surnageant.
6. Ajouter 500 ul d'éthanol à 75% au culot. échantillons de Vortex pour mélanger et centrifuger à 5000 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. ADN se trouve dans le culot.
7. Ouvrez le bouchon du tube et sécher à l'air le culot à température ambiante pendant 5 à 10 min. Le culot doit devenir translucide. Ajouter 500 ul de tampon TE pour remettre en suspension le culot d'ADN. On chauffe à 50 - 60 ° C pendant 10 minutes pour dissoudre le culot d'ADN.
8. Mesurer l'absorbance à 260 nm (A260) et 280 nm (A280) avec un spectromètre. Calculer la concentration de l'ADN en multipliant la valeur de A260 par 50 ng / ul. Évaluer la qualité de l'ADN par calculating le rapport A260 / A280. L'ADN de haute qualité devrait donner un rapport A260 / A280 de 1,8 à 2,0.

2. La culture cellulaire et l'ensemencement

1. les cellules RAW264.7 de culture dans du DMEM supplémenté avec 9% de sérum de veau foetal (milieu DMEM / 9% de FCS) dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Au cours de chaque passage, détacher les cellules de la plaque par pipetage continu à l'aide d'une pipette Pasteur. Passage des cellules tous les 2 jours, et ensemencer 1,5 à 2.000.000 cellules sur un plat traité de culture de tissu de 10 cm que le stock. Décongeler un nouveau stock de cellules tous les 5 - 6 semaines.
2. Le jour de la transfection, ensemencer 200 000 cellules par puits dans une plaque à 24 puits dans un volume de 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incuber les cellules pendant 4 heures dans le 37 ° C incubateur.
3. transfecter des cellules, soit avec le réactif à base de lipides (étape 3.1) ou le réactif à base de polyamine de protéine / (étape 3.2).

3. La transfection

1. Transfection à base de lipides:
   1. Réchauffer le Reagen de transfectiont à la RT dans l'obscurité. Réchauffez milieu sans sérum et DMEM / 9% de FCS à 37 ° C.
   2. Ajouter 0,5 pg d'ADN de plasmide à 50 pi de milieu sans sérum dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 2 ul de réactif de transfection avec la pointe de la pipette au-dessous de la surface du liquide. Vortex pendant 6 sec.
   3. Laisser reposer le mélange réactif / ADN dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min.
   4. Au cours de l'incubation de 30 min, retirez le support du puits et ajouter 250 microlitres de frais DMEM / 9% de FCS à chaque puits.
   5. Après 30 min, ajouter 250 ul de DMEM / FCS à 9% du mélange réactif / ADN. Mélangez bien par pipetage de haut en bas.
   6. Ajouter 300 ul du mélange dilué à chaque puits. Incuber pendant 2 à 4 h dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.
   7. Enlever la solution de transfection et ajouter 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incuber pendant 24 à 48 heures dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur avant de stimulation cellulaire.
2. Protéine / transfection à base de polyamine:
   1. Réchauffez sans sérummoyen et DMEM / 9% de FCS à 37 ° C.
   2. Ajouter 0,75 ul de réactif de transfection à 18,75 pi de milieu exempt de sérum. Vortex brièvement pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 0,5 pi de 1 ug / ul ADN dans le réactif transfectées diluée. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   3. Pendant les 10 minutes d'incubation, retirer le support de chaque puits de la plaque de 24 puits et ajouter 250 microlitres DMEM frais / 9% FCS à chaque puits.
   4. Après 10 min, ajouter 250 pi de DMEM / FCS 9% dans le mélange réactif / ADN.
   5. Ajouter 270 ul du mélange dilué dans le puits. Incuber dans un incubateur à _CO2 à 37 ° C et 5% pour les 2 - 4 heures.
   6. Enlever la solution de transfection et ajouter 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incuber pendant 24 à 48 heures dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.

4. cellulaire Stimulation et de dosage de luciférase

1. Remplacez le support dans les bien avec 250 pi de DMEM frais / 9% de FCS.
2. Ajouter 50 ul de LPS ou LPS + IL-10 Aux concentrations désirées dans le puits. Retourner la plaque à la 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Stimuler pour les 2 - 6 heures.
3. Enlever la solution de stimulation par aspiration, laver avec de la glace froide PBS, et ajouter 200 ul de tampon de lyse passive 1x. Rock à température ambiante pendant 30 min. Grattez et transférer le lysat tubes de 1,5 ml et éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 20.000 g pendant 10 min à 4 ° C.
4. Transfert 40 pi de lysat clarifié (surnageant) à une plaque de 96 puits à fond transparent blanc pour la détermination de signaux luciférase selon le protocole du fabricant.
5. Lire le signal de la luciférase avec un luminomètre à travers l'ensemble du spectre de la lumière visible.

5. Analyse des données

1. Calculer la luciole: Renilla rapport en divisant les valeurs individuelles de la luciférase de luciole par les valeurs de la luciférase de Renilla dans chaque puits.
2. Calculer le facteur de changement en divisant la luciole: Renilla rapport de la bien traités parcelle du puits non traitée.

Résultats

La figure 1 compare l'efficacité de transfection des deux réactifs de transfection dans RAW264.7. Le réactif à base de lipides a typiquement taux de transfection d'environ 25%, tandis que la transfection à base de polyamine de protéine / a donné lieu à environ 5% d'efficacité (figure 1A). La différence dans l'efficacité de transfection a été également observée dans les signaux de luciférase dans les cellules transfectées avec le RAW264.7 pGL3-promoteur I...

Discussion

Le protocole décrit ici ne se concentre pas uniquement sur l'efficacité de transfection, mais vise à trouver un équilibre entre l'efficacité et la conservation des états physiologiques de cellules. Plus précisément, notre procédure réussit à minimiser la toxicité du réactif de transfection et de maximiser le signal luciférase.

Une étape critique dans le protocole est la santé des cellules. Envahi par la végétation des cultures ne sont pas appropriés pour la transfe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910