Déterminer ultrasons vocalisation Préférences chez la souris en utilisant un test de lecture à deux choix

Résumé

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

Résumé

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Introduction

Beaucoup d'animaux utilisent des vocalisations pour la communication intraspécifique. Dans le Mus musculus de la souris, un type important de signal de communication est vocalisations ultrasoniques (USV), qui ont des fréquences supérieures à 20 kHz. USV émis par les souris sont considérées comme un élément de reconnaissance sociale dans mâle-femelle ^1-4, femelle-femelle ^{1, 5,} et mâle-mâle ^{1, 6} interactions. USV sont également émis par les petits quand ils sont isolés de leur mère, ce qui augmente son comportement de chiot-récupération, et donc la survie des petits ^7. Bien que de nombreux rapports ont analysé et catégorisé USV de souris ^{8, 9,} les réponses comportementales et mécanismes neuronaux de l'animal à recevoir ont été moins documenté ^{10, 11.} Ce dernier est nécessaire de clarifier la signification biologique des différentes caractéristiques de USV. Pour révéler ces mécanismes, l'expérience de la lecture est une méthode efficace. Études de lecture récentes ont révélé que femelleles souris sont attirés par USV ^12, et qu'ils préfèrent USV de mâles qui sont différentes de leurs parents ^{13, 14.}

Cet article explique le test de lecture utilisée pour évaluer USV préférence chez la souris. Une boîte d'essai de deux choix a été développé dans lequel deux USV différents peuvent être lues simultanément dans deux compartiments d'une enceinte d'essai, comme le montre la figure 1. Ce type de boîte d'essai empêche la contamination sonore en divisant la zone de test en trois sous-chambres , en utilisant des parois de plomb. Les émetteurs d'ultrasons sont situés à l'extérieur de chaque chambre. Dans le mur entre les chambres et les émetteurs d'ultrasons sont des trous recouverts de grillage. Les souris peuvent se déplacer librement dans les trois chambres, et montrer un comportement "la recherche de la maille", comme pour répondre à USV lus par les émetteurs d'ultrasons. Dans ce test, les souris restent pendant des périodes de durée différente à proximité de son émetteur une ou l'autre. Ces paramètres peuvent être enregistrés pour obtenir une mesu sensibles re de préférence son.

Pour jouer les USV arrière, silicium nanocristallin émetteurs thermo-acoustique (ie, «émetteur nc-Si») ont été utilisés comme dans les études précédentes ^15-17. Ces dispositifs sont constitués d'une électrode à couche mince de chauffage, une couche de silicium nano-poreux, et une tranche de silicium monocristallin. Le fichier audio numérique est converti en un signal analogique et ensuite passé à travers l'électrode de chauffage. Le dispositif convertit les signaux thermiques dépendant de la tension résultant en une pression significative du niveau sonore avec une faible distorsion. Ce dispositif est unique en ce que, à la différence des générateurs de sons ordinaires qui dépendent de vibrations mécaniques, il peut reproduire le son sans la nécessité d'un diaphragme. L'émetteur présente un niveau de pression acoustique plat à des fréquences de 20 à 160 kHz (Figure 2), et peut reproduire USV murins enregistrés numériquement très précise en termes de durée, la fréquence et le niveau de pression acoustique ^{de 15, 18, ​​19.}

ve_content "> Dans une expérience représentative montrée sur la figure 3, C57BL / 6 (B6) femelles ont été autorisés à choisir entre des souris BALB / c (BALB) USV mâles et les bruits de fond. En outre, la figure 4 montre le choix des femelles B6 et BALB entre simultanés playbacks USV d'un BALB et un mâle B6, tel que rapporté dans une étude précédente ^14. Les caractéristiques de USV hommes diffèrent entre B6 et BALB souches ^20. Comme le montrent ces résultats, l'attractivité de l'USV peut être évaluée avec le présent Protocole, dans lequel les sons sont enregistrés à partir d'un individu vivant, acoustiquement analysés, et lus à d'autres personnes.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'Université de Azabu. Toutes les expériences ont été réalisées dans une chambre insonorisée.

