Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Résumé

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Résumé

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Introduction

Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d'une surface par balayage sur une zone de l'échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine ^1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l'échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques - y compris les protéines, l'ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l'analyse des échantillons fixés dans l'air ou de l'état quasi-native dans un liquide ^2-5.

Outre sa capacité d'imagerie à haute résolution dans l'ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d'interaction (d'adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l'échantillon ^5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l'échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu'à ce qu'il perd le contact avec l'échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l'applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d'élasticité pour mesurer la rigidité d'un matériau, et les forces d'adhérence peuvent être obtenues.

Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d'un support solide - habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium ⁷ oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating ^8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées ^10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions ^{11 à 15.}

Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d'approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L'épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force ^6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN ^6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d'insaturation) et modifié par des agents de la membrane ¹⁶ actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué ¹⁷ et d'autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d'approche affectent également la force de percée ^15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques ^11,19, les changements de composition dépendant ^12,20, ainsi que des effets d'autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane ^21.

Le plat d'orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d'autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface ²² et la microscopie à fluorescence ^11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes.

Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l'AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L _o) et désordonnés (L) _d phases liquides ont été caractérisées ^11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d'autres processus cellulaires ^23,24.

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Protocole

1. Préparation de bicouches lipidiques supportées (SLB) ^11,12,21

1. Préparation de lipides Mélange vésicules multilamellaires et Suspensions
   1. Préparer les tampons suivants à l'avance.
      1. Préparer tampon PBS à des concentrations de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH ₂ PO _4, 8 mM Na ₂ HPO ₄ et NaCl 137 mM, pH 7,2.
      2. Préparer SLB (soutenu bicouche lipidique) à des concentrations de tampon NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
      3. Préparer une solution de 1 M de _CaCl2.
   2. Dissoudre les lipides suivants dans le chloroforme à une concentration désirée: par exemple, la di-oléyl-phosphatidylcholine (DOPC) à 25 mg / ml, la sphingomyéline (SM) à 25 mg / ml et le taux de cholestérol (Chol) à 10 mg / ml.
   3. Prenez 18,38 pi de DOPC, 17,10 pi de SM et 11,30 pi de Chol pour faire une solution avec 1 mg de lipides totaux dans un 2: 2: 1 DOPC: rapport molaire Chol: SM. Variez les volumes en conséquence sur la base du concentrations des lipides préparés en 1.1.2. Cependant, maintenir le rapport molaire de 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, que de changer le rapport molaire va changer les caractéristiques de phase de la membrane ^25.
   4. Mélanger la solution complètement au vortex. Ajouter un colorant fluorescent lipidique à 0,05% en moles si l'on veut visualiser la bicouche par un microscope à fluorescence.
      Remarque: La famille de dialkylcarbocyanines à longue chaîne, comme l'a fait, Dil et DiO couvrent un large éventail de longueurs d'onde et peuvent être idéalement utilisés pour marquer des membranes lipidiques. En variante, des lipides marqués par fluorescence, tels que la phosphatidyléthanolamine ou la rhodamine-BODIPY-cholestérol peuvent être utilisés. Dans tous les cas, la concentration du colorant doit être optimisée en fonction du réglage de la microscopie, en gardant à l'esprit que des concentrations élevées du fluorophore lié au lipide peuvent modifier le comportement des lipides ^19.
   5. Séchez le chloroforme en utilisant du gaz N ₂ (ou tout gaz inerte disponibles tels que Ar et He).
   6. En outre t secil lipide mélange sous vide pendant au moins 1 heure.
      Note: Si vous rangez ce mélange lipidique, purger l'air avec un gaz inerte (N _2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. Aliquoter excès de lipides-en-chloroforme dans de petits flacons bruns. Séchez-les d'une manière similaire à celle du mélange de lipides, déplacer l'air avec un gaz inerte (N _2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C.
   7. Dissoudre les lipides séchés dans du tampon PBS à une concentration de 10 mg / ml.
   8. Vortex vigoureusement le mélange pendant environ 20 sec à 1 min pour obtenir une suspension trouble, contenant des vésicules multilamellaires. Assurez-vous que la il n'y a pas de films lipidiques coller aux parois de la fiole.
   9. Distribuer cette suspension dans 10 aliquotes (1 mg de lipides fait 10 aliquotes).
   10. Stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
2. Préparation de vésicules unilamellaires
   Remarque: Les diverses tailles des vésicules unilamellaires peuvent être préparés en utilisant le procédé de sonication ou le procédé d'extrusion. Sonication utilise sound énergie pour agiter le mélange et séparer les couches de la suspension multilamellaire. Ceci est indiqué par le nettoyage de la suspension brumeux. Extrusion force les vésicules multilamellaires de passer à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore définie.
   1. Méthode de Sonication
      1. Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB.
      2. Transférer le mélange dans de petits (2 ml) flacons de verre plafonnés et sceller avec du Parafilm.
      3. Soniquer le mélange à la température ambiante dans un bain sonique pendant 10 min ou jusqu'à ce qu'il devienne clair pour donner de petites vésicules unilamellaires (SUV, en dessous de 50 nm de diamètre).
   2. Extrusion Méthode
      1. Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB.
      2. Transférer la suspension dans un tube cryogénique.
      3. Geler la suspension de lipides en immergeant le tube cryogénique pour quelques secondes dans de l'azote liquide.
      4. Décongeler lesuspension lipidique en immergeant le tube cryogénique dans un bain d'eau à température ambiante ou 37 ° C pendant quelques minutes. Répétez les étapes de gel-dégel au moins 10 fois.
      5. Pour extruder la suspension de lipides, en utilisant une membrane de polycarbonate de 200 nm de taille de pores (d'autres tailles de pores sont disponibles comme, 100 nm ou 400 nm) et un dispositif d'extrusion ²⁶ commerciale.
         Remarque: Actuellement, il existe deux dispositifs d'extrusion disponibles dans le commerce: une extrudeuse manuel est disponible pour de petits volumes (200 pi à quelques ml). Dans ce cas, l'échantillon est extrudé à travers la membrane en poussant manuellement la suspension avant et en arrière entre deux seringues. Selon le fabricant, devraient être combinées pour atteindre son volume minimum de la mise en place des aliquotes lipidiques. Pour de plus grands volumes (jusqu'à 50 ml) dispositifs plus sophistiqués qui sont utilisés dans la suspension est forcée à travers la membrane de polycarbonate à l'aide de gaz comprimé. SET-UP et extrusion conditions peuvent changer selon le model. Reportez-vous aux instructions du fabricant avant de l'utiliser. Ce protocole se réfère à l'extrudeuse manuelle pour les petits volumes.
      6. Equilibrer l'extrudeuse dans l'eau en faisant passer l'eau à travers l'extrudeuse. Plonger la membrane dans l'eau.
      7. Placer la membrane entre les deux pistons, l'assemblage du dispositif et équilibrer dans du tampon, en faisant passer le tampon à travers l'extrudeuse, d'une seringue à l'autre. Cette étape permet de tester en outre la perméabilité du système. En cas de fuite, démonter et le remonter à nouveau changer la membrane.
      8. Prendre la suspension de lipides en utilisant une seringue de l'extrudeuse («côté sale ').
      9. Fixer la seringue contenant la suspension de lipides sur une chambre et la seringue vide sur la chambre adverse.
      10. Poussez la seringue sur une extrémité. Filtrer la solution à travers la membrane et dans la seringue opposée. Ceci est la passe 1 ^er.
      11. Passer à travers la membrane pour un total de 31 fois cesque la solution se termine sur la seringue opposée («côté propre»).
          Remarque: Vérifiez la membrane après extrusion. Si elle a été rompue, puis procédé d'extrusion a échoué et doit être répétée.
      12. Vider la seringue dans un petit tube. Grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont stables pendant 1-2 jours si elles sont conservées à 4 ° C.
3. Préparation de Mica et Lamelles
   1. Laver lamelles de première dans l'eau puis dans l'éthanol. Sécher à l'air.
   2. Prenez disques de mica et de décoller la couche externe avec du ruban adhésif.
   3. Fixez le disque de mica sur la lamelle. Colles optiques transparents est optimisé de manière que l'on peut vérifier les bicouches avec un microscope à fluorescence.
   4. Attacher des cylindres en plastique (diamètre extérieur 2,5 cm, 2 cm de diamètre intérieur et 0,5 cm de hauteur) en utilisant de la colle optique / graisse. Assurez-vous que tout est scellé et qu'il n'y a pas de fuites. Utiliser de la graisse quand on veut réutiliser les bouteilles, car ils peuvent être facilement détachés de ee lamelle et lavé. Les dimensions des cylindres en plastique dépendent de la taille du support de cantilever AFM et doivent être ajustés en conséquence.
4. Dépôt de vésicules unilamellaires sur support solide
   1. Pipeter l'ensemble de la solution de liposome directement sur le mica. Ajouter davantage de tampon SLB pour atteindre un volume de 300 pi.
   2. Ajouter 0,9 pl d'une solution de chlorure de calcium M pour atteindre une concentration finale de 3 mM de Ca ^2+.
   3. Incuber à 37 ° C pendant 2 minutes et ensuite à 65 ° C pendant au moins 10 min. Toujours couvrir les bicouches avec le tampon. Le contact avec les bulles d'air et aériennes détruire. Pendant l'incubation, ajouter plus de mémoire tampon si nécessaire, surtout si incubation à des températures plus élevées.
      Remarque: Les températures d'incubation varient en fonction des mélanges lipidiques et les phases nécessaires. Le temps d'incubation d'au moins 10 min est nécessaire pour former des bicouches en charge, mais il pourrait être plus long, en fonction de la température et de la composition.
   4. Lavageavec la bicouche chaude (65 ° C) de 15 à 20 fois SLB tampon pour éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées. Prenez soin supplémentaire pendant les étapes de lavage pour garder la bicouche sous tampon et pipeter doucement la solution de lavage pour éviter de détruire la bicouche.
   5. Bicouches frais pris en charge à la température ambiante avant les mesures de l'AFM. Cela est nécessaire pour former les différentes phases de la membrane ainsi que de minimiser la dérive thermique dans l'instrument.

2. microscopie à force atomique Mesures ^11,12

1. Imagerie
   Remarque: Effectuez imagerie par microscopie à force atomique en mode contact ou en mode taraudage. Image supportés bicouches en solution; ne permettent pas de solution à évaporer complètement car cela va détruire les bicouches. Comme on pouvait travailler avec tampon, s'il vous plaît respecter les consignes de sécurité à faire en sorte qu'une partie de l'AFM est protégée contre les déversements de liquides.
   1. Sélectionnez un cantilever douce (inférieure à 0,2 N / m constante de ressort est conseillé) et le monter à til AFM. Le choix de la raideur en porte à faux est plus critique pour la spectroscopie de force (et cela sera discuté plus tard).
   2. Monter l'échantillon sur la scène de l'AFM et assurez-vous que tous les modules de vibration-isolement sont allumés. Attendez au moins 15 minutes pour équilibrer et de réduire la dérive thermique du système. Selon l'AFM set-up, tuning et d'imagerie spécifications peuvent varier. Consultez le manuel du fabricant.
   3. Approchez l'échantillon avec la pointe de l'AFM jusqu'à ce contact.
   4. Depuis bicouches lipidiques sont habituellement de 4 nm de hauteur, utiliser le Z-gamme de l'instrument qui donnera la plus haute résolution z (par exemple 1,5 um).
   5. Sélectionnez une région à l'image. Pour avoir un aperçu de la bicouche lipidique, 50 um x 50 um ou 25 um x 25 um région sera un bon point à l'image de départ. Si les petites fonctionnalités apparaissent, on peut image dans des zones plus petites (10 um x 10 um, ou 2 x 2 pm pm). Le choix de la zone de formation d'image dépend également de la r travailange du scanner piézoélectrique. S'il vous plaît consulter le manuel de l'instrument pour cela.
   6. Comme bicouches sont très fragiles, régler le point de la pointe AFM de jeu lors de l'imagerie de garder la force au minimum et corriger la dérive thermique, tout en maintenant le contact avec l'échantillon. En mode de contact, de minimiser le point de consigne. En mode tapping, maximiser le point de consigne.
   7. Traiter les images en ajustant chaque ligne de balayage à des fonctions de mise à niveau de polynômes. Effectue la suppression de la ligne pour les scans qui perdent contact avec la membrane en utilisant le logiciel propriétaire de l'entreprise de fabrication de l'AFM.
2. Spectroscopie de force
   1. Calibrer le cantilever en suivant les instructions selon le protocole du fabricant. L'étalonnage permet la conversion du signal électrique des photodiodes de force (Figure 1B).
      1. Calibrer la sensibilité de la pointe pour mesurer la déviation que le mouvement z-piézo (en unités de longueur) à la place du signal électrique en volts.
         Remarque: AFM détecte les variations de la déviation du cantilever l'aide d'un laser réfléchi à l'arrière du cantilever. Le laser atteint une photodiode qui peut spatialement détecter la position de la tache laser. Une modification de la déviation du cantilever tel qu'il se plie lors d'un contact avec l'échantillon est détectée par la photodiode en tant que cette "déviation verticale", ce qui est dans les unités de tension. Étant donné que le cantilever est proposé par l'élément piézo-z, la déviation verticale est en relation avec le mouvement dans la piézo-z. Le rapport entre la déviation verticale et z-mouvement est appelé la sensibilité et la conversion de la tension à la distance.
      2. Calculer la constante de ressort en porte à faux en utilisant la méthode de fréquence de bruit thermique, habituellement incorporé dans le logiciel de l'AFM. Dans ce procédé, tracer l'amplitude de vibration de bruit par rapport à la fréquence d'oscillation, la création d'un diagramme de densité spectrale de puissance. Cette parcelle se montrer un pic autour de la fréquence de résonance. La fréquence où l'amplitude is la plus grande est la fréquence de résonance. Monter une fonction lorentzienne autour du pic de calculer automatiquement la constante de rappel par le logiciel. Certaines des ressources utiles pour la théorie de la méthode de bruit thermique sont données dans les références ^27-30.
   2. Après imager une zone de la bicouche, sélectionner une région de 5 x 5 pm pm dans la bicouche à effectuer la spectroscopie de force.
   3. Mettre en place l'AFM afin qu'il prenne courbes de force dans une grille de cette région 16 x 16. Cela se traduit par 256 courbes de force par région. L'espace entre deux points voisins devrait être suffisant pour éviter que la surface de la membrane est sondée par un point coïnciderait avec le point suivant. Cela dépend sur le rayon de la pointe. Une distance de 100 nm entre deux points serait idéal. Diviser la région x 5 pm 5 pm en 16 x 16 grille. Selon la taille de la phase, on peut sélectionner une région plus ou moins grande, et ensuite ajuster la taille de la grille en conséquence.
   4. Ensemble piézo-z de déplacement400 nm. Cela détermine la portée maximale de mouvement de la z-piézo. Il devrait être assez grand pour faire en sorte que le cantilever a complètement rétractée loin de l'échantillon entre les deux mesures.
   5. Réglez la vitesse d'approche de 800 nm / s et se rétracter vitesse à 200 nm / sec. Utiliser une vitesse d'approche entre 400 à 6000 nm / s en fonction de la composition de la bicouche lipidique et de la phase à étudier ^6,16.
   6. Après la mise en place de tous les paramètres, acquérir courbes de force, en appuyant sur le bouton "run" du logiciel de l'AFM.
   7. Enregistrer courbes de force que la force en fonction des courbes de hauteur (une mesure de mouvement z-piézo). Ceci ne tient pas compte de la flexion de la poutre lors du contact avec l'échantillon. Lors de l'étape de traitement de données, le logiciel de l'AFM permet correction pour cantilever pliage pour obtenir la force en fonction des courbes de séparation pointe de l'échantillon (figure 1C), ce qui donnera des valeurs correctes pour l'épaisseur de la bicouche. Les valeurs de correction sont habituellement incorporés dans le calibration, qui est enregistré avec chaque courbe de force. Calculer la séparation pointe-échantillon en soustrayant la déviation verticale du mouvement piézoélectrique à un moment donné.
      Remarque: Le pic de la courbe de force d'approche (la valeur de la force descend même si le mouvement en porte à faux est toujours sur le cycle d'approche) est la force de rupture de la membrane, tandis que la différence entre la position de ce pic et la position du point où la force commence à se lever à nouveau fournit l'épaisseur de la membrane.
   8. Acquérir au moins 500 courbes de force pour chaque condition d'obtenir de bonnes statistiques. Tracer un histogramme des valeurs en utilisant des programmes comme origine ou de MatLab, et monter les histogrammes pour une distribution gaussienne pour obtenir le pic et la largeur de la distribution.

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Résultats

Bicouches lipidiques supportées composées de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été imagées en AFM (Figure 2 AC). En raison de la composition des lipides, SM / Chol-riche et DOPC L _o L _d riches en phases ont été observés. Le profil de hauteur de l'imagerie AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane. En regardant le profil de hauteur, l'épaisseur de la bicouche peut être mesurée en présence de défauts dans la membrane (figure...

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Discussion

SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L _D et L _o phases. La phase L _o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de ¹¹ _Ld. La séparation de la L _o L _d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200