Isolement des leucocytes à partir de l'interface humaine materno-fœtale

Résumé

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Résumé

La grossesse est caractérisée par l'infiltration de leucocytes dans les tissus reproducteurs et à l'interface materno-fœtale (caduque basale et caduque pariétale). Cette interface est le site anatomique de contact entre la mère et de tissus foetaux; par conséquent, il est un site d'action immunologique au cours de la grossesse. Infiltrant leucocytes à l'interface materno-fœtale jouent un rôle central dans l'implantation, l'entretien de la grossesse, et le calendrier de livraison. Par conséquent, les caractérisations phénotypiques et fonctionnelles de ces leucocytes fourniront des renseignements sur les mécanismes qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs protocoles ont été décrits dans le but d'isoler leucocytes infiltrant des caduque basale et parietalis caduque; Cependant, le manque de cohérence dans les réactifs, les enzymes, et les temps d'incubation, il est difficile de comparer ces résultats. Décrit ici est une nouvelle approche qui combine l'utilisation de diss mécaniques et enzymatiques doucestechniques de ociation de préserver la viabilité et l'intégrité des marqueurs intracellulaires et extracellulaires dans les leucocytes isolés à partir de tissus humains à l'interface materno-fœtale. Mis à part l'immunophénotypage, culture cellulaire, et le tri de cellules, les applications futures de ce protocole sont nombreuses et variées. À la suite de ce protocole, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour déterminer la méthylation de l'ADN, l'expression de gènes cibles, de fonctionnalité in vitro de leucocytes (par exemple, la phagocytose, la cytotoxicité, la prolifération des cellules T, et de la plasticité, etc.), et la production d'espèces réactives de l'oxygène à l'interface materno-fœtale. En outre, en utilisant le protocole décrit, ce laboratoire a été en mesure de décrire les leucocytes nouvelles et rares à l'interface materno-fœtale.

Introduction

La grossesse est caractérisé par trois phases distinctes: une immunologiques) implantation et la placentation précoce associée à une réponse pro-inflammatoire (par exemple, implantation ressemble à un «plaie»); 2) le deuxième trimestre et la plupart du troisième trimestre de la grossesse, lorsque l'homéostasie immunitaire est atteint grâce à un état majoritairement anti-inflammatoire à l'interface materno-fœtale; et 3) la parturition, un état ​​pro-inflammatoire ^1-7. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire à l'interface materno-fœtale où leur abondance et le changement de localisation pendant la grossesse ^6-9.

Chez les humains, l'interface materno-fœtale représente une zone de contact direct entre la mère (caduque) et foetale (chorion ou trophoblaste) tissus. Cette interface comprend: 1) la caduque pariétale qui tapisse la cavité utérine ne sont pas couverts par le placenta et est en juxtapositionau laeve de chorion; et 2) les caduque basale, situé dans la plaque basale du placenta où il est envahi par les trophoblastes interstitiels ¹⁰ (Figure 1). L'intimité de ces zones de contact crée les conditions pour l'exposition du fœtus à l'antigénique immunitaire ^11-13 du système maternelle. Sans surprise, les leucocytes comprennent jusqu'à 30 à 40% des cellules déciduales ^8,9,14,15 en plus des cellules de type stromal typiques et les cellules glandulaires ^8,14,16. Le rôle des leucocytes à l'interface materno-fœtale englobe de multiples processus qui incluent la limitation de l'invasion trophoblaste ^17, le remodelage des artères spiralées ^18,19, maintien de la tolérance maternelle ^12,20, et l'initiation du travail ^21-26. Les leucocytes à la fois de l'adaptation et des membres innée du système immunitaire, à savoir, les cellules T, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules NK, ont été identifiés dans les tissus déciduales, et leurIl a été démontré proportions et l'état d'activation de varier spatialement et temporellement pendant toute la gestation ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbations dans la population et / ou de la fonction des leucocytes sont associés à un avortement spontané ^{31, 32} pré-éclampsie, une restriction de croissance intra-utérin ^32,33 et ^7,24 travail prématuré. Par conséquent, l'étude des caractéristiques phénotypiques et la fonctionnalité des leucocytes à l'interface materno-fœtale humaine facilitera l'élucidation des voies immunologiques surexprimés dans les troubles de la grossesse.

Un des outils les plus puissants utilisés pour déterminer le phénotype et les propriétés fonctionnelles de leucocytes est la cytométrie de flux, une technologie qui permet l'analyse quantitative de plusieurs paramètres simultanément ^34-36. Pour analyser les leucocytes par cytométrie de flux, l'isolement des leucocytes dans une suspension à cellule unique est nécessaire. Par conséquent, un procédé pour séparer l'infiltration leukocytes de l'interface materno-fœtale est nécessaire pour étudier leur propriétés phénotypiques et fonctionnels.

Plusieurs méthodes ont été décrites pour isoler les leucocytes de l'interface materno-fœtale humaine ^{10,14,25,27,37-39.} Alors que certains appliquent désagrégation mécanique ^10,25,27,38, d'autres utilisent la digestion enzymatique ^37,40 pour la dissociation des tissus. Parce que la désagrégation mécanique produit un rendement plus faible et la viabilité réduite ^41, et la dissociation enzymatique peut affecter la viabilité et la surface de la cellule marqueur rétention ^42, le procédé décrit ici combine dissociation mécanique douce avec prétraitement enzymatique pour augmenter le rendement des leucocytes isolés sans compromettre la viabilité des cellules. Une combinaison de méthodes similaire a été démontrée comme étant efficace dans la séparation de leucocytes à partir des tissus déciduales à l'interface materno-fœtale ^39. Par conséquent, le protocole décrit ici implique mécadésagrégation nique avec un dissociateur automatique de tissu qui augmente la cohérence tout en économisant du temps et de la main-d'œuvre par rapport à hachage traditionnel avec des scalpels opposées, lames de rasoir, des ciseaux chirurgicaux ou ^10,28. L'enzyme choisie pour la dissociation des tissus était Accutase. Contrairement à la collagénase utilisée par ^{43, 44} dispase, la trypsine et ^45, Accutase (une solution de détachement cellulaire) combine à la fois des activités protéolytique et collagénolytiques général qui contribuent à la dissociation efficace et doux ^46,47. Après dissociation, les leucocytes sont enrichies à partir de la population totale des cellules déciduales par centrifugation en gradient de densité. Différents milieux de gradient de densité ont été utilisés précédemment, le plus commun qui sont Percoll (une suspension de particules de silice colloïdale) ⁴⁸ et Ficoll (un polymère de saccharose avec un poids moléculaire synthétique de haute) ^49. L'efficacité supérieure de l'isolement par le polymère de saccharose a été previoisa nt montré ^50, et le protocole décrit ici encore prouve que ce média de gradient de densité produit une pureté suffisamment élevé de leucocytes mononucléaires.

Par conséquent, le protocole décrit ici combine la désagrégation du tissu mécanique avec un dissociateur automatique de tissu, la digestion enzymatique avec une solution de détachement de la cellule, et la séparation des leucocytes avec un milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) pour isoler les leucocytes à partir de tissus déciduales humaines. Ce protocole a été prouvé pour préserver les antigènes de surface des cellules ainsi que la viabilité des cellules. Les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications qui comprennent immunophénotypage avec la cytométrie de flux et des études fonctionnelles in vitro.

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Protocole

Ce protocole est approprié pour l'isolement des leucocytes des caduque basale et parietalis caduque en préparation pour l'immunophénotypage par cytométrie de flux. En outre, les cellules isolées peuvent être utilisées pour le tri cellulaire, culture cellulaire, l'isolement de l'ARN, et la cytologie. Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l'approbation éthique humaine doit être obtenue auprès du Comité d'éthique de la recherche locale et Institutional Review Board. La collecte et l'utilisation d'échantillons humains à des fins de recherche ont été approuvés par les Institutional Review Board de l'Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, National Institutes of Health (NIH), ministère de la Santé et des Services sociaux (DHHS , Bethesda, MD, USA) et Wayne State University (Detroit, MI, USA). Un consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de toutes les femmes enceintes avant le prélèvement d'échantillons de tissus.
REMARQUE: Tout en travaillant avec le sang des animaux, les cellules, ou de dangeragents UO comme mentionné dans ce protocole, il est essentiel que la biosécurité appropriée et des mesures de sécurité de laboratoire soient suivies.

1. Dissection des déciduales tissus humains

NOTE: La plaque de base est la base au-dessous et ci-joint au placenta et représente la surface maternelle. Les membranes chorioamniotic comprennent l'amnios et le chorion. La plaque basale comprend les caduque basale et le chorion comprend parietalis caduque (Figure 1).

1. Decidua basalis
   1. Disséquer un morceau de la plaque de base d'un cotylédon du placenta (figures 1A et 1B).
   2. Placez-le sur une planche à découper stérile avec les villosités placentaires vers le haut. Le côté montrant la villosités placentaires est généralement rouge sang avec le tissu poilu en apparence. La plaque basale est lisse et pâle de couleur rouge.
   3. Utilisez tranchants, ciseaux pointes fines et une pince pour retirer la villtissus et les vaisseaux sanguins UO. Gardez le tissu trempé dans 1x PBS (Ca2 ⁺ - et Mg ²⁺ - gratuitement) pendant le processus (figure 1C). Recueillir 2 à 3 de ces pièces et rincez-les soigneusement avec 1x PBS pour éliminer le sang (figure 1D).
2. Decidua parietalis
   1. Disséquer un morceau de membranes chorioamniotic (environ 10 cm x 10 cm, figure 1E). Placez-le sur la planche avec le chorion vers le haut. Le côté chorionique contient des caillots de sang et est généralement la lumière de couleur jaunâtre.
   2. Utilisez pointes fines pinces pour retirer autant de caillots de sang que possible (figure 1E). Rincer la membrane stérile 1x PBS pour nettoyer l'excès de sang à partir de la membrane jusqu'à ce que le PBS 1x soit claire.
   3. Utilisez un grattoir à cellules stérile à usage unique pour gratter doucement la couche déciduale de la membrane. Appliquer stérile 1x PBS sur la memBrane tout en complétant ce processus (figure 1F). Recueillir les tissus déciduales et les placer dans un tube en plastique de 50 ml avec PBS 1x stérile (figure 1G).

2. La ventilation mécanique et de digestion enzymatique

1. Laver le tissu disséqué à partir de la caduque basilaire de l'étape (1.1.3) ou la caduque pariétale (de l'étape 1.2.3) avec PBS 1x stérile dans un tube en plastique de 50 ml. Recueillir des pastilles de tissu par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
2. Aspirer le surnageant situé au-dessus du culot de tissu soigneusement sans perturber le culot.
   NOTE: A ce stade, les pastilles sont très lâche, car ils contiennent des globules rouges. Si le volume de la pastille est d'environ ou inférieur à 3 ml, remettre en suspension le culot dans 6 ml de solution de détachement cellulaire pré-chauffé à 37 ° C. Si la pastille est supérieure à 3 ml de volume, ajouter plus de solution de détachement cellulaire (ajouter environ 2 fois èmee volume des échantillons de tissus).
3. Transférer les tissus homogénéisés (caduque basale + détachement cellulaire solution ou caduque parietalis + solution de détachement cellulaire) à un tube de C.
4. Placer le tube de C dans le dissociateur automatique et exécuter le programme correspondant.
   NOTE: Le programme pour les caduque basale fonctionne pendant 17 secondes avec 668 tours au total par cycle. Le programme pour les parietalis caduque fonctionne pendant 37 secondes avec 235 tours au total par cycle. Ces programmes ont été personnalisés pour isoler des leucocytes caduque basilaire ou parietalis caduque avec un bon rendement et la viabilité cellulaire.
5. Après la désagrégation mécanique des tissus, digérer les tissus avec une solution de détachement cellulaire disponible dans le commerce tel que Accutase; (Un cocktail contenant des enzymes protéolytiques et collagénolytiques) pendant 45 min à 37 ° C avec agitation douce.

