Instillation et la fixation méthodes utiles en recherche sur le cancer du poumon de souris

Résumé

Le but de cet article est de décrire les méthodes simples qui va grandement aider dans la configuration et l'analyse des poumons de souris avec le cancer du poumon ou d'autres pathologies. Nous présentons 3 protocoles d'effectuer simplement et de manière fiable sur instillations pulmonaires, la fixation, et les mesures de volume pulmonaire.

Résumé

La capacité d'inculquer agents vivants, cellules ou de produits chimiques directement dans les poumons sans blesser ou de tuer les souris est un outil important dans la recherche sur le cancer du poumon. Bien qu'il existe un certain nombre de méthodes qui ont été publiées montrant comment intuber souris pour les mesures de la fonction pulmonaire, aucun ne sans problèmes potentiels pour l'instillation trachéale rapide dans les grandes cohortes de souris. Dans le présent document, une méthode simple et rapide est décrit qui permet un enquêteur pour mener à bien ces instillations d'une manière efficace. La méthode ne nécessite pas d'outils spéciaux ou de l'éclairage et peut être appris avec très peu de pratique. Elle implique une anesthésie de la souris, une petite incision dans le cou pour visualiser la trachée, puis l'insertion d'un cathéter intraveineux directement. La petite incision est rapidement fermé avec un adhésif tissulaire, et les souris sont autorisés à récupérer. Un étudiant qualifié ou technicien peuvent faire instillations à un taux moyen de 2 min / souris. Une fois que til le cancer est établi, il est souvent une nécessité pour l'analyse quantitative des histologique des poumons. Pathologistes Traditionnellement généralement pas la peine de normaliser l'inflation du poumon lors de la fixation, et les analyses sont souvent basées sur un système de notation qui peut être très subjective. Bien que cela puisse parfois être suffisamment adéquate pour les estimations brutes de la taille d'une tumeur du poumon, tout stéréologique quantification correcte de la structure du poumon ou des cellules nécessite une procédure de fixation reproductible et la mesure du volume pulmonaire ultérieure. Ici, nous décrivons des procédures simples et fiables pour les deux fixant les poumons sous pression, puis en mesurant avec précision le volume du poumon fixe. La seule exigence est une balance de laboratoire qui est précis sur une plage de 1 mg-300 g. Les procédures présentées ici pourraient donc grandement améliorer la capacité de créer, traiter et analyser les cancers du poumon chez les souris.

Introduction

Pour un certain nombre de raisons, le cancer du poumon n'a pas été largement étudiée chez la souris. Une raison à cela est que l'accès au poumon est très difficile in vivo, et l'analyse quantitative des poumons fixes n'a pas fait couramment. Les méthodes décrites dans le présent document sont conçus pour remédier à cette situation. Les buts ici sont à décrire des méthodes simples qui va grandement aider à la mise en place et l'analyse des poumons de souris avec un cancer du poumon ou d'autres pathologies. Bien qu'aucune de ces approches sont entièrement nouvelle, ils ont pas été présentés ainsi que les méthodes autonomes dans la manière simplifiée telle que décrite ici.

Il ya eu un certain nombre de manuscrits qui ont décrit des méthodes pour l'intubation du poumon de la souris principalement dans le but de faire de la fonction pulmonaire répétée ou lavage broncho-alvéolaire chez des souris individuelles dans des études longitudinales. Depuis que le papier d'origine, il ya eu plusieurs autres documents qui ont décrit les différentes approches de protocoles d'ententee intubation ^{1 -9.} Bien que toutes ces méthodes peuvent être utilisées avec succès, ils nécessitent généralement une formation considérable, et ne sont souvent pas sans un taux d'échec non négligeable. En outre, afin d'effectuer des mesures de la fonction pulmonaire, la canule doit adapter la trachée assez serré pour qu'il n'y ait pas de fuites d'air. Cependant, une autre utilisation pratique pour l'intubation est de fournir des agents spécifiques (cellules cancéreuses ou d'autres agressions) ou des médicaments thérapeutiques directement au poumon. Une telle procédure ne nécessite pas une canule hermétique ni aucun équipement de la fonction pulmonaire sophistiqué. La nouvelle caractéristique de cette méthode montré ici implique une procédure chirurgicale mineure qui permet à l'intubation sans aucune possibilité de la canule pénétrer dans l'œsophage. Cette approche simple permet une intubation réussie avec relativement peu de formation ou d'expérience. Autant que 30 souris / h peuvent être traités en utilisant cette approche avec un taux d'échec proche de zéro.

Une fois que tIl souris sont prêts à être sacrifiés, les poumons blessés ou cancéreuses peuvent alors être retirés pour analyse histologique et pathologique. Toutefois, afin de quantifier correctement les variables histologiques pour la comparaison avec d'autres poumons, il est essentiel de normaliser les procédures de fixation et bien quantifier le volume du poumon ^fixe 10. Ce document décrit en détail les procédures simples qui permettent les procédures de fixation standardisés ainsi comme un moyen de mesurer le volume du poumon fixe. Le volume est un indicateur essentiel de la quantification de l'histologie, car sans une telle détermination du volume, seuls les densités relatives peuvent être mesurés ^10. Une fois le volume du poumon est connu, cependant, des mesures absolues de cellules et d'autres mesures structurelles dans les poumons peuvent être quantifiés.

Protocole

Le protocole suivant décrit un système qui fonctionne bien en 20-35 souris g. Le procédé peut facilement être adapté à des souris plus ou moins simplement en changeant la taille du cathéter. Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation Université Johns Hopkins.

1. Lung instillation

1. Sélectionnez une longue canule 20 g par voie intraveineuse d'un pouce commerciale à utiliser pour l'intubation.
2. Modifier la pointe du cathéter flexion manuellement pour générer une légère courbure à l'extrémité comme illustré sur la figure 1.
3. Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (15 mg / kg) injecté IP, et confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux immédiatement après l'anesthésie. Immédiatement après l'anesthésie Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux et donnent carprofène (5-10 mg / kg SQ) pour l'analgésie post-opératoire et l'instillation.
4. Placez le mouSE couchée sur une plate-forme inclinée. Comme le montre la figure 2, un gros classeur de bureau avec des boucles de suture enregistrée sur fonctionne parfaitement bien.
5. Rasez la partie ventrale du cou et nettoyer et désinfecter la zone du cou avec 70% d'alcool. Avec de nouveaux gants sans latex et de à poudre, utiliser des instruments chirurgicaux désinfectés alcool à 70%.
6. Utilisation de ciseaux tranchants font une petite incision chirurgicale dans le cou d'environ 12 mm au-dessous de l'incisive inférieure.
7. Avec une pince tirez doucement la peau dans le cou caudale jusqu'à la paroi ventrale de la trachée peut être vu.
8. Rétracter doucement la langue et insérer la canule avec le bout courbé incliné vers la surface ventrale de la souris. Comme dans 1.4, tirez doucement sur la peau dans le cou, et insérer la canule dans la trachée.
   NOTE: Avec un peu de pratique, le cathéter sera visible déplacer dans la trachée. Si elle va dans l'œsophage, alors il n'y aura pas observation visuelle du mouvement du cathéter. Aucun incisionssont réalisés dans la trachée.
9. Une fois que le cathéter est vu dans la trachée dans le cou, l'a avancé d'environ 5 mm pour être fiable passé les cordes vocales, mais toujours bien au-dessus de la carène.
10. Préparez-vous à inculquer jusqu'à 50 pi de liquide par injection par le cathéter avec une pointe de pipette de chargement de gel. Placez la pointe dans le moyeu luer, mais avant l'injection de regarder attentivement pour observer le mouvement du fluide dans la pointe synchrone avec la respiration de la souris. Puis injecter l'instillation.
11. Avec une seringue de 1 ml, faire immédiatement une inflation relativement rapide de 0,6 ml d'air dans les poumons à travers le cathéter pour aider à distribuer le liquide profondément dans les poumons. Retirer la canule.
12. Retirer la canule.
13. Utilisez une petite quantité de colle cyanoacrylate pour fermer la petite plaie chirurgicale par colis insérer les instructions pour Vetbond. Placez la souris dans des cages individuelles et surveiller visuellement eux jusqu'à ce qu'ils se réveillent et se comporter normalement sans aucune indication de discomfort.

2. Fixation du poumon

Remarque: Une fois que toutes les procédures expérimentales sont réalisées en une souris, les poumons peuvent être préparés pour le traitement histologique par fixation avec du formaldéhyde (ou un autre fixateur désiré).

1. Sacrifiez la souris avec une procédure acceptable IACUC. Pour la souris représentant le montre la vidéo, la dislocation cervicale d'une souris anesthésiée est utilisé.
2. Effectuez une trachéotomie (si pas déjà fait) en exposant chirurgicalement la face ventrale de la trachée, faisant une petite coupure, et l'insertion d'un talon pointe de l'aiguille 18 G dans la trachée et l'attachant avec un fil.
3. Soigneusement ouvrir le thorax avec une incision médiane, couper la membrane, et retirer les parois thoraciques latérales pour exposer les poumons.
4. Connectez l'extrémité luer de l'aiguille à un réservoir sur un support d'anneau contenant du formaldéhyde. Voir Figure 3.
5. Réglez la surface supérieure de la formaldéhyde 25 cm au-dessus du niveau de la mouse. Voir Figure 3. Suivant assurez-vous qu'il n'y a pas d'air dans le tube de fixation en exécutant fluide hors la fin d'un robinet. Connectez l'extrémité luer de la canule trachéale à la tubulure de réservoir. Ouvrir le robinet pour gonfler les poumons avec le formaldéhyde. Laissez les poumons sous pression pendant au moins 20 min.
6. Ouvrir le robinet pour gonfler les poumons avec le formaldéhyde. Laissez les poumons sous pression pendant au moins 20 min.
7. Ensuite, attacher la trachée au-delà de l'extrémité de l'aiguille de stub. Il peut être utile de se replier lentement sur l'aiguille pour exposer plus de la trachée uncannulated. Lorsque solidement attaché, retirez le robinet.
8. Disséquer soigneusement les poumons.
9. Placez les poumons dans la nuit du formaldéhyde. Des durées plus longues sont fines, et quelques taches ou des procédures peuvent spécifier des heures spécifiques. Aussi d'autres fixateurs liquides, telles que z-fix peuvent être utilisées pour l'instillation et l'immersion.
10. Avant de poursuivre le traitement histologique, mesurerle volume pulmonaire fixe tel que décrit suivant.

3. Mesure du volume pulmonaire fixe

1. Mesurer le volume du poumon en utilisant le principe d'Archimède, comme illustré sur la figure 4. Retirer le poumon fixe à partir du formaldéhyde et disséquer le cœur et tout autre tissu non-pulmonaire.
2. Utilisez un dispositif simple maison construite précédemment de support de fil qui est utilisé pour garder les poumons complètement sous l'eau.
   NOTE: Cet appareil doit être rendu compatible avec l'équilibre selon est utilisé. Un dispositif typique de la figure 5 est fabriqué à partir de pipettes en plastique et mince (20 G) fil. Ce système fonctionne bien avec la balance utilisée dans la vidéo, mais peut facilement être adapté à la plupart des balances de laboratoire.
3. Placez un bécher avec ≈200 ml d'eau sur l'équilibre et la tare de la cage de support en place dans l'eau. Voir la figure 6 Supprimer la cage métallique. placer le poumon sur la surface de l'eau et appuyez sur sous l'eauavec la cage.
4. Noter le poids sur la balance. Ce chiffre reflète le volume d'eau déplacé et est donc une mesure directe du volume pulmonaire. Soyez prudent pour vous assurer que le poumon ou une suture ou une partie de la cage de fil ne pas toucher les côtés ou le fond du bécher.
5. Pour plus de précision, répéter cette mesure. Retirer le poumon de l'eau, et sécher sur un tissu. Tarer le bécher avec cage en place et répéter la mesure du volume pulmonaire. Les deux mesures de volume devraient ensuite calculer la moyenne.
   REMARQUE: si les poumons sont laissés dans le formol pendant plus d'une semaine environ, l'air dans les poumons est dissous dans le liquide. Lorsque cela se produit, le poumon coulera, il est donc plus nécessaire d'utiliser un appareil comme dans la Figure 5 pour maintenir le poumon submergée. Dans un tel cas, le volume peut être mesurée par simplement en tenant le poumon par l'une des chaînes de suture jusqu'à ce qu'il soit complètement immergé, comme illustré sur la figure 4.

Résultats

La procédure décrire dans le premier protocole n'a pas par lui-même conduire à aucun résultat généralisées. Il décrit seulement un moyen très fiable pour inculquer substances directement dans la trachée. La figure 7 montre un exemple d'un poumon, dans lequel le bleu trypan a été instillé avec le procédé décrit ici. Il ya une large diffusion du colorant, similaire à ce qui a été vu avec d'autres colorants ou traceurs données directement dans la trachée o...

Discussion

Les procédures décrites ici présentent plusieurs avantages. Première le matériel nécessaire est simple et peu coûteuse. Deuxièmement, l'intubation peut être fait rapidement avec peu d'erreurs. Troisièmement, la capacité de fixer les poumons à une pression constante, puis mesurer le volume du poumon fixe permet une bonne quantification des structures ou des cellules dans le poumon ^10.

Un inconvénient possible de l'intubation est la chirurgie mineure. Cela p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors