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Résumé

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Résumé

Fraîchement isolés cellules endothéliales spécifiques de tumeurs (TEC) peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de l'angiogenèse tumorale et servir comme un modèle in vitro pour le développement de nouveaux inhibiteurs de l'angiogenèse pour le cancer. Cependant, à long terme dans l'expansion in vitro des cellules endothéliales murines (CE) est difficile en raison de la dérive phénotypique dans la culture (de transition endothéliale-à-mésenchymateuses) et la contamination avec des non-CE. Cela est particulièrement vrai pour TEC qui sont facilement surpassés par les fibroblastes co-purifié ou des cellules tumorales en culture. Ici, une méthode d'isolement de haute fidélité qui tire parti de l'enrichissement immunomagnétique couplée avec la sélection de la colonie et dans l'expansion in vitro est décrite. Cette approche génère des fractions pures CE qui sont entièrement libres de contaminer les cellules stromales ou tumorales. Il est également démontré que la lignée tracée Cdh5-cre: / l de souris rapporteurs de ZsGreen l /, utilisés avec le protocole décrits ici, sont un outil précieux pour vérifier cellulairela pureté que les colonies isolées CE de ces souris montrent durable et brillante fluorescence ZsGreen dans la culture.

Introduction

Les cellules endothéliales (CE) sont essentiels lors du développement de tumeurs solides. De l'initiation du switch angiogénique dans les tumeurs dormantes à la diffusion et l'ensemencement des métastases à des sites distants, CE former les conduits qui fournissent du sang, de l'oxygène et de nutriments pour soutenir la croissance de la tumeur 1. Comme suggéré récemment, EC ont aussi des fonctions de perfusion indépendantes et former une niche qui prend en charge la croissance des cellules souches cancéreuses et d'autres cellules du stroma de la tumeur 2-5. Ainsi, hautement purifié CE (TCE) pour la culture in vitro spécifique de la tumeur permet études fonctionnelles de routine qui va faire la lumière sur les mécanismes moléculaires de médiation angiogenèse tumorale et la diaphonie avec des cellules tumorales.

CE sont très spécialisés en fonction du tissu d'origine 6. En raison de la nature hétérogène de différents types de tumeurs et le microenvironnement de la tumeur, TEC peut également afficher des caractéristiques uniques qui reflètent une tumeur spécifique à la spécialisation of le système vasculaire. Par exemple, il existe une variabilité frappante dans les signatures d'expression génique dans TEC isolés à partir de différents types ou classes de tumeurs 7,8. Toutefois, fréquemment co-purification de non-CE, en particulier les fibroblastes associés à une tumeur et les cellules tumorales, avec TEC peut confondre analyses d'expression du génome entier. Ces types de cellules non désirées sont particulièrement problématiques dans les études qui reposent sur ​​le long terme dans l'expansion in vitro de cultures de TEC.

Décrit ici est un procédé haute-fidélité qui produit toujours des cultures pures CE de tumeurs et d'autres tissus. Suite à l'enrichissement immunomagnétique des fractions de la CE et l'élimination des co-purifié non-CE colonne, une étape clonage torique supplémentaire pour capturer colonies CE pur est utilisé 9. Chaque colonie peut être étendue en culture pendant plusieurs passages sans l'émergence de contamination non-CE. Cette méthode donne également de multiples clones CE d'une procédure d'isolement unique, ce qui est idéal pour l'étude de l'endohétérogénéité épithélial. En outre, il est démontré que Cdh5 CRE: les souris rapporteurs / l de ZsGreen l / sont un outil précieux pour générer CE "de sort-mappé" et indélébile marqué qui maintiennent ZsGreen fluorescence dans la culture 10. Avec quelques ajustements mineurs au protocole, cette méthode devrait être adaptable à différents types de tumeurs ou de tissus normaux.

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Protocole

Le protocole suivant est effectué conformément aux lignes directrices établies par le ministère de médecine de laboratoire vétérinaire de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. Préparer le matériel suivant et réactifs Avant de partir

  1. Préparer les médias CE en la complétant 400 ml faible taux de glucose (1 g / L D-glucose ou LG) modifié par Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec 50 ml de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 50 ml Nu-Sérum IV, 5 ml antibiotique-antimycosique, et le hFGF, le VEGF, le hEGF, R3-IGF-1, et des composants de l'héparine à partir du kit commercial.
  2. Préparer 500 ml FACS tampon (0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA dans du PBS); filtrer à travers un filtre de 0,22 um tasse stérile.
  3. Stériliser ou désinfecter conseil dissection.
  4. Stériliser les repères de dissection, ciseaux chirurgicaux, et dissecteurs.

2. Isolement CE (Jour 1, ~ 5 h)

  1. Euthanasier la souris avec du dioxyde de carbone ou d'autres méthodes d'esprit conformeh Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) politiques.
    Remarque: tumeurs mammaires multiples de taille variable (5 - 15 mm de diamètre) peuvent se développer en une seule souris génétiquement modifiée comme C3-Tag, assurez-vous de les récolter tous pour l'isolement du TEC. Si vous utilisez des tumeurs qui sont orthotopiquement greffées chez la souris, la piscine deux à trois 1 cm 3 tumeurs pour un seul isolement CE. Ici, nous utilisons des tumeurs mammaires comme une démonstration, mais le protocole peut être modifié pour d'autres types de tumeurs.
  2. Désinfecter souris par pulvérisation ou essuyage de la face ventrale de souris avec une quantité abondante de 75% v / v d'éthanol.
  3. Réséquer tumeurs avec une paire de ciseaux et ciseaux à l'aide de techniques aseptiques sous une hotte stérile ou à un banc propre.
    1. Allongez-vous et épinglez les membres de la souris sur une planche de dissection. Faire une incision médiane ventrale avec les ciseaux sans ouvrir le péritoine. Disséquer latéralement entre la peau et le péritoine vers les glandes mammaires où se trouvent les tumeurs.Ne pas ouvrir le péritoine.
    2. Accise uniquement de tissu tumoral à partir des glandes mammaires, en laissant de côté les marges mammaires normales. Soigneusement couper les tissus non tumoraux tels que la peau et les muscles, et de placer les tumeurs disséquées dans un tube conique contenant 30 ml de DMEM-LG sur la glace.
  4. Apportez des échantillons de tumeurs à la culture de tissus hotte; laver avec les tissus stériles LG-DMEM 1 - 2 fois.
  5. Tumeurs de transfert du tube conique à une boîte de Pétri de culture de tissu stérile, ajouter 2 ml de DMEM-LG dans le plat, et mâchent avec une paire de ciseaux stériles en morceaux <5 mm.
  6. Ajouter 5 ml de la collagénase (Stock = 2 mg / ml dans une solution saline équilibrée de Hank, ci-après HBSS), 1 ml de dispase (stocks = 2,5 U / ml dans HBSS) et 75 ul de désoxyribonucléase (Stock = 1 mg / ml dans PBS ) dans la boîte de Pétri. Le volume total est maintenant ~ 10 ml.
  7. Transférer le mélange collagénase / tissu de la boîte de Pétri à un tube de tissu-dissociateur et courir sur un dissociateur de tissu pendant 60 secondes deux fois (pré-réglé dissociation prOgram sur le dissociateur: 1.270 tours au total par cycle). Incuber avec la lumière secouant sur un agitateur pendant 75 min à 37 ° C.
  8. Filtrer à travers un tissu digéré cellule tamis 100 pm sur un tube conique de 50 ml. Le rinçage du filtre avec 5 ml de tampon FACS pour laver toutes les cellules restantes. Spin à 280 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
  9. Diluer 1 ml d'actions RBC tampon de lyse (10x) dans 9 ml d'eau stérile. Lyse des globules rouges avec 10 ml de tampon de lyse (1x), et immédiatement tourner 5 min à 280 x g. Remarque: Cette étape peut être ignorée si peu de sang est visible.
  10. Remettre en suspension dans 10 ml de tampon FACS. Mélanger 10 pi de suspension cellulaire avec 10 pi de bleu trypan, et compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre.
  11. Reprendre cellules à ~ 10 7 cellules / 100 pi. Ajouter 10 ul de bloc FcR pour 100 ul de suspension de cellules, et on incube sur de la glace pendant 10 min.
  12. Ajouter anticorps CD31 de rat anti-souris conjugué à PE selon. Tableau 1 incuber sur de la glace pendant 10 - 15 min et le tube de film de temps en temps.
  13. Ajouter 10 ml de tampon FACS pour le tube et centrifuger à 280 g pendant 5 min. Retirer délicatement le surnageant et laver le culot cellulaire à nouveau avec 5 ml de tampon FACS. Centrifuger pour culotter les cellules. Aspirer le surnageant sans culot cellulaire inquiétante.
  14. Ajouter tampon FACS et des microbilles anti-PE conformément au Tableau 2 incuber sur de la glace pendant 10 -. 15 min. Tube de Flick occasionnellement.
  15. Ajouter 10 ml de tampon et des échantillons de rotation FACS à 280 xg pendant 5 min; laver une fois avec 5 ml de tampon FACS et centrifuger à nouveau. Aspirer le surnageant sans culot inquiétante.
  16. Amener le volume à 300 pi dans du tampon FACS. Spin à 35 um cellule crépine plafonné tube 5 min à 280 x g. Utilisez 2 tubes et un plus grand volume si nécessaire.
  17. Mettre en place Multistand magnétique et colonnes magnétiques dans le capot, joindre une colonne pour le séparateur et équilibrer la colonne avec 2 ml de tampon FACS.
  18. Aspirate le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 0,5 - 1 ml de tampon FACS.
  19. Passez la suspension de cellules à travers la colonne magnétique équilibrée.
  20. Laver la colonne trois fois avec 2 ml de tampon FACS, et recueillir écoulement (FT) dans un tube de 15 ml (fraction FT).
  21. Prendre la colonne hors du séparateur et on élue avec 2 ml de tampon FACS dans un autre tube de 15 ml (fraction d'éluat). Utilisez piston pour assurer que toutes les cellules sont de la colonne. Répéter l'élution deux fois avec 2 ml de tampon FACS à chaque fois.
  22. Spin l'éluat à 280 g pendant 5 min.
  23. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de médias CE.
  24. Tout aussi diviser la fraction d'éluat (~ 6 ml) dans des boîtes revêtues de gélatine 10 cm. Pour trois de 1 cm 3 tumeurs, plaque cellules élue dans au moins quatre plaques. Cellules variante, la plaque est éluée à des concentrations différentes dans plusieurs plaques (par ex., 0,5 ml, ensemencer 1 ml, 1,5 ml et 3 ml de l'éluat en quatre plaques) veiller à ce qu'unt moins une plaque est peu ensemencé avec des cellules élues. Vérifiez que la confluence des cellules attachées est à ~ 1% le lendemain (soit environ 1,0 - 2,0 x 10 5 cellules attachées).
    Remarque: Les cellules doivent être plaqué rares de sorte que les colonies CE peuvent former sans être contaminés par d'autres types de cellules.
  25. Plate fraction FT dans un plat de 10 cm pour laisser les cellules récupérer O / N. Vérifiez que la plaque est 80 - 100% de confluence le lendemain. Congeler bas les cellules (-80 ° C) dans 250 médias congélation de cellules-ul dans un cryotube et rangez-les dans de l'azote liquide le lendemain. Remarque: fraction FT peut être utilisé pour l'isolement de cellules de tumeur à un stade ultérieur et / ou en tant que témoin négatif pour l'analyse de l'expression des gènes clones CE CE de isolées.
  26. Changer de support tous les 2 - 3 jours. Colonies commencent à se former après 7 - 10 jours. Petites colonies CE peuvent être identifiés dès le jour 3. Marquez les colonies avec un marqueur à pointe fine sur le fond du plat.
  27. Grattez c non spécifiqueaunes entourant les colonies identifiées avec une pointe de Pippet 200 pi stérile.

3. Colony sélection Anneaux Utilisation de clonage

  1. Changer de support tous les 2 - 3 jours. CE pureté peut être vérifiée par les LDL (Dil-Ac-LDL) plus à environ 5 - 7 jours. Ajouter 50 pi de LDL par 10 ml de milieu CE et incuber pendant 3 - 4 heures avant de vérifier les cellules sous un microscope à fluorescence.
    Remarque: LDL Multiple + clones CE pourraient être observés à ~ 7 jours.
  2. Lancer la récolte des colonies CE quand ils atteignent un diamètre de 3 - 5 mm. (Choisissez grandes colonies qui sont emballés avec les petites LDL + cellules pour de meilleurs résultats.)
  3. Avant la récolte CE avec des anneaux de clonage, de pré-couche de quelques plaques de 6 puits avec 0,5% de gélatine. Aspirer la gélatine, ajouter 2 ml de milieu CE à chaque puits, et de garder les plaques dans un incubateur jusqu'à ce que nécessaire.
  4. Grattez non-CE sur les bords des colonies pour vous assurer que pas d'autres types de cellules seront piégés dans le cycle de clonage.
  5. Utilisation d'unmicroscope à contraste de phase (4X ou 10X objectif), contour avec un marqueur à pointe fine sur le fond de la boîte de culture les zones contenant des colonies de la CE.
  6. Laver la plaque avec 10 ml de PBS et de laisser une très fine couche de PBS dans la plaque lors de l'aspiration. (Important: une petite quantité (~ 0,5 ml) de PBS va garder les cellules vivantes au cours de la procédure de clonage torique; aussi, tissu adhésif a besoin d'eau pour coller.)
  7. Choisissez un anneau de clonage de taille appropriée. Utilisez une paire de pince à disséquer pour ramasser une bague, et avec une pipette de 10 pi appliquer uniformément une petite quantité de tissu adhésif sur l'anneau de clonage.
    Remarque: Utilisez uniquement quantité minimale (~ 0,2 pi pour un petit anneau) d'adhésif de tissu sur des anneaux de clonage, et assurez-vous colle tissulaire est répartie uniformément autour de la surface de fond pour assurer une bonne étanchéité. Adhésif tissulaire excessive produit de la chaleur et fait des films qui peuvent tuer les cellules.
  8. Placez l'anneau de clonage sur la colonie CE. Appuyez doucement l'anneau de clonage pour coller les ring sur la plaque. Veiller à ce que les colonies ne sont pas séchés avant le collage de la bague.
  9. Immédiatement pipette 25 pi de solution enzymatique de détachement cellulaire dans l'anneau de clonage et incuber ~ 1 min ou jusqu'à ce que les cellules sont mal fixés.
  10. Pipet cellules dans l'anneau de clonage goutte à goutte dans un puits d'une plaque à 6 puits contenant les médias communautaires préchauffées. (Important: Ne secouez pas la plaque pour disperser les cellules; CE préfèrent poussent en grappes serrées.) Lavez la bague de clonage avec 50 - 100 médias communautaires ul de collecter autant de cellules que possible, et de transférer tous les lavages dans le même 6 puits .
  11. Si certaines colonies dans la boîte de 10 cm sont trop petits pour récolter, ajouter 10 ml de milieu frais, laisser les colonies pousser pendant quelques jours de plus, et de répéter la procédure d'anneau de clonage.
  12. Poussent des colonies récoltées dans des plaques 6 puits jusqu'à 80 - 100% de confluence, et le transfert des cellules à 3 puits d'une plaque à 6 puits, avant de les étendre dans une boîte de culture de tissu de 10 cm. Grattez cellules contaminantes. Répéterune autre série de la procédure de l'anneau de clonage (étapes 03/05 au 03/10), si nécessaire. Gardez cellules relativement confluentes (~ 60 - 70%) lors de l'expansion. CE peut cesser de croître si plaqué trop clairsemée.
  13. Caractériser CE par FACS, la coloration, PCR, etc. Notez que Dil-Ac-LDL est fluorescent et peut interférer avec PE ou d'autres anticorps fluorescents pour FACS.

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Résultats

CE représente seulement une fraction mineure de la population cellulaire totale dans la plupart des tissus adultes 11. Il est donc important pour digérer complètement le tissu récolté dans une suspension à cellule unique qui assure la libération maximale de CE à partir de la matrice extracellulaire (ECM) et les tissus conjonctifs. Dans notre expérience, la sélection immunomagnétique CD31 à médiation ne fournit fractions CE enrichis mais pas pures; par conséquent, une autre étape cruciale est l&...

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Discussion

En raison des difficultés à obtenir des cultures de TEC primaires pures, dont beaucoup dans des études in vitro TEC substitut avec des lignes disponibles dans le commerce de la CE ou primaire CE tels que la veine ombilicale humaine CE (HUVEC) 13. Cependant, ces populations CE de tissus normaux ne peuvent servir de proxy pour les TEC qui diffèrent sensiblement de leurs homologues normales. Par exemple, TEC sont phénotypiquement et fonctionnellement anormale in vivo et certains de ces ano...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-Antimycotic Sigma-AldrichA5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)Gibco11885-084
EGM-2 Bullet Kit LonzaCC4176Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)Thermo ScientificSH30071.03Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IVCorningCB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)Gibco14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-144
FACS buffer 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads Miltenyi Biotech130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%Gibco15260-37
Cell freezing media (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
Collagenase type II  Worthington BiochemicalLS004176Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0Cellgro46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)Sigma-AldrichA6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture gradeSigma-AldrichG1393-100MLDilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotech130-092-575
Neutral protease (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibodyBD Pharmingen553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 % Life Technologies15250-061
10 mm tissue culture dishesCorning
15 ml conical tubes (sterile)Corning
50 ml conical tubes (sterile) Corning
6-well tissue culture platesCorning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) Miltenyi Biotech130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)Miltenyi Biotech130-042-302
Cell strainer 100 μm Corning352360
Cloning rings (assorted sizes)Bel-Art Products378470000
CryotubesThermo Scientific
Dissecting boardSterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use 
Dissecting forceps and scissorsSterilize before use 
Dissecting pins 2"Sterilize before use 
FACS tubes with 35 μm filter capCorning352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)MilliporeSCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
Magnetic MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)3M1469SB
CentrifugeEppendorf5810ROr a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation 
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope

Références

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