Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

Résumé

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Résumé

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

Introduction

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features^1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality^1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane^4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy⁷. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity^8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems^2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.

To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases². To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations^16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms^17,18, and identify novel therapeutic strategies^12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers²⁰. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens²¹, a valuable method for the identification of novel therapeutics^22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation²⁵ and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence²⁶, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.

We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence²⁷. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases^8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje^15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

Protocole

1. Préparation de plaques de gélose d'injection (Durée: 45 min)

1. Faire bouillir 2% à 3% d'agarose dans les médias E3 et laisser la solution refroidir légèrement sur le banc. Note: Le nombre de plaques d'injection en cours de préparation dicte la quantité d'agarose requis. Chaque plaque d'injection a besoin d'environ 35 ml de la solution d'agarose.
2. Après l'ébullition, laisser refroidir l'agarose jusqu'à ce que la température désirée est atteinte (par ex., 45 ^{° C)} selon les instructions du fabricant de moule d'injection.
3. Verser environ 35 ml de la refroidies agarose dans un plat de 100 mm.
4. Placez une extrémité du moule d'injection préférée dans la solution, puis posez reste de moule sur une solution d'agarose (cela va aider à réduire l'apparition de bulles d'air).
5. Laisser la solution d'agarose se solidifie soit à la température ambiante ou 4 ^{° C pendant} environ 30 min.
6. Utiliser une spatule pour séparer une extrémité du moule à partir de l'agarose solide. Retirez lentement le reste de la m Agé de.

2. Préparation du colorant bleu Evans (EBD) Injection Mix (Durée: 30 min)

1. Faire un 1% stock d'EBD dans une solution de 1X Ringer (NaCl mM 155; KCl 5 mM, _CaCl2 2 mM; 1 mM MgCl _2; 2 mM Na _{2 HPO 4;} HEPES 10 mM, 10 mM de glucose; pH à 7,2), qui peuvent être stockées à température ambiante.
2. Faire une solution de réserve de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -dextrane MW 10.000 kDa à 25 mg / ml dans la solution et magasin de 1X Ringer ^à -20 ° C
3. Préparer mélange d'injection en diluant EBD à 0,1% directement dans la solution mère de stock FITC-dextran (ie, pour un volume de travail final de 100 pi. Mélanger 10 pi de 1% EBD dans 90 ul d'actions dextran FITC).
4. Bien agiter au vortex mélange d'injection (il doit devenir vert) et de garder hors de la lumière directe en enroulant tube de mélange d'injection dans une feuille d'aluminium.

3. Injection Préparation EBD (Durée: Environ 30 min)

ent "> Remarque: Protocole fonctionne mieux avec des larves de 3-7 jours après la fécondation (DPF).

1. Préchauffer plaque d'injection à la température ambiante.
2. Mettre en place des appareils d'injection en organisant micromanipulateur sur la plaque de métal et se tenir à côté du microscope étant utilisé pour l'injection. Tournez sur le contrôleur de micro-injection d'air entraîné. Remarque: Le système d'injection préférée varie en laboratoire et ne devrait pas changer résultats de l'analyse.
3. Retour combler aiguille d'injection à environ 2-4 pi de EBD mix.
4. Calibrer volume d'injection à environ 5 nl de EBD mix. Remarque: le calibrage de volume d'injection dépendra de la méthode d'étalonnage. Une injection à pistons entraînés peut être directement fixé à un volume d'injection étant donné que les injecteurs à pression de gaz devront le volume d'injection calibrée par le volume de bolus à l'aide d'un micromètre.
5. Plaque d'injection humide avec une solution de Ringer 1X et enlever l'excès de puits.
6. Larves pré-traitement avec 0,04% éthyl-3 benzoate méthanesulfonate salt (tricaïne) dilué dans une solution de Ringer pour immobiliser 1X larves avant le début de l'injection. Remarque: Assurer larves sont complètement immobiles est important que l'injection correcte est difficile avec un mouvement résiduel.
7. Placer les larves anesthésié dans des puits des plaques de gélose d'injection à l'aide d'une pipette en verre. Assurez-vous que les larves sont complètement à l'intérieur du puits et couché sur le côté. Remarque: Le nombre de larves par puits est à l'expérimentateur.
8. Après larves sont mis dans les puits, enlever la solution de Ringer excès pour minimiser le mouvement de larves dans le puits. Laissez une quantité résiduelle de solution pour que les larves ne déshydrate pas.