3. Isolement de leucocytes

1. Après l'incubation, ajouter 10 ml de 1 x PBS à la digemélange stion et passer à travers un tamis cellulaire 100 um dans un tube en plastique de 50 ml. Selon la viscosité du mélange de digestion, on peut avoir besoin d'utiliser plusieurs filtres de cellules pour une mélange.
2. Remplir le tube avec 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le PBS 1x-dessus des culots cellulaires soigneusement et remettre en suspension les culots avec 5 ml de tampon FACS glacé.
   NOTE: Pour étudier les polynucléaires et mononucléaires leucocytes ensemble, passez à l'étape 6.1; d'étudier les leucocytes mononucléaires, passez à l'étape 3.3.
3. Ajouter 5 ml de 20% de milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) dans un tube en plastique de 15 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire au-dessus du milieu de gradient de densité. Bien que la stratification de l'échantillon, il est important de ne pas mélanger le milieu à gradient de densité avec la suspension de cellules.
4. Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à 4 ° C sans le frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et lOsing le gradient. Les leucocytes se trouvent à l'interface entre le milieu à gradient de densité et le tampon FACS.
5. Retirer la couche supérieure qui contient les débris de la mémoire tampon et la cellule FACS très soigneusement à l'aide d'une pipette. La bande de l'interface contenant les cellules mononucléaires déciduales et une partie des leucocytes polynucléaires.
6. Transférer les cellules à l'interface complètement dans un nouveau tube de plastique de 15 ml. Ajouter au moins 3 fois plus de volume de tampon FACS.
7. Centrifuger à 300 g pendant 5 min à pastiller les cellules. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec un tampon FACS. Pastiller les cellules avec un autre centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: Pour effectuer la culture de cellules, voir l'étape 4. Pour effectuer le tri de cellules, voir l'étape 5. Pour effectuer immunophénotypage, voir l'étape 6.

4. Applications - culture cellulaire

1. Re-suspendre les cellules de l'étape 3.7 dans 1 ml de milieu de culture RPMI 1640. Compter les cellules viables using un compteur automatique de cellules ou d'un hémocytomètre et une solution bleu trypan 0,4%.
2. Additionner la quantité de milieu de culture RPMI pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Les cellules sont maintenant prêts pour la culture.

5. Les demandes - Isolement de macrophages pour la culture de cellules primaires

1. Pour isoler CD14 + cellules magnétiquement marquer les cellules de l'étape 3.7 avec des microbilles CD14 (20 perles de pi par 10 ⁷ cellules), incuber pendant 15 min à 4 ° C, et CD14 séparé + cellules d'autres types de cellules par application d'un champ magnétique. Après 2 lavages avec du tampon MACS et le retrait du champ magnétique, éluer les cellules CD14 + retenues magnétiquement avec un tampon MACS.
2. Après la centrifugation, remettre en suspension les culots cellulaires dans du milieu de culture RPMI 1640. Les cellules sont prêtes pour le placage (Figure 2).

6. Applications - IMMUNOPHENOTYPAGE

1. Pour utiliser les cellules pour immunophenotyping, re-suspendre les cellules de l'étape 3.7 dans 1 ml de PBS 1x. Compter les cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre et une solution de bleu trypan à 0,4%.
2. Étiqueter les cellules avec un colorant de viabilité peut être fixée (figure 3). Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension les cellules dans du tampon de coloration. Incuber avec un bloqueur FcR pendant 15 min à 4 ° C.
3. Ajouter les anticorps conjugués à des fluorochromes extracellulaires. Par exemple, dans ce protocole, en utilisant l'anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15, anti-CD56 et des anticorps (tableau 1). Incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
4. Après deux lavages avec 1 x PBS, les cellules seront analysés dans 500 ul de tampon de coloration en utilisant un cytomètre de flux. Une représentation de la stratégie de déclenchement utilisé pour analyser les sous-populations de leucocytes présents dans les tissus déciduales est représenté sur la Figure 4.

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Résultats

. La dissection de tissus humains à l'interface materno-fœtale (caduque basale et caduque parietalis) est représenté en figure 1 Cette procédure comprend la dissection de la plaque de base, qui comprend les caduque basale (Figure 1A - D). Le basalis caduque est obtenue en enlevant la villosités placentaires (côté fœtal) à partir de la plaque de base (Figure 1C). Le parietalis caduque est recueilli par grattant doucement la membrane chorion...

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Discussion

Caractérisation des propriétés fonctionnelles et phénotypiques de l'infiltration des leucocytes à l'interface materno-fœtale humaine est essentielle pour la compréhension des mécanismes immunitaires qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites pour isoler les leucocytes de l'interface materno-fœtale humaine pendant la grossesse ^{10,14,25,28,37,42,43.} Cependant, chacune de ces techniques est distinct, met en oeuvre des enzymes ou des combinaisons ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator