Génération des solutions évolutives de métal de très haute-Aspect Ratio nanocomposites dans un milieu liquide biologique

Résumé

Ici, nous présentons un protocole à synthétiser de nouveaux, de haute rapport d'aspect biocomposites dans des conditions biologiques et dans des milieux liquides. Les biocomposites échelle du nanomètre au micromètre de diamètre et de la longueur, respectivement. nanoparticules de cuivre (CNPS) et du sulfate de cuivre combinés avec la cystine sont les éléments clés pour la synthèse.

Résumé

L'objectif de ce protocole est de décrire la synthèse de deux nouveaux biocomposites avec des structures de ratio d'aspect élevé-. Les biocomposites sont en cuivre et la cystine, soit avec des nanoparticules de cuivre (CNPS) ou du sulfate de cuivre qui contribue le composant métallique. La synthèse est effectuée dans un liquide dans des conditions biologiques (37 ° C) et la forme des composites auto-assemblées après 24 h. Une fois formés, ces composites sont très stables dans les deux milieux liquides et sous une forme séchée. Les composites échelle du nano aux micro gamme de longueur, et de quelques microns à 25 nm de diamètre. La microscopie électronique à balayage à émission de champ avec une spectroscopie à dispersion d'énergie aux rayons X (EDX) a montré que le soufre était présent dans les structures linéaires NP-dérivés, tandis qu'il est absent de la matière CNP départ, ce qui confirme la cystine en tant que source de soufre dans les nanocomposites finaux . Lors de la synthèse de ces nano et micro-composites linéaires, un large éventail de longueurs de structures est formée dans le récipient de synthèse. La sonication du mélange liquide après la synthèse a été démontrée pour aider à contrôler la taille moyenne des structures en diminuant la longueur moyenne avec l'augmentation du temps de sonication. Étant donné que les structures formées sont très stables, ne pas agglomérer, et sont formées dans la phase liquide, la centrifugation peut également être utilisée pour aider à concentrer et séparer les composites formés.

Introduction

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

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Protocole

1. Planification d'expériences

1. Déterminer le volume de nanocomposites de cuivre nécessaires pour la synthèse. Sur cette base, choisir un certain nombre de petits flacons de volume (25 cm ^2), ou les grands flacons, comme indiqué ci-dessous dans la préparation des matériaux.
2. Pour cette synthèse, en utilisant un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ et au moins 40% d'humidité. Assurez-vous que un tel incubateur est disponible et qu'il ne sera pas perturbé à plusieurs reprises au cours de la période de synthèse (environ 24 h).
   ATTENTION: l'ouverture et la fermeture répétées de l'incubateur va certainement causer des fluctuations de température qui peuvent résulter de la synthèse modifiée des structures nanocomposites.

