Génération de locaux Oscillations CA1 de γ par Tetanic Stimulation

Résumé

Oscillations sont propriétés de réseau fondamentaux et sont modulés par la maladie et les médicaments. Etudier oscillations cerveau tranche permet la caractérisation des réseaux isolés dans des conditions contrôlées. Les protocoles sont prévus pour la préparation des tranches de cerveau aigus pour évoquer CA1 oscillations γ.

Résumé

Oscillations de réseau neuronal sont des caractéristiques importantes de l'activité cérébrale dans la santé et la maladie et peuvent être modulées par une gamme de médicaments utilisés en clinique. Un protocole est prévu pour générer un modèle pour l'étude des oscillations CA1 de γ (20 - 80 Hz). Ces oscillations γ sont stables pendant au moins 30 min et dépendent de l'activité synaptique excitatrice et inhibitrice en plus de l'activation du courant de stimulateur cardiaque. Oscillations Tetanically stimulées ont un certain nombre de caractéristiques reproductibles et facilement quantifiables, y compris nombre de pic, la durée d'oscillation, la latence et la fréquence ce rapport sur l'état du réseau. Les avantages des oscillations stimulées électriquement comprennent la stabilité, la reproductibilité et l'acquisition épisodique robuste permettant caractérisation de la fonction du réseau. Ce modèle de CA1 oscillations γ peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et d'enquêter systématiquement la façon dont l'activité neuronale réseau est altérée dans la maladie et par la drogue.Pharmacologie état pathologique peut être facilement incorporé par l'utilisation de tranches de cerveau de modèles animaux génétiquement modifiés ou interventionnelles pour permettre la sélection de médicaments qui ciblent spécifiquement les mécanismes de la maladie.

Introduction

oscillations du réseau de réflexion se produisent à l'intérieur de bandes de fréquences distinctes qui sont en corrélation à états comportementaux. Chez les rongeurs, les oscillations θ hippocampe (5 - 10 Hz) sont observées durant les comportements exploratoires ^1,2, tandis que les oscillations γ (20 - 80 Hz) associé avec divers processus cognitifs, y compris la perception et de l'attention ^3,4. L'activité du réseau synchrone de γ est également impliqué dans la pathologie de maladies telles que l'épilepsie et la schizophrénie ^5,6. Par exemple, les oscillations γ sont pensés pour correspondre à des zones de foyers épileptiques ^5,7,8 cortical et pourraient être utilisés comme marqueurs de résistance ou pharmacosensitivity, deux aspects importants de recherche dans la recherche sur l'épilepsie ^9.

La tranche de cerveau hippocampique est un modèle qui a été largement utilisé pour étudier l'activité du réseau ^10-12. Divers protocoles ont été développés pour produire des oscillations γ dans des tranches de cerveau qui typiquement involve modulation pharmacologique tels que la faible Mg ^2+, 4-aminopyridine (4AP), bicuculline, et de l'acide kaïnique ^12-17. Les lacunes des oscillations pharmacologiquement déclenchées sont qu'ils se produisent au hasard après l'application de la drogue et ne sont pas générés de manière fiable ou stable dans le temps. Γ oscillations déclenchées électriquement surmonter un grand nombre de ces problèmes et ont également l'avantage d'être temporairement verrouillée à l'événement stimulant permettant l'enregistrement et l'analyse épisodique. Voici un protocole est décrit pour produire des oscillations CA1 de γ en offrant une stimulation tétanique aux oriens strate dans la tranche de l'hippocampe.

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Protocole

Toutes les expériences sur des souris ont été approuvés par le comité d'éthique animale Florey Institute.

1. Configuration pour coupe tranches de cerveau

1. Préparer une solution de découpe composé de (mM) 125 Choline-Cl, 2,5 KCl, 0,4 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 D-glucose saturé avec du gaz carbogène (95% O ₂ -5 % de CO ₂₎ et un liquide céphalo-rachidien artificiel (solution aCSF) d'enregistrement constituée de (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl _2, 2 de _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 10 le D-glucose, saturé avec carbogène. Placer la solution de coupe sur la glace pour le garder froid.
2. Congeler environ 400 ml de la solution de découpe et mélanger avec 100 ml de solution de découpe non gelée pour créer une bouillie de glace. Bubble avec du carbogène (95% O ₂ -5% CO ₂₎ à un débit d'environ 0,5 l / min, par la petite cAliber tube ou en verre fritté pour produire un flux constant mais doux de bulles.
3. Préparer un bécher de 250 ml avec un insert en nylon à mailles en relief sur lequel les tranches de cerveau seront placés. Remplir avec aCSF pour couvrir la maille d'environ 2 cm et bulle avec carbogène, veiller à ce que les bulles ne perturbent pas directement la zone de la tranche de maintien. Il est également important qu'il n'y ait pas de bulles d'air dans le filet de nylon, donc si tout sont présents les supprimer. Ce sera la chambre de retenue et est conservé à température ambiante (20-25 ° C).
4. Disposition des instruments de dissection, y compris une grande paire de ciseaux, une petite paire de ciseaux, petits et grands micro spatules, et les grandes et les petites paires de pinces et chill sur la glace. Placez le bloc de tissu coupe-vibratome sur la glace sur un carré de papier d'aluminium. Obtenir deux morceaux de 6 cm de papier filtre, une seule lame de rasoir bord, et un bécher de 25 ml remplie de la solution de bouillie de coupe aussi bien.
5. Remplissez un deuxième récipient avec de la glace, et de jeter un morceau de bouillie de tissuser sur la glace et placer une boîte de culture de 12 cm sur le dessus. Remplissez la boîte de culture avec le découpage solution coulis de glace et bulle avec carbogène. Ceci est le conteneur dans lequel la dissection du cerveau avec être effectuée.
6. Préparer le vibratome. Retirer une double lame de rasoir tranchant frais (utiliser une nouvelle lame à chaque fois) de son emballage et l'asperger d'éthanol à 80% d'eau déminéralisée puis. Coupez un 3 ml en plastique pipette de transfert au moment où il commence à diminuer. Ceci sera utilisé pour transférer des tranches de cerveau. Bend une aiguille 27 G à la base d'environ 45 ° et l'attacher à une seringue de 1 ml. Il sera utilisé pour manipuler les tranches pendant la coupe.

2. Couper les tranches du cerveau

1. Anesthésier une souris (P16 - P18) avec 2% d'isoflurane ou une méthode approuvée localement. Après induction, décapiter l'animal avec une grande paire de ciseaux et déposer la tête dans la boîte de culture de 12 cm qui contient à bulles solution de découpe suspension. La suspension doit immerger totalement la tête pourrefroidissement rapide.
2. Tenez le devant de la tête avec une main éplucher la peau et du tissu conjonctif de l'avant vers le nez. En utilisant les petits ciseaux couper le tissu conjonctif de révéler le crâne sous-jacent. Ensuite, retirer les muscles du dessus face dorsale du crâne et du cou.