4. injection péricardique de poisson zèbre larves avec EBD (Durée: en fonction du nombre de larves injection, environ 1-3 h)

1. Placer la plaque d'injection contenant les larves sur un microscope à dissection où les injections seront réalisées.
2. Placez l'aiguille de pipette d'injection contenantl'EBD mélanger sur une larves de poisson zèbre.
3. Repositionner la plaque d'injection en le faisant tourner de sorte que l'aiguille d'injection se trouve à proximité du coeur du larves et environ 45 ^° ventralement à partir de l'axe antéro-postérieur.
4. Insérez l'aiguille d'injection dans la veine cardinale commune (CCV) dans la région de la veine à la partie antérieure du jaune où la veine est initialement tourne dans le sens de la dorsale (Figure 1). Remarque: Un grossissement de 40x jusqu'à peut être utile de voir clairement la CCV.
5. Injecter 5 nl de EBD mélange et de garder aiguille d'injection en position de 5-8 sec pour minimiser les fuites immédiate de EBD mix. Remarque: Une bonne injection aura coloration colorant vu dans les cavités cardiaques (figure 1). Si EBD mélange est pas observé dans le cœur, puis l'injection d'un 5 nl de EBD mélange supplémentaire peut être suffisante pour induire l'absorption de colorant. En variante, l'embryon peut être mis au rebut.
   Remarque: Dans certaines situations, le cœur peut s'arrêter de battre. Si ce occurs, continuera à surveiller les larves pour les 20-40 sec. Typiquement, le cœur battant reprend le colorant se déplace à travers le système circulatoire.
6. Passer à la prochaine larves et répétez.
7. Identifier les embryons injectés avec succès par l'observation de la présence de FITC-dextran dans le système vasculaire immédiatement après l'injection (figure 2).

5. Incubation et EBD absorption (Durée: 4-6 h)

1. Après le nombre désiré de larves sont injectés, retour injecté larves à la solution de Ringer 1X sans tricaïne en boîtes de 100 mm.
2. Gardez plats enveloppés dans une feuille d'aluminium. Remarque: Garder larves injecté dans l'obscurité augmente considérablement les taux de survie et assure la plus grande cohérence dans la force du signal. Emballage en feuille d'aluminium est particulièrement important pour la période de temps que les larves sont à l'extérieur de l'incubateur.
3. Laisser larves à incuber à 28,5 ^{° C pendant} 4-6 heures pour assurer l'absorption d'EBD suffisante.

6. Visualisation de EBD dans le muscle (Durée: en fonction du nombre de larves injection et le type de microscopie, estimé 0,5-3 h)

1. Avant imagerie, anesthésier les larves avec 0,04% tricaïne pour empêcher le mouvement.
2. Voir larves en fluorescence rouge pour déterminer si EBD absorption se produit dans le muscle squelettique (Figure 3).

Résultats

Le mélange d'injection EBD a été injecté dans la CCV de mutants homozygotes sapje frères et sœurs de type sauvage à 3 DPF. Les injections qui ont rempli les cavités cardiaques (figure 1B) ont ensuite été analysées pour l'injection avec succès par la visualisation de FITC-dextran dans le système vasculaire sous fluorescence verte (figure 2).

Après une période d'incubation de 4 heures, EBD absorption a été examinée au niveau des somites utilisant la microscopie à fluorescence. Frères et sœurs de type sauvage ne ​​présentaient pas de fluorescence à l'intérieur de EBD des fibres musculaires visibles (Figure 3A), tandis que les mutants homozygotes sapje EBD ont montré l'absorption, ce qui indique des dommages à la membrane musculaire ¹⁵ (figure 3B).

Figure 1. Injecter EBD mélange d'injection dans la veine cardinale commune (CCV) d'un poisson zèbre Embryo. Embryon (A) non injectée. La flèche indique l'emplacement idéal pour l'injection de CCV. (B) d'injection réussie dans la CCV. Le colorant pénètre dans les cavités cardiaques (flèche) et commence à être pompé à travers le système vasculaire. (C) Une injection de CCV échec se traduira par une partie ou tout le colorant entrant dans le sac vitellin de l'embryon (flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Les embryons peuvent être triés pour injection réussie en observant la distribution de FITC-dextran sous fluorescence verte à travers le système vasculaire immédiatement après l'injection et avant EBD absorption.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: EBD sera repris par fibres avec des membranes endommagées fratrie (A) de type sauvage ne ​​présentant pas de fluorescence EBD dans les fibres musculaires.. (B) Sapje ​​mutant homozygote avec EBD fluorescence à l'intérieur des fibres musculaires multiples (flèches). Toutes les larves ont été injectés avec le mélange d'injection EBD et analysée après une période d'incubation de 4 heures à 3 dpf. Frères et sœurs et mutants ont été classés par le détachement de la fibre musculaire avant l'injection de CCV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Poisson zèbre sont en train de devenir un outil puissant pour l'étude de ^2,29 de maladie neuromusculaire. À ce jour, le système poisson-zèbre a été utilisé pour valider le nouveau muscle mutations pathogènes ^16,17,30, d'élucider de nouveaux mécanismes pathologiques ^18, et d'identifier de nouveaux médicaments potentiellement thérapeutiques ^12,24. Ces efforts collectifs ont établi l'utilité du poisson zèbre pour modéliser les maladies neuromusculaires humaines. Cependant, malgré les progrès réalisés avec des modèles de poisson zèbre et de mammifères, il ya des options de traitement limitées pour les patients dans le large spectre de maladies neuromusculaires. Par conséquent, une forte demande existe pour le développement de la thérapie pour ce groupe de maladies dévastatrices. Parallèlement à cette demande de la thérapeutique est la nécessité correspondante de l'innovation expérimentale en cours, ainsi que l'analyse rigoureuse afin de vérifier de nouveaux modèles animaux et des stratégies thérapeutiques putatifs.

Analyse EBD est couramment utilisé dans les modèles de souris dele tissu de l'étude et des dommages cellulaires dans le cerveau, le cœur, et squelettique ^27,31 musculaire. Plus particulièrement, EBD est largement utilisé dans des modèles murins de divers sous-types de dystrophie musculaire pour montrer la gravité de la membrane musculaire instabilité et endommager ^8. L'utilisation d'EBD pour révéler dommages à la membrane musculaire est un paramètre de soutien à établir des similitudes du modèle animal à l'état de la maladie humaine ^9. La puissance de EBD chez la souris a dirigé plusieurs laboratoires, y compris notre propre, de développer et d'appliquer EBD aux modèles de poisson zèbre de maladie neuromusculaire. En raison de l'applicabilité de l'analyse EBD, cette technique est activement mis en œuvre pour corroborer les modèles de poisson zèbre à l'état de la maladie humaine ^{11,15,22,24,32.} Les larves avec des membranes musculaires endommagées aura EBD l'absorption et la fluorescence rouge par conséquent à l'intérieur des fibres musculaires. Fluorescence observée dans l'espace entre les fibres, mais pas à l'intérieur des fibres musculaires individuelles peuvent également être informatif de fibres de détachement de la membrane basale en til absence de dommages de la membrane, fournissant des détails de diagnostic utile. Analyse EBD possède application potentielle au-delà de la validation de modèle animal. Les efforts de notre laboratoire ont récemment démontré que l'analyse EBD est bénéfique dans la validation de nouveaux médicaments potentiellement thérapeutiques ^24. Déterminer si les traitements thérapeutiques potentiels réduire ou supprimer EBD absorption dans les modèles de maladies neuromusculaires peut signifier action thérapeutique pertinente ^8. Ce type d'analyse peut aider à établir le mécanisme (s) de la thérapeutique et élargit l'application de l'analyse EBD.

Comme avec de nombreuses techniques, l'analyse n'a EBD plusieurs mises en garde doivent être observées lors de la conception et de la pratique expérimentale. Par exemple, il peut être difficile d'identifier la raison de la CCV épaississement du tissu avec l'âge. En outre, il est facile d'endommager les larves dans la préparation avant et pendant l'injection péricardique, réduisant chiffres expérimentaux et l'augmentation du besoin pour préparer un grand nombre de larves.En outre, les dégâts physiques que les larves lors de la manipulation et de l'injection peut entraîner des faux positifs comme le muscle endommagé peut prendre jusqu'à EBD. Afin de surmonter certains de ces obstacles, nous avons décrit une stratégie de co-injection dans cet article vidéo qui permet l'identification fiable et facile des larves avec succès infusion de colorant immédiatement après injection et avant l'analyse ultérieure. Le FITC-dextran contrôles de co-injection pour l'injection de succès, en permettant de EBD confirmation dans le système vasculaire avant son absorption par les fibres musculaires. Cela peut être particulièrement utile comme EBD fluorescence devient très diffus dans les larves après plusieurs heures sinon recueillis dans les fibres musculaires; en tant que tel, il peut être difficile à détecter. En outre, à côté de la CCV et EBD injection dans la cavité du corps jaune ou peut, après incubation, la fluorescence rouge entraîner diffus semblable à contrôler embryons, mais avec le risque réduit d'absorption par les fibres musculaires endommagées. Collectivement, ces grotteats suggèrent injection EBD exige de la patience et de la pratique afin de parvenir à des résultats cohérents et fiables.

En tout, nous décrivons une méthode pratique et simple d'effectuer des analyses sur EBD larves de poisson zèbre. À ce jour, l'utilisation du poisson zèbre comme un système modèle, en particulier comme un modèle de la maladie humaine, a connu une expansion rapide. Cette expansion est due en partie à la poursuite du développement et la modification des techniques expérimentales qui améliorent les avantages sur le système actuel de poisson zèbre. La technique d'injection EBD fournit un outil supplémentaire et puissant à l'arsenal d'un chercheur pour la validation et l'étude des modèles de maladies du muscle de poisson zèbre. La mise en œuvre continue et la modification de cette technique a le potentiel d'aider à découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que les mécanismes de la maladie causant.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000	Sigma	FD10S
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040
100 mm Petri dish	Fischerbrand	FB0875712	Injection mold base
Thin wall glass capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4	For Injection needle
Agarose	Bioshop	AGA001	Injection mold
Microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	Injection mold
Sodium chloride	Bioshop	SOD001	Ringer's solution
Potassium chloride	Bioshop	POC888	Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma	M2670	Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Ringer's solution
HEPES	Sigma	H4034	Ringer's solution
Glucose	BioBasic	GB0219	Ringer's solution
Calcium chloride	Sigma	C1061	Ringer's solution