Une méthode d&#39;infliger Fermé chef Traumatic Brain Injury dans<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour infliger tête fermée cérébrale traumatique blessures (TBI) chez la drosophile. Cette méthode fournit une passerelle pour enquêter sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent pathologies TBI en utilisant la vaste gamme d'outils expérimentaux et techniques disponibles pour les mouches.

Résumé

Lésion cérébrale traumatique (TBI) affecte des millions de personnes chaque année, provoquant une insuffisance de physique, cognitif, et les fonctions comportementales et de la mort. Les études utilisant la drosophile ont contribué percées importantes dans la compréhension des processus neurologiques. Ainsi, dans le but de comprendre la base moléculaire et cellulaire de pathologies TBI chez les humains, nous avons développé le dispositif High Impact Trauma (HIT) à infliger tête fermée TBI dans les mouches. Les mouches soumises à l'affichage des phénotypes de périphériques compatibles avec HIT TBI humaine tels que l'incapacité temporaire et une neurodégénérescence progressive. Le dispositif de HIT utilise un mécanisme basé sur ressort pour propulser mouches contre le mur d'un flacon, causant des dommages mécaniques au cerveau de la mouche. Le dispositif est peu coûteux et facile à construire, son fonctionnement est simple et rapide, et il produit des résultats reproductibles. Par conséquent, le dispositif de HIT peut être combiné avec des outils et des techniques de vol pour répondre fondamentale expérimentales existantesquestions sur TBI qui peuvent conduire au développement de diagnostics et traitements de TBI. En particulier, le dispositif de HIT peut être utilisé pour effectuer des criblages génétiques à grande échelle pour comprendre la base génétique des pathologies TBI.

Introduction

Une lésion cérébrale traumatique (TBI) est défini comme étant une lésion au cerveau à partir d'une force mécanique externe. La plupart du temps, les résultats de TBI forces crâniens fermés tels que les forces d'inertie et de l'accélération franches et des forces de décélération qui provoquent le cerveau de frapper l'intérieur du crâne. Aux États-Unis, on estime que 50 000 personnes meurent chaque année de TBI et de 2,5 à 6.500.000 personnes vivent avec les conséquences de TBI, y compris débilitante physique, cognitif, des problèmes de comportement et ^1,2. Les conséquences de TBI sont pas seulement due à des lésions mécaniques primaires dans le cerveau mais aussi à des blessures secondaires cellulaires et moléculaires dans le cerveau ainsi que d'autres tissus qui se produisent au cours du temps ^5.3. Le développement d'approches pour diagnostiquer et traiter TBI est avérée difficile parce TBI est un processus de maladie complexe. La nature variable des blessures primaires, la physiologie humaine et les facteurs environnementaux en résulte i secondaire hétérogènenjuries et pathologies. Facteurs variables sous-jacentes comprennent la gravité de la blessure principale, le temps entre les blessures répétitives primaires, et l'âge et le génotype de l'individu. Comprendre comment chaque facteur variable contribue aux conséquences de TBI est susceptible d'aider à l'élaboration d'approches pour diagnostiquer et traiter ^6,7 TBI.

Nous décrivons ici une méthode pour infliger fermé tête TBI dans Drosophila melanogaster (mouches des fruits) qui peut être utilisé pour délimiter la contribution des facteurs variables pour les conséquences de TBI. La méthode est basée sur une observation initiale que frapper intensément le côté d'un flacon de culture de volée contre la paume d'une main causé de type sauvage vole à devenir temporairement inapte, une conséquence probable de TBI. Ainsi, nous avons construit le dispositif à fort impact des traumatismes (HIT) de récapituler les forces d'accélération et de décélération de l'action de frapper à la main. Un film à haute vitesse montre qu'une seule frappe de laHIT dispositif provoque vole au contact de la paroi du flacon plusieurs fois avec leur tête et le corps ^8. Dans une certaine mesure, tous les contacts sont susceptibles de provoquer le cerveau de la mouche à ricocher et déformer contre la capsule de la tête, semblable à ce qui se passe à l'homme dans les chutes et les accidents de voiture ^9. En conséquence, les mouches traité avec les phénotypes affichage de l'appareil de HIT compatibles avec lésion cérébrale, y compris une incapacité temporaire suivie par une ataxie, une reprise progressive de la mobilité, des changements d'expression des gènes dans la tête, et la neurodégénérescence progressive dans le cerveau ^10. Ainsi, le dispositif de HIT permet d'étudier TBI en utilisant l'énorme arsenal d'outils et de techniques développées pour les mouches expérimentales.

Protocole

1. La construction de l'appareil de HIT

1. Accrocher le ressort au conseil à l'aide de deux pinces et quatre vis (figure 1A). Centrer les pinces par rapport à la largeur de la planche et Butt-les un contre l'autre avec la chasse d'eau de serrage externe avec le bord de la carte. Avant de fixer les pinces, les plier en utilisant une pince pour tenir étroitement au cours du printemps.
   NOTE: Voir le tableau 1 pour les descriptions des matériaux nécessaires pour la construction du dispositif de HIT. La fin serrée du ressort devrait être de 1/8 de pouce (3,2 mm) à partir du bord de la carte, et l'extrémité libre doit s'étendre sur la planche de 3/4 pouce (19 mm). Régler le ressort de sorte qu'il est parallèle à la longueur de la planche.
2. Envelopper l'extrémité libre du ressort une fois autour de la bande adhésive de boucles de Velcro. Le bord extérieur de la bande Velcro doit être aligné avec la fin du printemps. Le Velcro est important car il est utilisé pour fixer le flacon à la source par la CREAting un raccord de compression serré. Le velcro permet aussi une connexion rapide et l'élimination des flacons, permettant à de nombreux flacons à traiter dans un court laps de temps.
3. Placez le couvercle de seau à glace à l'envers, centrée, serré contre la planche de bois. Orienter la région surélevée du couvercle de seau à glace de telle sorte que le bord long est parallèle à la largeur de la planche. Notez que la région surélevée du seau à glace est de 1/2 pouce (13 mm) de plus que la planche de bois, de sorte que quand un flacon est fixé au printemps, le printemps ne sera pas à plat sur la planche.
4. Faites glisser l'ensemble du dispositif contre un objet fixe, comme un mur, de sorte que le couvercle du seau à glace est coincé entre le conseil et l'objet et ne bouge pas.
5. Tape le rapporteur de papier au fond d'un carton voler bac flacon et reposer sur bord contre la longueur de la planche de sorte que la marque de 90 ° est aligné avec le printemps, quand il est tiré vers l'arrière à une position parfaitement verticale.

2.Le fonctionnement du dispositif de HIT

1. Place entre 1 et 60 CO ₂ -anesthetized vole dans un flacon vide et le bouchon du flacon en utilisant une boule de coton moulants.
2. Confiner les mouches vers le bas de 1 pouce (2,5 cm) du flacon en poussant la boule de coton dans la fiole jusqu'à ce qu'elle soit de 1 pouce (2,5 cm) à partir du bas. Il est utile de tracer une ligne sur le flacon à la marque de 1 pouce (2,5 cm). Notez que confiner mouches à des régions plus ou moins grandes de la fiole peut influer sur la gravité des phénotypes.
3. Attendez 5 min pour les mouches de récupérer la mobilité de la CO _2. Notez qu'il ne sait pas si 5 min est suffisante pour éliminer complètement les effets de CO _2.
4. Insérez l'extrémité du ressort dans le flacon jusqu'à ce que le bord intérieur de la bande Velcro est aligné sur le haut du flacon (figure 1B). Lorsque le ressort est à plat, 1 pouce (2,5 cm) du flacon doit chevaucher la région surélevée du couvercle de seau à glace. Les flacons peuvent être réutilisés mn'importe quand.
5. Alors qu'il était assis, maintenez le flacon à la région Velcro avec le pouce et l'index de votre main gauche. Tenez la carte étanche à la paillasse en utilisant votre main droite. Sinon, utilisez des serre-joints pour tenir le conseil serré pour la paillasse.
6. Tirez le ressort parfaitement droite retour à l'angle désiré. Relâchez le printemps. Laisser le printemps à venir à un arrêt complet.
7. Retirer la cuvette de printemps et permettent vol à récupérer pendant ≥5 min. Soumettre vol à une autre grève ou transférer les mouches dans un flacon avec de la nourriture à la mouche.
   REMARQUE: Une variété de dosages peut être utilisé pour évaluer les effets phénotypiques de grèves du dispositif de HIT. Par exemple, les effets sur la longévité peuvent être déterminées par l'analyse du pour cent de vol qui survivent à des heures après la lésion, les effets sur la morphologie du cerveau peuvent être déterminées par l'analyse histologique de la tête, et les effets sur l'expression génique peuvent être déterminés par analyse quantitative des niveaux d'ARNm ^10.
8. Déterminezeffets de e de la procédure qui ne sont pas en raison de grèves en traitant de façon identique vol de contrôle qui ne sont pas soumis à des grèves. Porter une protection auditive en raison de l'impact de la fiole contre le couvercle de seau à glace produit un bruit fort.

Résultats

Nous sommes intéressés à comprendre pourquoi les mouches meurent peu après la lésion primaire. Pour quantifier la mort, nous avons déterminé l'indice de mortalité à 24 h (MI _24), qui est le pourcentage de mouches qui sont morts dans les 24 heures de la blessure primaire. Les mouches soumises à des grèves du dispositif de HIT ont été incubées à 25 ° C dans un flacon avec de la nourriture à la mouche, et le nombre de mouches mortes a été compté après 24 h. Nous avons utilisé cette appr...

Discussion

La méthode de dispositif de HIT se distingue des autres méthodes qui leur causent des lésions traumatiques chez les mouches par le fait qu'il provoque la tête privée plutôt que de pénétrer TBI ^11. En outre, la méthode de dispositif de HIT prend moins de temps, d'efforts et d'habileté pour infliger des TBI dans beaucoup de mouches, de sorte que la méthode est plus favorable que d'autres méthodes à écrans génétiques à grande échelle. Enfin, le fait que les blessures infligées ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)