3. Retirer le cerveau du crâne en protégeant d'abord l'avant du crâne avec les grandes pinces, puis faire deux coupes latérales à travers l'os de chaque côté du trou occipital en utilisant les petits ciseaux (Figure 1, coupes marquées A1 et A2).
   1. Faire une autre coupe entre les yeux (juste antérieure du bregma) (Figure 1, coupe marqué B), puis découpez soigneusement le long de la suture sagittale avant et refléter les sections du crâne de coupe pour révéler le cerveau (Figure 1, coupe C marqué).
   2. Utilisez la petite spatule pour évider le cerveau et le lieu sur une boîte de culture. Soyez conscient du cranial nerfs sur la face inférieure du cerveau qui devront être coupés, ce qui peut être fait en utilisant le micro spatule de plus petite taille. Utilisation de la spatule grandes transférer le cerveau pour le 25 ml bécher rempli avec la suspension de solution de découpe.
4. Préparation de l'hémisphère du cerveau pour le tranchage.
   1. Placer un morceau de papier filtre de 6 cm dans le fond d'un plat de culture frais puis de remplir avec des produits frais bouillie de solution de découpe et de la bulle. Utilisez la plus grande spatule pour positionner le cerveau, face ventrale vers le bas, sur le papier filtre. Prenez une nouvelle lame de rasoir et nettoyé de bord unique et couper le cerveau pour éliminer le cervelet, puis faire une coupe le long de la ligne médiane pour séparer le cerveau en deux hémisphères.
5. Préparation du bloc de tissu vibratome.
   1. Prenez le bloc de tissu vibratome réfrigérés, sécher la surface, et déposer une goutte de colle cyanoacrylate dans le milieu et répartir uniformément à la taille approximative du cerveau. Utilisez la petite spatule pour manipuler l'un deshémisphères cérébraux sur la grande spatule micro de sorte que le côté médial du cerveau est en panne.
   2. Appuyez sur le bord de la spatule à l'interface entre le cerveau sur le deuxième morceau de papier filtre pour retirer autant de solution que possible. Faites glisser le cerveau hors de la spatule plus importantes en utilisant la plus petite spatule pour le guider sur la colle.
   3. Fixez le bloc de coupe dans la chambre de vibratome et remplir la chambre avec une solution de coupe boue et de la bulle, en assurant le cerveau est complètement immergé. Tourner le bloc de coupe de sorte que la face ventrale du cerveau est confronté à la lame.
6. Trancher le cerveau.
   Remarque: Chaque vibratome est unique afin de suivre les instructions du fabricant.
   1. Réglez l'épaisseur de coupe à 450 um, et de veiller à la lame vibre comme il se déplace à travers le cerveau à une vitesse d'environ 0,3 mm / s. Couper entièrement par le cerveau de la face ventrale de la surface corticale, ce qui produira cérébrales sagittales entiers qui peuvent be utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques. Tranches seront produites dehors en dedans et typiquement 3 - 4 tranches peuvent être coupés de chaque hémisphère.
   2. Si la base de la tranche ascenseurs utiliser la pente 27 G aiguille légère pression vers le bas de la tranche. Comme chaque tranche est coupée, utiliser la pipette de transfert pour le déplacer sur la plate-forme dans la chambre de retenue où ils sont viables pour jusqu'à 8 heures.

3. extracellulaires électrophysiologie Recordings

1. Montage de la tranche dans la chambre d'enregistrement.
   1. Utilisation de la pipette de transfert, placer une tranche de cerveau dans une chambre d'enregistrement submergée perfusé avec aCSF circulant à 1 - 2 ml / min et chauffé à 32 ° C. Le aCSF utilisé pour des enregistrements diffère de celle dans la chambre de retenue lorsque la concentration de Mg2 ⁺ est augmentée de 2 mM à 4 mM.
   2. Fixez la tranche avec un "harpe" (en acier inoxydable semi-circulaire avec des brins de nylon tendus à travers à 2 - espacement de 3 mm). Endroitla harpe de sorte que les brins sont parallèles à CA1. Augmenter la vitesse de la perfusion de 8 à 10 ml / min à 32 ° C.
2. Sous un microscope de dissection lieu d'une électrode de stimulation et une électrode d'enregistrement (électrode de verre rempli avec la solution d'enregistrement ACSF) sur la surface du stratum radiatum de CA1 (figure 2A). Placez la première électrode de stimulation puis placer l'électrode d'enregistrement.
3. Stimuler l'Schaffer collatéraux avec un 120 - 150 uA amplitude et 0,1 impulsion de test de msec et d'observer le champ de post synaptique excitateur forme d'onde de potentiel (fEPSP) résultant de déterminer la santé de tranche (figure 2B). Peuvent avoir besoin d'être déplacé dans la tranche d'environ 50 Les électrodes de stimulation et d'enregistrement - 100 um de la surface de la tranche d'obtenir l'enregistrement d'un fEPSP avec une petite volée de fibres et de grande amplitude. La garantie Schaffer évoqué fEPSPs sont stéréotypées et fournissent un bon indicateur de la santé de la tranche. Healthy tranches montrent typiquement une volée de fibres de fEPSP rapport d'amplitude inférieure à 0,3.
4. Repositionnement des électrodes.
   1. En utilisant un microscope de dissection, de déplacer l'électrode de stimulation au coeur des stratum oriens et déplacer l'électrode d'enregistrement à la couche de cellules pyramidales étant proche de l'électrode d'enregistrement possible comme le montre la figure 3A. Peuvent avoir besoin d'être poussé dans la tranche d'environ 50 Les électrodes de stimulation et d'enregistrement - 100 pm de sorte que la réponse en amplitude à la fEPSP 120 - impulsion de test de 150 uA est d'environ 1 mV.
5. Génération d'oscillations γ.
   1. Pour générer des oscillations γ stimulent le tissu avec un train de 20 x 0,1 ms impulsions livrées à 200 Hz. Cette stimulation tétanique peut donner des réponses reproductibles lors de la livraison toutes les 5 min.
6. Utilisez les paramètres d'enregistrement suivants.
   1. Echelle le gain du signal de sortie pour correspondre à la plage de tension d'entrée dele convertisseur analogique-numérique. Assurez-vous que l'excursion maximale attendue de signal utilise un minimum de 30% de la plage de tension d'entrée. Soyez prudent lors de la mise à gains élevés que les signaux pourraient couper. La bande passante typique nécessaire pour les enregistrements sur le terrain est de 500 Hz avec couplage AC à 0,1 Hz pour éliminer la dérive de base.
   2. Numérisez au moins 4 - 5 fois plus rapide que la fréquence de coupure du filtre passe-bas pour éviter le signal aliasing.
7. L'analyse des données.
   1. Données de filtre passe-haut à 5 Hz pour éliminer toutes les équipes de base. Identifier des pointes à l'aide d'un seuil dérivé, avec une distance minimale de l'événement de 10 ms, un temps d'événement caractéristique à pic et l'intervalle de régression de 7 ms, un seuil de ~ 100 mV / msec, et une vallée de séparation de 100%. Calculer latence comme le temps nécessaire pour que le premier pic identifié de se produire après la fin de l'artefact de stimulation. Cette analyse permet la caractérisation du nombre de pointes, latence, intervalle inter-événement et de la durée calculée commesuit:
   2. Calculer le nombre de pointes que le nombre total de pointes par oscillation pour chaque balayage est déterminé.
   3. Calculer le temps de latence d'oscillation. Pour chaque oscillation, soustraire le temps du premier pic identifié à partir de la fin de l'artefact de stimulation.
   4. Calculer l'intervalle inter-événement moyenne (ISI). Déterminer la période de temps entre de multiples pics détectés et moyenne.
   5. Calculer la durée d'oscillation. Mesurer le temps entre le premier et le dernier pic détecté au sein de chaque oscillation.

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Résultats

Stimulation tétanique des stratum oriens généré robustes et reproductibles oscillations γ (35,4 ± 2,2 Hz), voir la figure 3B. Pour démontrer que les oscillations ont été générés au sein du réseau de CA1 locale les entrées de CA3 ont été sectionnés en coupant la tranche dans la région de CA2 utilisant une aiguille 32 G plié. Les propriétés d'oscillation dans les tranches coupées ne diffèrent pas des tranches bruts (p = 0,85; tranches coupées 6,16 ± 1,1 de pointes, n = 6; tran...

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Discussion

Une méthode robuste pour générer CA1 oscillations γ dans des tranches de cerveau aiguë est décrite. Les oscillations générées proviennent d'un circuit local permettant une meilleure occasion pour le contrôle et la compréhension de la base neurophysiologique des oscillations du réseau ^12. Récepteurs AMPA, récepteurs GABA _A, I _h et T de type Ca ²⁺ canaux sont tous tenus pour oscillations γ dans ce modèle. Alors que les oscillations CA1 locales décrites ici p...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)	Sigma-Aldrich	Z3777
Biuculline	Sigma-Aldrich	14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)	Sigma-Aldrich	C127
Nickel	Sigma-Aldrich	266965
Carbamazepine	Sigma-Aldrich	C4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)	Tocris Bioscience	0105
Retigabine	ChemPacific	150812-12-7
Choline-Cl	Sigma-Aldrich	C1879-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-250G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 • 2H2O	Sigma-Aldrich	223506-500G
MgCl2 • 6H2O	Sigma-Aldrich	M2670-500G
Electrode glass	Harvard Apparatus	GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode	FHC	CBBPF75
Digital Isolator	Getting Instruments	Model BJN8-9V1
Model 1800 amplifier	A-M systems	Model 1800 amplifier
Digitizer	National Intruments	NI USB-6211
Vibrotome	Leica	VT1200s