1. Préparation d'un animal

1. Les mâles pour l'enregistrement
   1. Obtenir les souris mâles sexuellement matures rencontrées dans l'accouplement.
2. Sujets féminins
   1. Obtenir les souris femelles vierges qui ont été logés avec 2 à 5 de la même portée par cage (généralement 8 - 12 semaines).
   2. Obtenir frottis vaginaux quotidienne pour déterminer la phase du cycle oestral avant le test, selon McLean ^21. Des précautions doivent être prises pour minimiser la stimulation vaginale pour éviter pseudogestation.
   3. Colorer les frottis avec Giemsa, et déterminer la phase du cycle oestral sur la base de la présence ou de l'absence de leucocytes, les cellules epitheliales kératinisées, et les cellules épithéliales nucléées, selon Nelson ^22.

2. Dispositifs (Figure 1)

_content ">
Figure 1. Schéma de la boîte et Test Devices deux choix. Les souris peuvent accéder aux salles A et B à travers les petites portes situées entre eux et la zone neutre. La boîte à deux choix et deux émetteurs d'ultrasons sont placés sur le plancher d'une chambre insonorisée. Le microphone est suspendu à l'intérieur de la chambre insonorisée. Abréviation:. PC, d'un ordinateur personnel S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Pour l'enregistrement
   1. Connectez un microphone à condensateur à ultrasons à un PC via un convertisseur USB A / D.
   2. Réglez le niveau de gain du convertisseur A / D à "7".
   3. Données acoustiques records en fichiers de format 16 bits avec un taux de 400 kHz en utilisant un logiciel de capture audio d'échantillonnage.
2. Pour la lecture
   1. Connectez un convertisseur N / A à l'ordinateur à l'aideune interface USB.
   2. Connectez deux amplificateurs au convertisseur D / A travers un atténuateur. (Le dernier dispositif sert à éviter la surcharge.)
   3. Connectez un émetteur d'ultrasons à chaque amplificateur.

3. USV Enregistrement

1. Placez une souris mâle dans une petite (17 x 10 x 11 cm) ou (21 x 14 x 13 cm) cage de taille moyenne avec un trou de 6 cm de diamètre dans la paroi latérale et le trou recouvert d'un treillis métallique de 0,5 cm. Lors de l'utilisation d'une cage de taille moyenne, de construire une cloison à travers le centre de la cage afin de réduire la zone.
2. Ne pas utiliser la literie dans la cage pour éviter bruissements qui pourraient contaminer les enregistrements.
3. Placez un microphone à côté de la maille.
4. Commencez surveillance de vocalisation ultrasonique avec la configuration d'enregistrement affiché à l'étape 2.1.
5. Placez une souris femelle sexuellement matures dans les deux metestrus ou dioestrus dans la cage avec la souris mâle.
6. USV record pour 3 - 5 min.

4. TEst Box

1. Construire la boîte de test en utilisant conseil acrylique (Figure 1).
   Remarque: La boîte d'essai (35 x 20 et x 20 cm de haut) est divisé en trois compartiments: une zone neutre (15 x 20 cm), et des chambres A et B (20 x 10 cm, chacun). Les chambres A et B ont chacun un trou de 4 cm de diamètre qui est recouvert d'un treillis métallique de 0,5 cm. Les trous et les mailles sont situés à chaque extrémité de chambres A et B. Faire portes (5 x 5 cm chacun) entre la zone neutre et les chambres A et B.
2. Pour empêcher une fuite du son isoler chaque émetteur d'ultrasons, à l'exception de la face tournée vers le filet, en utilisant des plaques de caoutchouc, les sceller à la boîte autour du périmètre de chaque maille.
3. Phoques Lieu de plomb sur les deux côtés du mur entre les chambres A et B pour l'isolation sonore.

5. Préparation pour la lecture audio

1. Création de sons de lecture
   1. Capter un segment de 20 secondes de USV du fichier enregistré en utilisant le logiciel d'édition audio numérique.
   2. Sélectionner et capturer fond pasISE (0,35 sec) à partir du fichier du segment 20 sec USV. Créer un fichier de fond de bruit de 20 sec en répétant le segment de bruit.
   3. Pour lire les deux fichiers sonores simultanément, de les exporter dans un fichier stéréo unique, avec un fichier pour «l'oreille gauche» et l'autre fichier pour le "oreille droite."
   4. Filtrer les fichiers sonores en utilisant comme filtre passe-haut avec un seuil de coupure de 40 kHz.
   5. Réduire le bruit à l'aide de l'outil de réduction du bruit dans les logiciels de post-traitement. Sélectionner et capturer un segment du fichier qui ne contient pas de USV que le profil de réduction du bruit, et exécuter la réduction du bruit avec le niveau 40.
2. Calibrage des sons de lecture
   1. Assurez-vous que l'espace entre les émetteurs d'ultrasons et le microphone est de 10 cm.
   2. Pour calibrer les niveaux de pression acoustique des émetteurs d'ultrasons, effectuer une surveillance par ultrasons en utilisant la configuration décrite dans l'étape 2.1. Mesurer le niveau de pression acoustique par le microphone en décibels (dB).
   3. Using l'atténuateur et amplificateurs, régler le volume des USV générés par les émetteurs d'ultrasons au même niveau de pression acoustique que les USV masculins enregistrés à l'étape 3.
   4. Lorsque vous utilisez les deux émetteurs d'ultrasons et un fichier sonore composée de USV et le bruit de fond, confirmer que les deux émetteurs d'ultrasons présentent le même niveau de pression sonore en utilisant un son d'étalonnage (par exemple, un son pur de 75 kHz) avant d'effectuer le test de comportement.
   5. Lors de la reproduction d'un fichier audio composé de deux courants de USV, ajuster les deux générés niveaux de pression acoustique au même niveau, avant le test.

6. Testez Deux choix

1. Placez les émetteurs ultrasonores derrière les mailles de la zone de test.
2. Fermez les portes de chambres A et B avec un panneau acrylique, et habituer le sujet féminin à la zone neutre pendant 30 min. Couvrir la boîte avec le conseil acrylique pour éviter que la souris ne peut échapper.
3. Commencer l'enregistrement vidéo à l'aide d'un CCD caméra montée au-dessus de la boîte. L'appareil (non représenté sur la figure 1) couvre la zone de chacun des trois compartiments.
4. Retirez la grille et le couvercle de bord et permettre à la femme d'explorer librement la zone de test, y compris les zones sonores.
5. Une fois que la femelle a enquêté sur deux mailles, et est retourné à la zone neutre, commencer à jouer un fichier audio de 20 secondes à plusieurs reprises pendant 5 ou 10 minutes.
6. Effectuer le suivi comportemental pour 5 ou 10 min.
7. Afin de réduire les signaux olfactifs indésirables déposés auprès de la personne précédente, nettoyer les cages de test entre les tests avec 70% d'éthanol.
8. Mettez le lieu d'émetteurs ultrasonores A et B au hasard pour éviter inhérente effet de polarisation de côté vers chambres A ou B.

7. Analyses statistiques

1. Utilisation de logiciels événement scoring comportemental, analyser les paramètres suivants: nombre total d'inscriptions dans chaque chambre; durée totale de séjour dans chaque zone médiane; durée totale de séjour dans chaque zone sonore; etdurée totale de la recherche de chaque maille devant émetteur d'ultrasons. La figure 1 illustre ce que l'on entend par «zone médiane» et «zone saine."
   Remarque: Dans les cas où la souris reste sur la ligne de démarcation entre les deux zones (figure 1, ligne pointillée) décider de l'emplacement par la direction de la tête. Lorsque la tête face au côté maille, il est marqué comme un séjour dans la zone de son.
2. Pour chaque paramètre comportemental, comparer les réponses des chambres A et B en utilisant un test-signé Wilcoxon, ou t-tests appariés avec un niveau de signification de 0,05.

Résultats

Les USV enregistrées à partir d'une souris BALB-mâle (161 syllabes par 20 sec), ainsi que le bruit de fond ont été utilisés comme la lecture des sons dans l'expérience représentative montrée sur la figure 3. Dans cette expérience, 7 souris B6 femelles ont été utilisées à 9 semaines d'âge . Pour déterminer la meilleure durée de l'essai de la réponse des femmes à la lecture des sons, les paramètres comportementaux ont été analysés séparément pour l...

Discussion

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soundproof chamber	Muromachi Kikai
Small cage	CLEA Japan	CL-0113-1
Middle cage	CLEA Japan	CL-0103-1
Ultrasound condenser microphones	Avisoft Bioacoustics	CM16/CMPA
A/D converter	Avisoft Bioacoustics	UltraSoundGate116H
Audio software	Avisoft Bioacoustics	RECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing software	Adobe Systems	Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter	Original		not commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converter	National Instruments	NI USB-6251 BNC
Attenuator	Original
Amplifier	Yamatake
PC	Windows 7 professional		Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring software	original		Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin)	Tokyo bouon	TI-75BK B4	Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck Millipore	1.09204.0500