Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

Résumé

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Résumé

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Introduction

Pour les applications de thérapie génique, il est d'une grande importance pour éviter des effets secondaires cytotoxiques et immunogènes causées par expression de protéines virales, le transgène lui-même ou par des protéines virales entrants. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont largement utilisés pour introduire un ADN étranger dans une grande variété de cellules pour étudier l'impact de l'expression du transgène ^1,2. La version la plus avancée de AdV est représentée par des vecteurs adénoviraux à grande capacité (HCAdV) dépourvues de toutes les séquences virales codantes ^3,4 et offrant ainsi une capacité de conditionnement jusqu'à 35 kb combinées à une faible immunogénicité et une faible toxicité ^8.5. En raison de leur capacité de conditionnement de haute ils permettent la livraison de grandes ou plusieurs transgènes en utilisant une dose de vecteur unique. Par conséquent, ils représentent un outil précieux pour la communauté de recherche.

Contrairement au premier ou au deuxième génération AdV dépourvu des gènes précoces E1 et / ou E3 qui peuvent être facilement produites en utilisant des kits commerciaux, vector construction du génome du virus et la production de HCAdV est plus complexe. Le système pour la construction de génomes HCAdV est basé sur la pAdFTC plasmidique portant un génome de HCAdV dépourvu de toutes les séquences codantes virales et le plasmide navette PHM5 ^12/09. Tout gène d'intérêt allant jusqu'à 14 kilo bases (kb) peut être cloné dans le PHM5 vecteur navette dans lequel le site de clonage multiple est flanquée par la reconnaissance / sites de clivage des endonucléases homing PI Sce I et I-Ceu I. Par conséquent, un gène clone intéressant peut être libéré par consécutive PI- Sce I et I-Ceu I digère pour l'insertion ultérieure réalisé dans les mêmes sites de restriction présents dans le génome de HCAdV contenu dans le plasmide pAdFTC. Dans pAdFTC le site d'insertion du transgène situé entre la PI-Sce I et I-Ceu I est flanquée de sites de clivage par stuffer ADN et les séquences non codantes adénovirales nécessaires pour l'emballage du génome de telles répétitions terminales en 5 'et 3' inversées (ITR)aux deux extrémités et le signal de conditionnement en aval de la 5'ITR. L'ADN stuffer supplémentaire fournit une taille optimale du génome de HCAdV finale allant de 27 à 36 kb pour assurer l'emballage pendant la production efficace de virus. Depuis pAdFTC est un grand plasmide avec un maximum de 45 kb (en fonction de la taille du transgène inséré) et l'utilisation d'endonucléases de homing avec des sites de reconnaissance d'ADN longues comparable présente une forte liaison à l'ADN, plusieurs étapes de nettoyage sont nécessaires au cours du transfert du transgène à partir de PHM5 à pAdFTC. Une manipulation soigneuse évitant des forces de cisaillement est recommandé.

Les ITR du génome de HCAdV sont flanquées par Not I sites de reconnaissance d'enzymes de restriction situés directement en amont de la 5'ITR et en aval de la 3'ITR ^12. Par conséquent, HCAdV peut être libérée par digestion par Not I pour la transfection ultérieure du génome viral dans la lignée cellulaire productrice de HCAdV. On notera que l'utilisation de l'enzyme de restriction Not I pour relfacilité du génome viral à partir du plasmide pAdFTC implique que le transgène inséré est dépourvue de sites de reconnaissance Not I ADN. Les cellules productrices à base de cellules HEK293 (116 cellules) expriment de façon stable la recombinase Cre. Pour l'amplification du virus 116 cellules sont co-infectées par un virus auxiliaire (HV) fournissant tous les gènes nécessaires à la réplication AdV et de l'emballage en trans ^3,4. Le HT est un AdV de première génération avec un signal d'emballage floxé qui est éliminé au cours de l'amplification par virus recombinase Cre exprimée dans des cellules 116 ^4. Cela garantit que les génomes principalement HCAdV contenant un signal d'emballage intact sont encapsidés.

Pré-amplification de la HCAdV est réalisée en effectuant des étapes de 116 passages en série dans des cellules cultivées sur des surfaces dans des boîtes de culture tissulaire. Après chaque passage des particules virales sont libérées à partir de cellules infectées en effectuant trois étapes de congélation-décongélation successifs. Avec chaque passage du nombre de cellules de plus en plus sont infectées par le3.1 du lysat cellulaire à partir du passage précédent. Enfin lysat provenant de la dernière étape de pré-amplification est utilisé pour infecter des cellules productrices cultivées en suspension dans une fiole centrifuge de grande amplification de l'échelle. Les virions sont purifiés à partir des cellules en suspension en procédant à une ultracentrifugation à une densité de chlorure de césium ^4,12 gradient. Avec cette procédure, les particules et les particules vides entièrement assemblés sont séparés en deux bandes distinctes. Pour concentrer davantage le HCAdV particules d'une deuxième étape d'ultracentrifugation non progressive est effectuée. Par la suite la bande résultant contenant le HCAdV est recueillie et dialysée contre un tampon physiologique. Préparations de vecteurs finales sont caractérisées par rapport au nombre de particules virales infectieuses absolus, les particules et les niveaux de contamination HV. Particules virales absolue peut être déterminée par la lyse des particules virales et la mesure de l'absorbance à 260 nm ou en effectuant quantitative PCR en temps réel (qPCR) ^12. Infectivité du purified particules virales peuvent être déterminées par qPCR HCAdV génomes de mesure présentes dans les cellules infectées par 3 h après l'infection.

Protocole

1. Construction d'recombinant HCAdV génomes basée sur le plasmide pAdFTC

Remarque: Tous les plasmides ont été décrits précédemment ^11,12 et sont disponibles sur demande. La procédure de clonage est représentée schématiquement sur ​​la figure 1.

1. Cloner un gène d'intérêt (GOI) y compris le promoteur et signal de polyadénylation (pA) dans le plasmide navette PHM5, en utilisant une stratégie de clonage de choix, pour générer PHM5-GOI.
   Remarque: Comme pAdFTC est relativement grand plasmide, les protocoles de préparation de plasmide classique est recommandé d'éviter la tonte de l'ADN plasmidique en utilisant des kits de purification de plasmide commerciaux qui sont basés sur des membranes de silice. I- Ceu I et PI -Sce je lie fortement à l'ADN et de modifier la mobilité électrophorétique de l'ADN digéré. Par conséquent, une extraction au phénol-chloroforme et précipitation par EtOH (étape 1.3) est nécessaire avant l'électrophorèse sur gel d'agarose.
2. Digest 20 pg de pHMGOI-5 et 10 pg de pAdFTC par I-Ceul (10 U) pendant 3 heures à 37 ° C dans un volume total de 100 ul de linéariser plasmides (~ 2,8 kb + GOI séquence ORF et ~ 31kb, respectivement).
3. Purifier plasmides linéarisés en utilisant une extraction au phénol-chloroforme suivie par de l'éthanol (EtOH) ¹³ précipitation.
   1. Ajouter 100 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique et mélanger doucement en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger 2 min à 15000 x g.
   2. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter 20 ul d'acétate de sodium (pH 5, 3 m) et 400 pi de glace froide EtOH (99,8%) et la suspension mélanger énergiquement. Centrifuger pendant 10 min à 15 000 x g.
   3. Retirer le surnageant, ajouter 300 ul de EtOH à 70% et centrifuger pendant 2 minutes à 15 000 x g. Ensuite, retirer le surnageant et culot d'ADN de l'air sec. Dissoudre le culot dans 10 à 20 pi de dH ₂ O. Avez culot d'ADN ne sèche pas trop longtemps, car il sera plus difficile d'obtenir de l'ADN en solution.
4. Digest I-Ceu je -digested PHM5-GOI et pAdFTC plasmide de l'étape 1.3) pendant au moins 3 heures ou O / N avec l'enzyme de restriction PI -Sce I (10 U) à 37 ° C dans un volume total de 50 pi et purifier la suite, je -CeuI et PI -Sce je digérés plasmides en utilisant extraction au phénol-chloroforme suivie par une précipitation par EtOH (voir l'étape 1.3). Dissoudre l'ADN dans 20 ul de nuclease libre dH _{2 O.}
5. Séparée squelette plasmidique PHM5 (2,8 kb) et les pouvoirs publics indiens (de l'étape 1.4) sur un gel d'agarose préparatif et de gel-purifient les pouvoirs publics indiens en utilisant un gel-commercial et PCR kit de nettoyage. Un gel d'agarose représentant de la digestion est montré dans la figure 2A.
6. Déphosphoryler I- Ceu I et PI -Sce I-digéré pAdFTC (de l'étape 1.4) avec la phosphatase alcaline intestinale de veau CIP (10 U) pendant 1 heure à 37 ° C dans un volume total de 25 ul et on purifie le plasmide déphosphorylé pAdFTC par extraction au phénol-chloroforme et de l'EtOH ultérieur precipitation (étape 1.3). Eluer ADN dans 20 ul de nuclease libre dH _{2 O.}
7. Effectuer l'électrophorèse sur gel analytique à partir d'un aliquote du plasmide déphosphorylé de pAdFTC (de l'étape 1.6) et le GOI-fragment purifié (provenant de l'étape 1.5) d'analyser si les digestions sont complets et les tailles des fragments attendus sont corrects (~ 31 kb pour pAdFTC linéarisé ).
   Remarque: La taille du GOI est variable en fonction de la taille de la cassette d'expression du transgène. Estimer les concentrations relatives des fragments respectifs pour ligature ultérieure. Un gel d'agarose de fragments purifiés représentatif est montré sur la figure 2B.
8. Mettre en place la réaction de ligature dans un volume total de 20 ul en utilisant 400 U d'ADN ligase T4 et un rapport molaire du vecteur d'insérer de 1: 3.
   NOTE: En concordance avec le gel d'agarose montre la figure 2B on ligaturer généralement dans un volume total de 20 ul avec de 2 à 6 vecteur-pi, 12 pi de 8 àinsérer et 400 U d'ADN ligase T4. Comme la concentration de l'ADN est généralement faible après plusieurs étapes de phénolisation, utiliser autant que possible l'ADN de sorte qu'aucune supplémentaire _de H 2 O doit être ajoutée pour atteindre le volume final de 20 ul. Ligaturer à 16 ° CO / N et ensuite réaliser une extraction phénol-chloroforme suivie par une précipitation par EtOH (étape 1.3).
   1. Eluer ADN dans 15 ul de nuclease libre dH _{2 O} et de digérer la réaction de ligature purifié avec l'enzyme de restriction SwaI (10 U) pendant 2 heures à 25 ° C dans un volume total de 20 ul. Puis concentrer et purifier l'ADN, en effectuant l'extraction phénol-chloroforme suivie par précipitation par EtOH (étape 1.3). Eluer ADN dans 10 ul de nuclease libre dH _{2 O.}
9. Transformer 2 pi de la Swa purifié digéré produit de ligature par électroporation dans DH10B électrocompétentes E. ou DH5a coli et de sélectionner des clones pour 16 à 24 h à 37 ° C sur LB contenant de l'ampicillinedes plaques (50 mg / ml d'ampicilline). Sélectionner 5- 10 clones et préparer des mini-préparations d'ADN plasmidique en utilisant la lyse alcaline suivie d'une extraction au phénol-chloroforme et précipitation subséquente de l'EtOH (étape 1.3) ^13.
10. Effectuer un recueil analytique de plasmide mini-préparations suivis par électrophorèse sur gel d'agarose pour vérifier la taille des fragments d'ADN. Des enzymes de restriction sont suggérées par exemple I- Ceu I et PI- Sce I libérer l'insert Spe I ou HincII (figure 2C).
11. Amplifier un clone correct dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (50 mg / ml d'ampicilline) et effectuer une préparation Midi ou maxi-plasmide en utilisant n'importe quel kit de purification de plasmide disponible dans le commerce.

2. La libération de HCAdV-génomes de pAdFTC plasmide et de préamplification HCAdV vecteurs dans le Producteur Cell Line 116

1. Digérer 20 ug du plasmide de production basé pAdFTC adenoviral contenant le clone de l'étape GOI 1,11) dansun volume total de 100 pi en utilisant Not I (20 U) à 37 ° C pendant> 2 h et effectuer une extraction phénol-chloroforme deux fois suivies par précipitation par EtOH. Dissoudre dans 20 à 30 pi dH stérile ₂ O.
2. Vérifier une aliquote de 01:10-GOI-ADN digéré pAdFTC dilué par électrophorèse sur gel. Un fragment de 9 kb pour le squelette plasmidique et, en fonction de la taille du GOI, un deuxième fragment d'ADN codant pour le génome de la HCAdV (granulométrie: 28- 36 kb) est détectable.
   REMARQUE: Un exemple représentatif de la Non je Digest est affiché dans la figure 2D. ADN linéarisé peut être stocké pendant plusieurs jours à 4 ° C ou à -20 ° C pendant plusieurs semaines.
3. Avant de procéder avec le protocole, assurez-vous que le virus auxiliaire AdNG163R-2 a été amplifié ^4.
   Remarque: Les cellules transfectées avec pAdFTC vecteurs dérivés de HCAdV sont des organismes génétiquement modifiés classés comme niveau 2 de biosécurité (BSL-2), s'il vous plaît utiliser le confinement et la manipulation des déchetsmesures, y compris les équipements de protection individuelle, et de travailler sous BSL-2 hottes à flux laminaire.
4. Culture des cellules 116 dans du MEM additionné de milieu de Eagle 10% de FBS et d'hygromycine B (100 ug / ml). Graine passage bas (passage au-dessous de 10) (~ 116 cellules 0,4x 10 ⁶ cellules) dans une boîte de 60 mm pour culture de tissus 1 jour avant la transfection de sorte qu'ils atteignent une confluence de 50 à 80% le jour suivant.
5. Transfecter le génome linéarisé d'HCAdV de l'étape (2.1) dans des cellules 116 en utilisant des méthodes telles que la transfection, phosphate de calcium ou d'autres réactifs de transfection disponibles dans le commerce (Figure 3A). 16- 18 h post-transfection, retirez soigneusement le moyen, ajouter 3 ml de milieu frais (MEM, 5% de FBS) et infecter les cellules avec le HV AdNG163R-2 ⁴ appliquant 5 unités de transduction (TU) par cellule (depuis une confluence de 60 mm boîte de culture de tissu contient ~ 3.2 x 10 ⁶ cellules, ajouter ~ 1,6x 10 ⁷ TU de HV).
   1. Déplacez doucement le plat toutes les 20 min pendant la première heure après l'infection àassurer une répartition égale de la HV. Cultiver les cellules infectées à 37 ° C et 5% de CO _2. Dans le cas de l'efficacité effet amplification de virus cytopathique (CPE) provoquée par la replication du virus (cellules sont arrondies et lâchement fixées ou détachées de la boîte de culture de tissu) est observable 48 h post-infection.If CPE est observé auparavant, le montant de HV doit être réduite. Si CPE commence plus tard, plus virus auxiliaire doit être utilisé.
6. Cellules de récolte, y compris surnageant 48 heures post-infection par rinçage hors les cellules de la boîte de culture en utilisant le milieu de culture. Les cellules qui sont en suspension dans leur milieu de culture sont appelés passage 0 (P0). P0 de Split en deux fractions.
   1. De 0,5 ml des cellules individuelles tournent vers le bas les cellules pendant 3 minutes à 2000 x g et éliminer le milieu de la pastille de cellules, qui est ensuite utilisé pour isoler l'ADN génomique (ADNg) pour l'analyse du processus d'amplification à base de qPCR. Culots cellulaires de conserver à -20 ° C jusqu'à traitement ultérieur.
   2. De 2,5ml des cellules détachées libérer des particules virales par congélation (-80 ° C à ou dans de l'azote liquide) et décongélation (à la température ambiante ou dans un bain d'eau à 37 °) les cellules qui sont dans leur milieu resupended trois à quatre fois. Cette fraction est appelée à lysat de P0.
7. Assurer que les boîtes de culture de tissu avec des cellules 116 qui sont cultivées à 90- 95% de confluence en utilisant MEM-FBS supplémenté avec moyen (10%) et d'hygromycine B (100 ug / ml) et HV sont disponibles pour les étapes suivantes de passages.
8. Mélanger 1 ml de milieu frais (MEM, 5% de FBS) avec 2,5 ml du lysat à partir du passage précédent (étape 2.6.2) jusqu'à un volume final de 3,5 ml, ajouter HV appliquant deux TU par cellule (depuis un tissu de 60 mm boîte de culture à une confluence de 90 à 95% contient ~ 3.2 x 10 ⁶ cellules, ajouter ~ 6,4x 10 ⁶ TU de HV). (Figure 3B). Retirez délicatement le moyen d'une boîte de 60 mm de 116 cellules et ajouter le mélange virale dans les cellules. Répétez l'étape 2.6) - 2.8) deux fois pour obtenir des lysats de passeâges P1 et P2.
9. Mélanger 17,5 ml du milieu frais (MEM, 5% de FBS) avec la 2,5 ml du lysat provenant de P2 et ajouter HV appliquant deux TU par cellule (depuis une boîte de culture tissulaire de 150 mm à une confluence de 80 à 100% contient ~ 2x 10 ⁷ cellules, ajouter ~ 4x 10 ⁷ TU de la HV). Retirer le moyen d'une boîte de 150 mm de 116 cellules et les infecter les cellules avec le mélange viral. Cultiver les cellules infectées à 37 ° C et 5% de CO _2.
10. Cellules de récolte après l'infection 48h comme décrit dans l'étape 2.6) pour obtenir passage P3 (figure 3B).
    1. Répétez l'étape 2.6) 1.
    2. De l'19,5 ml restant de P3 libération des particules virales à partir des cellules resupended par congélation et décongélation à trois à quatre fois. Cette fraction est appelée à lysat de P3.
       Remarque: Certains vecteurs peuvent nécessiter éventuellement passages supplémentaires dans 150 plats mm jusqu'à ce qu'ils soient suffisamment amplifiés. Par conséquent effectivité du processus de pré-amplification doit être surveillée au cours passe de sérievieillissement. qPCR analyse du processus d'amplification en fonction peut être réalisée comme décrit dans l'article 3 (voir aussi la figure 4A). Pré-amplification de HCAdV portant une cassette d'expression pour la protéine fluorescente verte (GFP) peut être facilement évaluée en observant le signal flourecscent GFP en utilisant un microscope à fluorescence (figure 4B).

3. Suivi du processus d'amplification en utilisant quantitative-PCR en temps réel (qPCR) (voir aussi la figure 4A).

1. Isoler à partir de l'ADNg de culots cellulaires chaque passage de la preamplifaction (étapes 2.6) - 2,10) en utilisant n'importe quel kit d'isolement d'ADN du commerce pour l'isolement de cellules cultivées à partir de l'ADNg ou d'une autre méthode de choix. Pour des résultats optimaux PCR utiliser gDNA aussi frais que possible. Sinon ADNg peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
2. Pour déterminer le nombre de génomes de HCAdV présent dans les cellules du passage respectif par analyse qPCR générer une courbe standard en utilisant 10 ^{1 <}/ sup> - 10 ⁹ copies d'un plasmide portant le GOI contenues dans le génome du HCAdV.
3. Analyser la même quantité d'ADNg de P0- P3 (étape 2.6- 2.10) appliquer qPCR utilisant 400 nM d'amorces spécifiques pour les pouvoirs publics indiens contenues dans le génome de HCAdV. Pour mener les instructions de produits chimiques qPCR respectifs de qPCR fabricant de suivi. Régler le programme qPCR comme suit: pré-incubation à 95 ° C pendant 10 min, l'amplification en 40 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 55 à 60 ° C pendant 15 s et 72 ° C pendant 20 s. Sur la base de la courbe standard du nombre de génomes de HCAdV dans la réaction peut être interpolée.

4. Grande Echelle Amplification de HCAdV vecteurs dans 116 cellules se développant en suspension

1. Ajouter 900 ml d'préchauffé (37 ° C) frais MEM additionné de 10% de FBS et l'hygromycine B (100 ug / ml) dans un ballon de 3 litres de culture centrifuge (figure 3B).
2. Retirer moyen d'au moins 10 150 mm individuels des boîtes de culture de tissu avec une16 cellules cultivées à une confluence de 90 à 100% et déverser hors des cellules avec 10 ml de frais préchauffé (37 ° C) MEM additionné de FBS (10%) et à l'hygromycine B (100 ug / ml) en utilisant une pipette sérologique. Pipette monter et descendre plusieurs fois pour obtenir une suspension de cellules homogène. Transférer les cellules directement dans la fiole centrifuge contenant déjà 900 ml de l'étape 4.1).
   Note: Ne pas utiliser la trypsine / EDTA comme cela peut affecter négativement la croissance des cellules en suspension. Après élimination du milieu des cellules transférer immédiatement dans la fiole centrifuge. Ne pas traiter plus de deux boîtes de culture de tissus à la fois. Plus le temps d'attente après l'ajout de milieu frais plus il sera difficile pour les cellules détaché de la boîte de culture de tissu.
3. Pour assurer la croissance cellulaire optimale d'incubation spinner ballon sur un agitateur magnétique dans un incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Régler l'agitateur magnétique à 70 tours par minute afin d'éviter la fixation des cellules sur les surfaces de verre.
4. Surveiller la croissance des cellules en culture ballon spinner d'examiner si les cellules cultivées dans le flacon de culture de filage sont viables et si elles poussent à des quantités suffisantes. A chaque fois avant d'ajouter du milieu frais transfert 2 ml du bioréacteur à une boîte de culture tissulaire de 60 mm. Observer la morphologie des cellules au microscope.
   Note: Les cellules formant des touffes flottant dans le milieu de culture indiquent une croissance optimale et la viabilité (voir aussi la figure 4C). Après 24 heures, ils forment des colonies sur la surface de la boîte de culture tissulaire. 30 à 50% de confluence indique densité optimale.
5. 24 heures après la mise en place du flacon de culture spinner ajouter 500 ml de milieu frais (MEM, 10% de FBS) supplémenté avec hygromycine B (100 ug / ml). 24 h plus tard répéter cette étape.
6. 72 h après la mise en place de la culture centrifuge, ajouter 1000 ml de milieu frais MEM (10% de FBS) avec l'hygromycine B (100 ug / ml) conduisant à un volume total de 3 litres de suspension cellulaire.
7. 24 heures après avoir atteint avolume de trois litres, la récolte 116 cellules en suspension par centrifugation pendant 10 min à 500 g à température ambiante. Jeter le surnageant. Conserver le flacon de culture de filage vide sous le capot de culture de tissu.
8. Resuspendre les culots cellulaires dans du MEM frais supplémenté avec 5% de FBS par aspiration et une baisse d'environ 8 à 10 fois pour obtenir une suspension de cellules homogène. Le volume du milieu dépend du fait que le lysat obtenu à l'étape 2.10) 2. (19,5 ml, voir l'étape 4.8) 1. l'option a) ou d'un stock virale purifiée de HCAdV de l'étape 5.9) 2. (plusieurs ul depanding sur titre viral, voir l'étape 4.8) 2., l'option b) est utilisé pour l'infection des cellules. Utiliser un volume total de 150 ml.
   1. Option a: Pour l'infection de 116 cellules en suspension avec lysat de P3 (amplification primaire) cellules de transfert de l'étape 4.8) pour une bouteille de 250 ml de stockage équipé d'un bar stérile d'agitation magnétique ou 250ml flacon spinner à petite échelle et les cellules avec le co-infecter virus dans le lysat de P3 (étape 2.10.2) et 2 TU de HV par cellule. En supposant une densité de 3 x10 ⁵ cellules par ml, le nombre total de cellules est 9x 10 ⁸ cellules. Ainsi ajouter 1,8x 10 TU ⁹ de la HV.
   2. Option B: Pour l'infection de 116 cellules en suspension avec stock virale purifiée, les cellules de transfert de l'étape 4.8) à une bouteille de stockage de 250 ml équipé d'un bar stérile d'agitation magnétique ou 250ml flacon spinner à petite échelle et de co-infecter les cellules avec les 100 particules virales par cellule de HCAdV anciennement purifié (de l'étape 5.9) 2.). Ainsi ajouter 9x 10 ¹⁰ VP titre selon physique (mesurée par l'absorbance à 260 nm; l'étape 6) de la HCAdV purifiée et 1,8 x 10 ⁹ TU de la HV.
9. On agite le mélange virus-cellule à partir de septembre 4.8.1) ou 4.8.2) dans sur un agitateur magnétique dans l'incubateur de culture de tissu à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 heures à 60 tours par minute. Assurez-vous que la bouteille de stockage est pas complètement fermé pour permettre la circulation de l'air.
10. 2 heures post-infection transférer le volume total du mélange cellule-virus de nouveau dans le 3 l spinner culteballon de ure et ajouter 1850 ml d'préchauffé (37 ° C) MEM milieu frais supplémenté avec 5% de FBS jusqu'à un volume total de 2 L et incuber dans l'incubateur de culture de tissu à 37 ° C et _5% de CO2 pendant 48 heures à 70 tours par minute.
11. Récolte des cellules par centrifugation pendant 10 min à 890x g à la température ambiante dans 500 ml de centrifugation. Tubes Enlever le milieu et remettre en suspension les cellules sédimentées dans un volume total de 28 ml de DPBS. Pipeter haut en bas pour obtenir une suspension de cellules homogène. Geler la suspension cellule-virus dans l'azote liquide ou à -80 ° C en veillant à ce que la suspension est complètement gelé. Stocker la suspension cellule-virus à -80 ° C jusqu'à ce que la purification à partir du virus.

5. Purification et dialyse du HCAdV

1. Pour préparer lysat viral pour le chlorure de césium (CsCl) gradients, geler les cellules-virus suspension de l'étape 4.11) dans de l'azote liquide et dégel dans un bain d'eau à 37 ° C quatre fois.
2. Centrifuger le lysat viral à 500 g pendant 8 min à RT et collecter le surnageant contenant le HCAdV.
3. Pour Ultracentrifugation préparer des solutions de CsCl comme follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / cm ^3), 33,5 g (pour 1,35 g / cm ^3), et 31,25 g (1,25 g / cm ³⁾ de poudre de CsCl, respectivement, et de remplir avec dH _{2 O} à 25 ml.
   1. Stirr jusqu'à solution devient claire et filtre stérile les solutions. Enfin retirer 1 ml de chaque solution et peser sur une échelle fine pour vérifier wether la densité est correcte. 1ml doit peser respectivement 1,5 g, 1,35 et 1,25 g.
   2. Si la densité est trop élevée ajuster par addition progressive de petits volumes (ul) DH stériles ₂ O. Après addition de _dH2Û mesurer à nouveau le densitiy. Si nécessaire, ajouter plus dH ₂ O.
   3. Répétez la procédure jusqu'à ce que la densité est correcte. Si la densité est trop faible ajuster en ajoutant petite quantité de poudre de CsCl. Filtre stérile il vérifier de nouveau et la densité. Si la densité est trop élevée ajuster en Adding dH _{2 O,} comme décrit avant. Si la densité est encore trop faible ajouter mor CsCl, filtre stérile à nouveau et vérifier la densité. Répétez la procédure jusqu'à ce que la densité est correcte.
4. Préparer CsCl gradients d'étape dans six tubes d'ultracentrifugation claires. Soigneusement pipette lentement solutions de CsCl dans les tubes en utilisant l'ordre suivant: 0,5 ml de 1,5 g / cm ³ solution de CsCl, 3 ml de 1,35 g / cm ³ solution de CsCl et 3,5 ml de 1,25 g / cm ³ solution de CsCl (figure 2C) .
5. Overlay ~ 4,5 ml de surnageant de vecteur autorisé de l'étape 5.2) sur le dessus de la g / cm ³ couche CsCl 1,25. Centrifugeuse les gradients dans une ultracentrifugeuse utilisant un swing hors rotor (SW-41) à 12 ° C pendant au moins 2 heures à 226 000 xg (35 000 tours par minute) avec une accélération lente et décélération à HCAdV-génome distinct contenant des particules virales de particules vides et cellulaire débris.
   NOTE: Dans des conditions optimales une bande diffuse des formes de débris de cellules au-dessus deles tubes. Ci-dessous deux bandes blanches peuvent être observées. La bande supérieure contient des particules vides alors que la bande inférieure est égale à la HCAdV (figures 2C et 5A).
6. Retirez délicatement les couches de débris cellulaires et les particules vides et de recueillir 1 ml des bandes inférieures de chaque tube et le virus de transfert avec une pointe de pipette propre dans un tube de 50 ml stérile. Ajouter jusqu'à 24 ml de 1,35 g / cm ³ à une solution de CsCl les particules de virus collectés et mélanger soigneusement.
7. Remplir des tubes de centrifugeuse avec 1,35 g / cm ³ solution de CsCl-virus à l'O supérieure et centrifuger / N (18- 20 h) à 226 000 xg (35 000 rpm) à 12 ° C dans une ultracentrifugeuse utilisant un swing hors rotor (SW-41 ) avec l'accélération et la décélération lente.
8. Recueillir le HCAdV présent dans la bande inférieure proéminente. Comme une bande supérieure potentiel contient des particules vides supprimer couches supérieures de la partie supérieure en utilisant une pipette (voir les figures 2C et 5B) Puis emporter l'usi bande inférieureng d'une pipette.
9. Dialyser les particules de virus prélevés pour l'échange de tampon.
   1. Coupez une bande de tube de dialyse (MWCO: 50.000) d'environ 8 cm de longueur, le laver avec dH _{2 O} stérile trois fois. Puis fermer un côté du tube de dialyse avec une bride en plastique et transférer le virus ont été recueillies à partir de l'étape 5.8) dans la tubulure en utilisant une pipette de 1 ml. Éviter les bulles d'air dans le tube et fermez-le de l'autre côté avec un plastique fermetures pince de dialyse.
   2. Dialyser dans 1 l de tampon de dialyse (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% de glycerol et 1 _mM de MgCl2 dans désionisée _H 2 O) pendant 2 heures à 4 ° Cwith agitation lente. Tampon de dialyse d'échange avec 2 litres de tampon de dialyse et dialyse O / N à 4 ° C sous agitation lente. Vous pouvez également utiliser un sucrosebuffer (140 mM de NaCl, 5 mM Na _{2 HPO 4} x2H _{2 O,} 1,5 mM KH _{2 PO} 4 et 730 mM de saccharose, pH 7,8).
   3. Recueillir des particules virales dialysés de l'étape 5.9) 2. 1 ml en utilisant un pipette. Préparer plusieurs aliquotes de petits volumes souhaités (25 100 pi) et stocker virus purifié à -80 ° C.

6. Le titre de mesure physique de préparations HCAdV finales par densité optique (OD)

1. Diluer 25 ul de la préparation de vecteur final de l'étape 5.9) 2 avec 475 ul de tampon de lyse (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0), 0,5% de SDS)), agiter doucement pendant 20 min à RT et enfin centrifuger 2 min à température ambiante à 15 000 x g.
2. Depuis les valeurs d'absorbance à 260 nm (A260) sont généralement faibles, mesurer l'absorbance quatre fois en utilisant 100 pi du surnageant et calculer la valeur moyenne des quatre mesures. Calculer le nombre de particules virales par ml (vp / ml ^-1) selon la formule suivante: VP / ml ^{-1 =} (A260 moyenne) x (20) x (1,1 x 10 ¹²⁾ x (36 kb / taille du HCAdV en kb ).
   Note: Les résultats d'un rendement typique de particules virales absolus (OD) de titre sont représentées sur la figure 7A . L'expérience montre que le titre d'OD surestime le nombre de particules virales. Particules virales absolue mesurée par OD peuvent être de 20 à 100 fois supérieur à celui des particules virales infectieuses mesurés par Q-PCR. Pour une mesure plus précise de particules de HCAdV absolte et infectieuses ainsi que la contamination HV par Q-PCR se référer au chapitre 7.

7. Mesurer particules totales, unités infectieuses de l'HCAdV et niveaux HV contamination dans le Vector Préparation finale par qPCR. Un schéma de la procédure de titrage est illustré à la figure 6

1. Semences dans des cellules HEK293 6 ou 12 puits des plaques de culture de tissu de sorte que les cellules atteignent une confluence de 90% le jour suivant. Pour déterminer le nombre de particules virales infectieuses (titre infectieux) infecter des cellules d'un puits dans une plaque multi-puits avec 1 ul et un second puits avec 10 ul de virus purifié de l'étape 5.9) 3.
2. Cellules de récolte après l'infection de 3 heures. Retirer moyen et ajouter la trypsine pour couvrir l'ensemble du puits et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 5 min. Rincer les cellules avec de la trypsine l'aide d'une pipette et centrifuger les cellules à 890 xg pendant 3 minutes à température ambiante.
3. Reprendre le culot cellulaire dans 200 ul de DPBS et les laver à fond pour enlever libres (non-infectieux) particules de vecteur. Centrifuger 3 min à 890 g à RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension les culots de cellules dans 200 ul de DPBS frais.
   Remarque: Pour la détermination précise de titre infectieux, il est essentiel d'éliminer toutes les particules virales non infectieuses à partir de la surface des cellules par traitement à la trypsine et lavage complet.
4. Pour déterminer le nombre de particules virales totale (particules infectieux et non infectieux des particules = titre physique), la récolte non-infecté les cellules HEK293 de deux puits sans trypsine par rinçage hors des cellules avec leur milieu de culture à l'aide d'une pipette.
5. Isoler les cellules pendant 3 min à 890 g à RT. Jeter le moyen et remettre en suspension les cellules sous forme de granulés dans 200 ul de DPBS. Suajouter une bsequently ul et 10 ul de la préparation de HCAdV purifié directement aux cellules, respectivement. Utiliser des cellules non infectées comme arrière-plan, pour assurer les mêmes conditions d'isolement et gDNA ultérieure q-PCR.
6. Isoler ADNg de cellules HEK293 dérivées des étapes 7.3) et 7.5)
   1. Les cellules remises en suspension dans Vortex ul de DPBS 200 (étape 7.3 et 7.4) pendant 3 sec, ajouter 200 pi de solution de SDS. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0), 0,5% de SDS) et 20 ul de proteinase K (20 mg / ml) et la suspension vortex pendant 3 sec. 12- Incuber 16 heures à 55 ° C et agiter lentement. Puis ajouter 2 pi de RNAse A (20 mg / ml) et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
   2. Ajouter 350 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique et centrifuger 2 min à 15000 x g. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et répéter cette étape une fois
   3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter 50 ul d'acétate de sodium (pH 5, 3 m) et 1 ml de glace froide EtOH (99,8%) et la suspension mélanger. CentriFuge échantillons pendant 10 min à 15 000 x g pour sédimenter l'ADN génomique.
   4. Ensuite, retirer le surnageant, ajouter 500 pi de EtOH à 70% et centrifuger 2 min à 15000 x g. Retirer le surnageant, ajouter 500 pi de EtOH à 70% et agiter pendant 30 min à température ambiante. Puis centrifuger pendant 2 min à 15 000 x g.
   5. Retirer le surnageant et culot d'ADN de l'air sec. Avez culots d'ADN ne sèches pendant une longue période, car il sera plus difficile d'obtenir ADNg en solution. Remettre en suspension le culot d'ADN dans 120 ul de dH ₂ O et incuber pendant 1 heure à ~ 37 ° C sous agitation. Si la solution d'ADN apparaît visqueux, l'agiter pendant plusieurs heures à 37 ° C, ou incuber à 55 ° C pendant ~ 1 heure.
7. Pour déterminer HCAdV-particules infectieuses et HCAdV-particules absolus, générer une courbe standard de 10 ^{août 1 à 10} copies d'un plasmide portant les pouvoirs publics indiens contenues dans le génome de HCAdV.
8. Déterminer particules totales et les particules infectieuses en analysant les mêmes quantités de ADNg de infectées HEK293 caunes de l'étape 7.3) et 7.4) appliquent qPCR utilisant 400 nM d'amorces spécifiques pour les pouvoirs publics indiens contenues dans le génome de HCAdV.
9. Régler le programme de PCR comme suit: pré-incubation à 95 ° C pendant 10 min, l'amplification en 40 cycles de 95 ° C pendant 10 sec, 55 ° C pendant 10 s et 72 ° C pendant 20 s. Sur la base de la courbe d'étalonnage (étape 7.7), interpoler le nombre total de génomes adénoviraux dans la réaction.
10. Calculer le nombre de génomes adénoviraux dans la préparation de vecteur final en utilisant le formulaire ci suit: (Nombre de HCAdV / poids dans ng d'ADNg dans la réaction) x (poids en ng d'ADN de toutes les cellules dans le plat infecté de virus / volume en pi) .
    NOTE: La gamme typique de particules virales infectieuses absolus et les rendements sont autour de 1x10 à 1x10 ^{7 8} virale particules / ul. Les titres qui sont dix fois supérieur ou inférieur montré ici peuvent être considérées comme normales. Des titres plus élevés seraient une amélioration. En ce qui concerne le rapport de partic absolue de HCAdVles particules infectieuses HCAdV, l'expérience montre qu'environ 5 à 10% de particules de HCAdV absolus sont infectieuse (figure 7A).
11. Pour déterminer les niveaux de contamination avec HV, effectuez qPCR en amplifiant une partie du gène tardif adénoviral 3 (L3) présent dans le génome de la HV. Utilisation d'un plasmide portant le gène tardif adénoviral 3 (L3) afin de générer une courbe d'étalonnage (étape 7.7).
12. Dans cette réaction applique 400 nM des amorces L3 sens 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT LOI CGA GTT GG-3 'et L3 inverse 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' avec 300 nM de la sonde spécifique L3-5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
13. Régler le programme de PCR comme suit: pré-incubation / activation à 95 ° C pendant 10 min, l'amplification pendant 40 cycles de 95 ° C pendant 15 sec et 60 ° C pendant 1 min. Utilisez toute sonde universelle PCR mastermix pour la réaction qPCR. Sur la base de la courbe d'étalonnage (étape 7.7), calculer le nombre d'enHV particules infectieuses dans la préparation de vecteur final. Voir (figure 7A) pour les rendements typiques pour les particules HV.
14. Enfin calculer le rapport de particules infectieuses à HCAdV absolues des niveaux de contamination HV pour évaluer la qualité de la préparation de vecteur.
    Note: Jusqu'à maintenant une petite portion de rester HV ne peut être exclue. Habituellement, le pourcentage de contamination est HV ~ 5% de particules infectieuses ou moins, ce qui est acceptable (figure 7B). Bien sûr, comme moins HV que possible est souhaitable, en particulier si la préparation de vecteur va être utilisé pour les expériences sur les animaux.

Résultats

Voici des exemples représentatifs pour le clonage, l'amplification et la purification des préparations de HCAdV sont présentés. Un aperçu de la stratégie de clonage (Figure 1) et des exemples représentatifs pour le clonage et la libération du génome de HCAdV par digestion de restriction enzyme sont fournis (Figure 2). Un motif de restriction typique après la libération de la cassette GOI-expression de PHM5 par PI Sce I et I-Ce...

Discussion

Le protocole présenté ici permet la purification de vecteurs de HCAdV basés sur l'adénovirus humain de type 5 sur la base de procédures précédemment décrites ^4,12. Le génome du plasmide à l'intérieur HCAdV pAdFTC est dépourvu de tous les gènes adénoviraux et ne porte les 5 'et 3' ITR et le signal d'encapsidation. Dans cette stratégie, le HV AdNG163R-2 ⁴ fournit tous les gènes nécessaires à la production de virus efficace en trans. Cette offre une capac...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C