Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones

Résumé

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Résumé

Les maladies affectant l'intégrité des neurones moteurs de la moelle épinière sont parmi les troubles neurologiques les plus débilitantes. Au cours des dernières décennies, le développement de plusieurs modèles animaux de ces maladies neuromusculaires a fourni à la communauté scientifique avec différents scénarios thérapeutiques visant à retarder ou inverser la progression de ces conditions. En tirant parti de la machinerie rétrograde de neurones, une de ces approches a été de cibler les muscles squelettiques afin de gènes thérapeutiques de la navette dans les neurones moteurs de la moelle épinière correspondant. Même si une fois prometteur, le succès de l'approche de livraison tels génique a été entravée par le nombre de sous-optimale des neurones moteurs transduites il a montré jusqu'ici de céder. plaques d'extrémité du moteur (MEPs) sont des régions très spécialisées sur les muscles squelettiques qui sont en contact synaptique direct à la moelle épinière α neurones moteurs. À cet égard, il est important de noter que, jusqu'à présent, les efforts de manière rétrogradetransférer des gènes dans les neurones moteurs ont été faites sans référence à l'emplacement de la région MEP dans les muscles ciblés. Ici, nous décrivons un protocole simple 1) pour révéler l'emplacement exact des députés sur la surface des muscles squelettiques et 2) d'utiliser cette information pour guider la prestation intramusculaire et transport rétrograde optimale ultérieure des traceurs rétrogrades dans les neurones moteurs. Nous espérons que d'utiliser les résultats de ces expériences de traçage dans d'autres études dans l'enquête sur le transport rétrograde de gènes thérapeutiques aux neurones moteurs de la moelle épinière à travers le ciblage des députés.

Introduction

La perte de contrôle du mouvement volontaire qui résulte de troubles neurologiques comme la maladie du motoneurone et spinal- ainsi que l'atrophie musculaire de Duchenne est une maladie débilitante qui a un impact élevée et durable sur la vie quotidienne des personnes touchées. Au cours de la dernière décennie, les efforts de recherche visant à arrêter ou au moins retarder les effets délétères de ces maladies neuromusculaires a été une priorité pour de nombreux cliniciens et les scientifiques du monde entier. À cet égard, la dernière génération de modèles animaux qui imitent ces maladies neuromusculaires a joué un rôle dans l'obtention de connaissances fondamentales sur les mécanismes physiologiques qui sous-tendent le développement et la progression de ces conditions ^{de 1 à 13.} Le traitement de ces maladies neuromusculaires exige un accès direct à la moelle épinière et peut être obtenu par des injections de la moelle épinière ^14,15. Les progrès récents dans la thérapie génique ont également ciblé les muscles striés de la partie supérieure etmembres inférieurs à gènes thérapeutiques de navette vers les motoneurones α correspondants qui sont situés dans la corne ventrale de la moelle épinière ^1,9-13. Cependant, cette stratégie une fois prometteuse n'a pas réussi à améliorer le résultat de ces conditions neurologiques. Alors qu'il est juste de conclure que ces piètres résultats pourraient être, au moins en partie, être attribuable à la faible efficacité de ces gènes protecteurs, on ne peut exclure la faible efficacité de ces méthodes de transfert de gènes.

plaques d'extrémité du moteur (MEPs) sont des régions spécialisées des fibres musculaires squelettiques qui sont en retrait par les terminaisons axonales des grandes fibres motrices périphériques provenant α neurones moteurs. Ensemble, les terminaisons de fibres nerveuses périphériques et les députés forment la jonction neuromusculaire, à savoir, le site où l'influx synaptique sont déclenchées par la libération du neurotransmetteur antérograde, l'acétylcholine. Surtout, la relation entre les fibres nerveuses périphériques et les députés est bi-directional, bien que différents moteurs sont responsables pour le transport des molécules et des organites vers ainsi que l'écart du neurone Somata ^16-18. À la lumière de ces considérations anatomiques, les députés semblent être des cibles de choix pour la livraison et le transport rétrograde ultérieure de matériel génétique pour les neurones moteurs correspondants. Dans ce contexte, il est peu surprenant que le succès de neurone moteur transduction dépend fortement de la distance entre l'injection intramusculaire de vecteurs viraux et les députés de la musculaires ^19-20. Curieusement, cependant, l'emplacement exact des zones de MEP sur les fibres musculaires du rat de laboratoire et de la souris, les deux espèces de choix pour modéliser les maladies neuromusculaires, ne étaient pas disponibles jusqu'à récemment.

Nous avons produit des cartes détaillées de la région MEP pour plusieurs muscles des membres antérieurs chez le rat et la souris ^21-22. Plus récemment, nous avons montré les détails de l'organisation de la MEP région pour plusieurs muscles de la patte arrière de la souris ²³ et nous sommes en train d'analyser les caractéristiques des députés de la patte arrière de rat. Dans nos mains, des injections intramusculaires de traceurs rétrogrades dirigés vers les zones MEP entières dans ces muscles ont donné lieu à des neurones moteurs plus marqués qui sont Spanning segments de la moelle épinière plus que rapporté précédemment. Ici, nous présentons le protocole qui a été développé au cours des dernières années pour révéler l'emplacement des députés sur la surface externe ainsi que toute la profondeur de la patte arrière et patte avant muscles de la souris et le rat.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ici respectées les soins et du Comité d'éthique animale de l'UNSW Australie et ont été effectuées en conformité avec le Medical Research Council de l'Australie règlements pour l'expérimentation animale Santé nationale et du. Toutes les procédures décrites dans ce protocole doivent être effectués en conformité avec l'exigence de la commission de protection des animaux et de l'éthique pertinents.

1. acétylcholinestérase histochimique coloration

1. Préparer le mélange de réaction de l'acétylcholinestérase
   1. Ajouter 290 mg de iodure d'acétylthiocholine 200 ml de 0,1 M de tampon de phosphate (PB). Mélanger avec un agitateur magnétique à 900 tours par minute.
   2. Ajouter 600 mg de glycine sous agitation continue.
   3. Ajouter lentement 420 mg de sulfate de cuivre au mélange réactionnel sous agitation continue jusqu'à ce que le produit soit complètement dissous.
2. Retirer la peau sur la carcasse de l'animal (obtenu par le partage de tissu) en faisant des incisionsdans la peau d'un rat ou une souris perfusé, saisir la peau de la région du cou et en la tirant passé ses pieds. Assurez-vous que le fascia couvrant chaque muscle est soit supprimé ou sensiblement perforé pour assurer suffisamment l'exposition des fibres musculaires à la solution de réaction.
3. Immerger le corps entier ou d'un membre d'intérêt dans le mélange de réaction et incuber O / N à 4 ° C.
4. Laver la carcasse pendant 2 min dans de l'eau distillée. Remarque: A ce stade, les muscles présentent une coloration bleue et les plaques d'extrémité du moteur (MEPs) peuvent être considérés comme des points blancs.
5. Exposer la carcasse à une solution à 10% de sulfure d'ammonium à 5/3 sec.
   Remarque: Les fibres musculaires vont rapidement brunissent et les députés seront observables comme des points noirs tachetés. Si la réaction se produit trop rapidement, et les fibres musculaires sont colorées trop sombre pour distinguer entre les députés européens et les fibres musculaires essayez d'utiliser des concentrations plus faibles de solution de sulfure d'ammonium (par exemple, 5%). Le temps de réaction pour obtenir lecontraste optimal entre les députés européens et les fibres musculaires varie d'un échantillon à l'autre. Il est donc difficile de définir la durée d'exposition exacte de réactif. La réaction doit être étroitement surveillée et arrêtée lorsque le contraste est jugé adéquat.
6. Laver la carcasse deux fois, avec une agitation dans de l'eau distillée et tapotez doucement la carcasse sèche.
7. Photo à la fois les aspects latéral et médial de la jambe, en assurant que les députés de tous les muscles d'intérêt sont capturées.

2. injections intramusculaires au niveau des plaques motrices de fin

1. Tirez micropipettes de verre avec un extracteur micropipette (l'utilisation de micro-pipettes graduées avec des plongeurs est recommandé). Avec l'aide d'un microscope à dissection, briser les pointes des micropipettes avec une paire de forceps de telle sorte que le diamètre interne de la lumière de la micropipette est d'environ 0,5 mm.
2. Veiller à ce que tous les instruments chirurgicaux utilisés sont fraîchement autoclave et eà la zone chirurgicale est stérile.
3. Remplissez les micropipettes avec Fluoro-Gold (5% dans de l'eau distillée).
4. Induire chez l'animal anesthésier dans une chambre d'induction avec isofluorane (4% O _2). Vérifiez réflexe de redressement et d'assurer son absence avant de le retirer de la chambre d'induction. Fixer un cône de nez sur le museau du rat et de livrer isofluorane (2% en O ₂₎ pour l'entretien de l'anesthésie. Pincez les orteils de l'animal et toucher doucement l'œil de l'animal afin d'assurer que les deux le retrait de la pédale et les réflexes cornéens sont absents. Note: Un mélange de kétamine et xylazil peut également être utilisé (80 et 10 mg / kg, respectivement, livré par voie intrapéritonéale). La kétamine est un annexe 8 ("Contrôle") médicaments et les protocoles nécessaires liés à l'achat, l'utilisation, le stockage et l'élimination de la drogue devront être respectées.
5. Appliquer un lubrifiant oculaire pour éviter le dessèchement des yeux au cours de la procédure.
6. Raser les tmembre argeted et l'utilisation de la gaze pour essuyer la zone rasée avec trois gommages alternées de chlorhexidine et 70% d'alcool. Transfert à l'animal de la zone chirurgicale.
7. Placez l'animal sur un underpad propre et le positionner de manière appropriée pour assurer un bon accès au muscle (s) ciblé.
8. Utilisez une paire de pinces avec des poignées de dents pour soulever la peau sur le muscle ciblé loin de la musculature sous-jacente et faire une incision dans la peau avec des ciseaux chirurgicaux. Assurez-vous que l'incision est suffisamment grande pour exposer complètement le muscle (s) d'intérêt. Assurez-vous qu'il ya une perturbation minimale de l'aponévrose.
9. Utilisez les photographies MEP de transposer mentalement l'emplacement et la forme de la région MEP sur le muscle (s).
   Remarque: Un marqueur de feutre amende pourrait aider à reproduire la région député européen de la photographie sur le muscle (s) d'intérêt.
10. Effectuer des injections multiples sur toute la longueur de la région, MdPE (pour Fluoro-Gold, 3 à 4 injections de 1-2 ul chaque sHould être suffisant). Essuyez doucement le muscle (s) pour enlever toute infiltration.
11. Apportez les deux extrémités de la peau incisée étroite collaboration avec le forceps émoussé et fermer la plaie avec des pinces chirurgicales. Infiltrez 0,1 ml de bupivacaïne (0,5% dans l'eau) (ou d'autres anesthésiques locaux) sur toute la durée de la plaie.
12. Mettez la machine hors d'anesthésie et surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il a est complètement remis de l'anesthésie.
13. Attendre 14 jours entre l'administration d'injections intra-musculaires et la perfusion des animaux.

3. perfusions

1. Administrer une dose létale de solution de pentobarbital de sodium (par exemple Lethabarb; 150 mg / kg) à l'animal par injection intrapéritonéale.
   1. Surveiller de près l'animal jusqu'à un niveau profond de l'anesthésie est atteint, comme l'a confirmé l'absence de retrait de la pédale et les réflexes cornéens.
2. Placez l'animal sur son dos sur une planche de dissection placé sur un perfusion évier.
3. Utilisez une paire de pinces avec des poignées de dents pour soulever la peau recouvrant la base du sternum. Faire une petite incision de la peau avec une paire de ciseaux chirurgicaux fortes immédiatement au-dessous du sternum et ensuite utiliser la pince pour saisir le cartilage xiphoïde du sternum. Tout en maintenant le cartilage xiphoïde, agrandir l'incision des deux côtés de la cage thoracique, à partir du sternum au niveau des aisselles.
4. Couper la membrane pour exposer le coeur.
   1. Injecter de l'héparine 0.ml directement dans l'apex du coeur pour empêcher la coagulation du sang.
   2. Couper le sommet pour permettre l'insertion d'une canule dans le ventricule gauche, et serrer ensuite rapidement la canule en place à l'aide d'une pince hémostatique.
   3. Faire une incision dans l'oreillette droite avec une paire de ciseaux fins et commencer immédiatement la pompe péristaltique. Perfuser avec 0,1 M de PB jusqu'à ce que le liquide qui sort de l'oreillette est pratiquement exempt de sang et la couleur du foie devient brun clair. Ensuite, perfuser avec une solution de paraformaldéhyde (4% dans 0,1 M de PB) jusqu'à ce que l'ensemble du corps de l'animal devient rigide.

4. col de l'utérus et de la moelle épinière Dissection Préparation pour l'histologie

1. Poser la carcasse de l'animal sur son abdomen.
2. Découper la peau à la ligne médiane du corps avec un scalpel et la réfléchir à partir de la base du crâne au niveau de l'os iliaque.
3. Couper à travers et refléter les muscles paravertébraux pour exposer la face dorsale de la colonne vertébrale.
4. Identifier l'apophyse épineuse osseuse de l'Atlas, le deuxième segment cervical (c.-à-C2), et retirez-la avec une paire de pinces chirurgicales rongeurs ou de localiser la racine dorsale sous-jacents correspondants.
   1. Identifier la racine C2 droit par la coloration avec un feutre permanent.
   2. Retirer la prochaine vertèbres un par un et marquer les racines dorsales droite avec des couleurs alternées (c.-à-C2, C4, C6, C8 et peut être coloré en vert et C3, C5, C7, T1 peut être colORed en bleu).
5. Utilisez une petite aiguille chirurgicale (par exemple, 30 G d'aiguille de la jauge) pour doucement percer la dure recouvrant l'extrémité inférieure de la moelle épinière. Avec le biseau de l'aiguille vers le haut, soulever la dure-mère loin de la corde tout en déplaçant l'aiguille rostralement de faire une fente longitudinale.
   1. Refléter la dure-mère.
6. Couper le transversalement de la moelle épinière en blocs d'une ou deux segments avec une nouvelle lame de scalpel.
   1. Laissez les segments de la moelle épinière in situ et, pour chaque bloc, faire soigneusement une petite marque de repère sur le côté gauche de chaque bloc avec le mi-chemin de la lame de bistouri entre deux racines adjacentes. Assurez-vous que le repère de référence est assez profond à travers le tissu à être visible de la face ventrale des blocs. Faire le repère de référence à un angle d'environ 45 °, pointant soit avant ou en arrière par rapport à l'anatomie animale, pour aider à l'orientation du segment de tissu suivante dissection.
7. Recueillir les blocs individuels dans de petites bouteilles, clairement étiquetés contenant une solution de paraformaldéhyde (4% dans 0,1 M de PB) et de laisser à la température ambiante O / N.
8. Transférez les blocs dans des bouteilles propres, clairement étiquetés contenant une solution de saccharose (30% dans 0,1 M de PB) et de garder à 4 ° C pendant au moins deux jours.
9. Placez les segments en cryo-moules et les couverts avec le milieu de congélation de tissu. Pour la préparation histologique longitudinale, orienter les blocs avec la face dorsale vers le haut et d'utiliser la marque de repère pour orienter le bloc dans les cryo-moules.
10. Geler les cryo-moules à -20 ° C et couper avec un cryostat dans 50 sections um d'épaisseur. Remarque: Les sections peuvent être montées directement sur des lames de microscope l'adhérence et à sécher O / N. Alternativement, les sections peuvent être flottaient dans des plaques à 48 puits remplis avec 0,1 M de PB et montés par la suite en utilisant le repère de référence pour orienter les coupes de tissus sur les lames.

5. lombaire Coe Dissection et préparation pour l'histologie

1. Poser la carcasse de l'animal sur son dos.
2. Effectuer une incision médiane le long de l'abdomen de l'animal et enlever les viscères. On dissèque les muscles de la paroi abdominale postérieure pour exposer la face ventrale de la colonne vertébrale.
3. Localisez la nervure caudale plus court et sa attenant T13 vertèbre où le T13 racine ventrale quitte l'os.
   1. Consécutivement retirer un par un l'rostrale deux ou trois vertèbres T13 (c.-à-T12, T11 et, si nécessaire, T10) avec rongeurs chirurgicales fines pour suivre le T13 racine ventrale jusqu'à son point d'entrée dans la face ventrale du cordon ventral et la marquer avec un feutre permanent.
   2. De ce point, répétez la même procédure pour identifier l'emplacement des points d'entrée des racines ventrales pour L1, L2, L3, L4, L5, L6 et S1, les colorer avec des couleurs alternées.
4. Suivre la même procédure que celle décrite dans la section 4.5 au 4.10 pour lumbar moelle dissection du cordon.

Résultats

Acetylcholinesterase coloration histochimique révèle l'emplacement des plaques d'extrémité du moteur sur toute la largeur des muscles. La figure 1 illustre les résultats d'une telle coloration effectuée sur un ensemble des membres antérieurs du rat. Il est recommandé d'optimiser la concentration de la solution de sulfure d'ammonium (par ex., De 5 à 7% au lieu de 10%) ainsi que le moment où le spécimen est immergé dans la solution si la coloration de fond non-spé...

Discussion

Ciblage intramusculaire et le transfert rétrograde ultérieure de transgènes thérapeutiques pour les motoneurones α correspondant pour le traitement expérimental de l'état neuromusculaire est pas une nouvelle stratégie. Par exemple, ce mode de livraison a été utilisée pour retarder la dégénérescence neuromusculaire à différents stades de la progression de la SLA chez les souris et les rats SOD1 ^1,9-12 ainsi que chez les souris avec ¹³ SMA. Bien que prometteur, l'efficacité d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%