2. Préparation des matériaux

1. Préparer tous les nouveaux matériaux avant le début d'une expérience, en ajoutant des matériaux solides aux solvants juste avant la synthèse est de commencer. Garder solutions de stockage de matériaux de cystine et de départ de cuivre dans le liquide pour de longues durées bvant l'expérience est déconseillé et peut conduire à des résultats variables. Une fois ouvert auprès du fournisseur, garder les matières sèches en enveloppant le haut du conteneur avec du Parafilm départ.
   Remarque: Le protocole suivant est utilisé comme un exemple de réaction dans un 25 flacon de culture cm ² de cellules en utilisant 7 ul de cystine, 6,643 pi d'eau stérile, et 350 ul de CNPs.
2. Préparer une solution à 2 mg / ml de nanoparticules de cuivre en pesant au moins 2 mg de CNPs. Porter des gants jetables lors de cette étape pour éviter tout risque de contact avec la peau du CNPS. Placez les nanoparticules dans un vide stérile 16 ml flacon en verre.
   1. Pour le flacon contenant CNPS, ajouter de l'eau déminéralisée stérile dans le volume approprié de faire une solution à 2 mg / ml et vortex la solution pendant 20 secondes afin de fournir dispersion des nanoparticules de synthèse commence avant (au moins 1 ml volume total est recommandé). Ne pas remplir le plus de la moitié du flacon avec de l'eau car cela va inhiber le mélange au vortex. CNPs will régler rapidement au fond du flacon et apparaîtra de couleur foncée (gris au noir).
   2. Soniquer la solution CNP pour 17 min à température ambiante pour assurer une dispersion maximale de CNPs avant le début de la synthèse. Vérifiez régulièrement pour vous assurer que CNPs confondez due à ultrasons. Après un traitement par ultrasons succès, CNPs restent en suspension dans la solution pendant au moins 30 min et la solution sera de couleur foncée.
3. Peser une masse suffisante de la cystine pour former une solution / ml de 72,9 mg pour la synthèse. Depuis cystine est pas directement soluble dans l'eau, placez la cystine pesé dans un récipient de pesée antistatique.
   1. Dans le récipient contenant la cystine pesage, ajouter un volume suffisant de, 1 M de NaOH stérile, de sorte que la cystine se dissout complètement. Par exemple, dissoudre 7,29 mg de cystine complètement dans 100 pi de NaOH 1 M, de faire un / ml solution 72,9 mg.
   2. Pour maintenir des conditions stériles, réaliser cette étape dans un tissu d'écoulement culture hotte stérile.
      ATTENTION: NaOHà 1 M concentration est caustique, donc porter des gants jetables lors de cette étape pour éviter le contact de NaOH concentré avec la peau
4. Travailler dans une culture tissulaire hotte stérile, ajouter 7 pi de cystine avec 6643 ul d'eau stérile dans le flacon de synthèse stérile premier, et laisser incuber pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 ° C avec le bouchon de flacon ventilé (en vrac) pour fournir efficace mélange. Reprendre le / ml solution CNP 2 mg par vortex pendant 30 secondes, depuis CNPs aura réglé après l'étape de traitement par ultrasons.
   1. Ajouter CNP solution dans le ballon de synthèse (en utilisant une technique stérile) afin de maintenir les rapports de composants suivants: combiner une cystine parties, 50 parties CNPS, et 949 parties d'eau stérile dans un 25 ^cm2 ballon de culture de cellule pour commencer la synthèse. Par exemple, pour un volume de synthèse 7 ml, mélanger 7 pi de solution cystine boursier, 350 pi du CNPS, et 6643 pi d'eau stérile. Replacez le bouchon sur le flacon et serrer de sorte qu'il est sécure.
   2. Après combinant tous les composants pour la synthèse, mélanger doucement dans le ballon en secouant 4-5 fois. Placer la fiole dans incubateur à CO ₂ et évacuer la fiole en dévissant le bouchon de sorte qu'il y ait un échange de gaz dans et hors de la fiole pendant la synthèse.
5. Laisser la synthèse afin de fonctionner dans l'incubateur pendant environ 24 h. Lors de la synthèse, on peut observer, à la microscopie et à l'oeil, la formation de composites très linéaires.
   Remarque: Le processus de formation des structures peut arriver tout à coup dans le sens que les structures sont d'abord difficile à détecter, puis apparition procède rapidement à une augmentation de la densité. Formation peut donc se produire avant 24 h. Le processus peut également être observée à l'oeil fois que les structures deviennent plus grandes et leur densité augmente. Alors que la génération des structures peut être observée au fil du temps sous le microscope et à l'œil à des moments plus tard, interrompant continuellement les conditions de synthèse et la température va conduire à une mauvaiseles résultats de la synthèse.
6. Mettre fin à la synthèse de biocomposites en coiffant hermétiquement la fiole de synthèse et le stockage du récipient dans un réfrigérateur (4 ° C). Structures, une fois générés, restent stables sous cette forme pendant au moins un an. Etiqueter le flacon avec des conditions de synthèse, y compris les composants utilisés, la date de la synthèse, et le temps d'incubation de la synthèse avant la fin.

3. Synthèse Utilisation de sulfate de cuivre

1. Réaliser la synthèse auto-assemblage en remplaçant CNPs avec du sel de sulfate de cuivre. En utilisant une technique stérile, dissoudre au moins 2 mg de sulfate de cuivre dans un volume suffisant d'eau déminéralisée stérile de faire un / ml, solution à 2 mg. Les cristaux de sulfate de cuivre vont facilement dans la solution à cette concentration, mais Vortex le flacon si nécessaire, et inspectent visuellement à assurer que tous les cristaux sont dissous.
2. Après la préparation du sulfate de cuivre, de réaliser la synthèse comme décrit précédemment, mais en remplaçant CNPs avec le sulfate de cuivre.
   Remarque: nanocomposites auto-assemblées à l'aide de sulfate de cuivre comme matériau de départ ont été trouvés à être beaucoup plus cohérent dans la forme finale que pour des structures synthétisées à partir de PNC.
3. Terminer la synthèse de biocomposites de sulfate de cuivre pour les composites CNP (étape 2.6) et les stocker à long terme à 4 ° C.

4. Caractérisation et la manipulation des Biocomposites post-synthèse

1. Caractériser biocomposites dérivés de CNPs et de sulfate de cuivre par microscopie à lumière blanche ⁹ et par microscopie électronique ^9.
   1. Pour la caractérisation et l'inspection des biocomposites post-synthèse par microscopie de lumière blanche, utiliser un microscope inversé comme composites se déposent à la surface inférieure de la fiole à quelques minutes de la pose du flacon plat, et peuvent ensuite être mis en évidence. Utilisez le réglage de champ clair sur le microscope pour optimiser le contraste entre les biocomposites et le milieu liquide. Composites dérivés de PNC et flicpar sulfate seront tous deux être clair à opaque en couleur, mais agrégats CNP pas réagi apparaît une couleur très sombre.
      1. Utilisation d'un appareil photo numérique connecté au microscope pour capturer des images des composites. Une gamme de longueurs pour les structures individuelles sera observée.
   2. Pour la caractérisation et l'inspection des biocomposites post-synthèse et après stockage à 4 ° C, permettent flacons à venir à la température ambiante pendant au moins 15 min en flacons formeront condensation initialement lors de l'enlèvement du réfrigérateur, qui obscurcir efficace en se concentrant tout en effectuant l'imagerie microscopique. Après avoir laissé l'équilibre à la température ambiante, essuyer les surfaces supérieure et inférieure de la fiole avec une serviette en papier propre pour maximiser la qualité de l'imagerie microscopique.
   3. Lorsque vous travaillez avec ou imagerie composites qui ont été stockées à long terme, vortex le flacon pendant 30 secondes à se dissocier des touffes de composites qui forment alors dans le réfrigérateur. Après vortex, inspecter les structures avec un micro inverséroscope pour assurer que les agrégats ont dissocié, et répéter vortex si nécessaire.
   4. Utilisez microscopie inversée de lumière blanche pour évaluer l'efficacité de la synthèse d'une expérience donnée en utilisant CNPs. Par exemple, le document de la présence ou de l'absence de CNPs qui n'a pas réagi dans des flacons de synthèse utilisés pour biocomposites CNP-dérivés de flacons avec différents paramètres tels que le temps de synthèse.
      Remarque: individuel CNPs sont trop petits pour observer avec un microscope optique, mais qui n'a pas réagi CNP regroupe apparaîtra comme forme arrondie et objets sombres, contrairement aux CNP-composites synthétisés avec succès ce qui aura un rapport de haute aspect, forme linéaire, et aura une gamme de longueurs différentes. Éviter d'effectuer la synthèse pendant trop longtemps d'une période de temps avant la fin, car cela va entraîner très ramifiées structures de type «oursins», qui sont difficiles à disperser dans des structures individuelles une fois formés.
   5. Utilisez la microscopie de lumière blanche inversée pour évaluer l'efficacitéde la synthèse pour une expérience donnée en utilisant du sulfate de cuivre. Depuis le sulfate de cuivre va pleinement dans la solution en utilisant ce protocole, la solution apparaît moins sombre que la solution de synthèse en utilisant CNPs. Document, la taille et l'étendue des composites de sulfate de cuivre en comparant les flacons avec différentes conditions de synthèse tel que le temps de synthèse avant la fin.
      Remarque: composites synthétisé avec succès montreront une gamme de longueurs différentes. Éviter d'effectuer la synthèse pendant trop longtemps d'une période de temps avant la fin, comme cela se traduira par des agrégats hautement branchés de composites, dont certaines seront "oursin-like" dans la structure, et qui sont difficiles à disperser dans des structures individuelles une fois formés .
2. Pour concentrer biocomposites post-synthèse, solutions centrifugeuses de composites dans un tube de centrifugeuse. Ajouter 6 ml de chacune des structures CNP-structures dérivées ou dérivées de sulfate de cuivre dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger pendant 10 minà 500 x g à la température ambiante pour former une pastille. Pour les plus petits volumes, ajouter 500 pi de structures dans une solution à 0,6 ml tubes de taille. Centrifuger à 2000 xg à température ambiante pendant au moins 10 min pour former une pastille.
   1. Après centrifugation pendant une durée suffisante (au moins 10 min pour microfuges), à l'exception du culot observable au fond du tube, où les structures sont concentrés en éliminant soigneusement le liquide surnageant au-dessus de la pastille. structures biocomposites issus de sulfate de cuivre apparaissent en bleu dans la couleur et des structures dérivées de CNPs sont plus sombres (gris au noir).
   2. Ajouter plus de composites à ce tube et répéter le processus dans le même tube de se concentrer structures si désiré. Pour disperser les pastilles concentrées, ajouter le volume désiré de solution dans le tube, et pour 10 à 30 vortex sec.
3. Structures Soniquer fois formés, pour déplacer la taille moyenne de la population (de longueurs) des structures à des valeurs inférieures. La place des structures dans l'eau déminéralisée stérile et soniquer au least 10 min. Grâce à ce procédé, au fil du temps, les structures deviennent fragmentées et de plus petite longueur moyenne (voir Figure 6 du texte). Les modifications des documents dans les tailles composites avec différents temps de sonication en utilisant un microscope à lumière blanche inversé et appareil photo numérique.

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Résultats

La figure 1 montre un organigramme schématique des étapes de synthèse pour former les biocomposites linéaires décrits dans cet ouvrage. CNPs ou sulfate de cuivre comme matières de départ sont combinés avec de l'eau stérile pour former une / ml, solution 2 mg, cette solution est mélangé et traité par ultrasons pour fournir un mélange homogène, et cette solution de cuivre est ensuite mélangé dans le rapport suivant de synthèse: 949 parties stérile l'eau: 50 parties de mélange de...

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Discussion

Alors que l'évaluation des effets toxiques potentiels des nanomatériaux dont CNPS, il a été observé que sur le long terme, PNC ont été transformés à partir d'une distribution de particules initialement plus dispersée à une forme agrégée plus grande (Figure 2). Dans certains cas, ces formations très agrégés qui ont été produites dans le plat de culture cellulaire, dans des conditions biologiques, formés projections très linéaires de l'agrégat central, rappelant cuivre d?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique