Utilisation<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

Résumé

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Résumé

Enquêter organogenèse in utero est un processus techniquement difficile chez les mammifères placentaires raison de l'inaccessibilité de réactifs à des embryons qui se développent dans l'utérus. Une méthode ex vivo de culture vertical de gouttelettes nouvellement développé offre une alternative intéressante aux études réalisées in utero. La culture ex vivo de gouttelettes fournit la capacité d'examiner et de manipuler les interactions cellulaires et des voies de signalisation divers grâce à l'utilisation de divers composés blocage et d'activation; en outre, les effets de divers réactifs pharmacologiques sur le développement des organes spécifiques peuvent être étudiés sans effets secondaires indésirables de l'administration de médicaments systémiques in utero. Par rapport aux autres systèmes in vitro, la culture de gouttelettes permet non seulement de la capacité d'étudier les interactions à trois dimensions morphogenèse et cellule-cellule, qui ne peuvent être reproduites dans des lignées cellulaires mammaliennes, mais nécessite également beaucoup moins de reagents autre que ex vivo et in vitro dans des protocoles. Ce document démontre la dissection de souris adéquat foetal des organes et des techniques de culture de gouttelettes verticaux, suivie par immunofluorescence organe entier pour démontrer l'efficacité de la méthode. Le procédé ex vivo de culture de gouttelettes permet la formation de l'architecture d'organes comparables à ce qui est observé in vivo et peut être utilisé pour étudier les processus autrement difficiles à étudier en raison de la létalité embryonnaire dans des modèles in vivo. En tant que système d'application de modèle, un inhibiteur à petite molécule sera utilisé pour sonder le rôle de la vascularisation dans la morphogenèse des testicules. Ce procédé ex vivo de la culture des gouttelettes est extensible à d'autres systèmes d'organes du foetus, comme les poumons et potentiellement d'autres, bien que chaque organe doit être largement étudiés afin de déterminer les modifications spécifiques d'organes au protocole. Ce système de culture d'organe offre une flexibilité dans l'expérimentation avec les organes du fœtus, et les résultats obtained en utilisant cette technique aidera les chercheurs à acquérir une meilleure compréhension du développement fœtal.

Introduction

La régénération des organes in vivo chez l'homme est très limitée; par conséquent, l'ingénierie tissulaire, le développement des tissus et organes à partir de cellules individuelles donnés par un hôte, devient une thérapie potentielle attractive pour le remplacement d'organes. Cependant, pour cette stratégie thérapeutique soit couronnée de succès, les facteurs et les interactions cellulaires impliqués dans la morphogenèse de l'organe doivent être soigneusement étudiés et bien compris. En raison de l'incapacité d'étudier le développement des organes spécifiques avec les approches traditionnelles, les chercheurs se sont tournés vers l'embryon toute solution de rechange ou de cultures d'organes entiers. Kalaskar et al. ¹ ont montré que la culture ex vivo de l'embryogenèse ensemble donne des résultats comparables (dans 58% des embryons cultivés) au développement in utero, suggérant que ex vivo des méthodes de culture sont une alternative possible pour les études de l'organogenèse.

Un système de culture d'organe individualisé, tel que cette ex vivo droplet système de culture, pour l'ensemble de l'analyse permet d'organe indépendant des effets systémiques, tout en permettant la manipulation d'une voie de signalisation spécifique par l'intermédiaire d'interactions cellulaires ou addition de réactifs pharmacologiques ou des anticorps. Traditionnellement, l'étude du développement des organes du fœtus a été limité à des technologies transgéniques et souris knock-out, en plus réactifs pharmacologiques livrés maternelle. Cependant, il ya des questions techniques concernant ces techniques et les traitements in vivo; la plupart des préoccupations tournent autour des effets d'influencer divers organes simultanément, ce qui se traduit souvent par une létalité embryonnaire. Une inquiétude supplémentaire d'études manipulant le développement du fœtus est pharmacologiquement l'effet maternel de médicaments sur le développement embryonnaire in utero (par exemple, le métabolisme de la mère de la drogue avant qu'elle atteigne l'embryon) et si ces réactifs peuvent passer à travers la barrière placentaire.

La technique de culture d'organe entier décriteici a été adapté à partir d'un premier protocole décrit par Maatouk et al. ^2, dans laquelle les gonades fœtales entières sont mises en incubation dans des cultures ex vivo de gouttelettes verticaux. Un avantage important de la culture de gonades fœtales est que les inhibiteurs de petites molécules peuvent facilement accéder à tout l'organe par simple diffusion. . DeFalco et al ont montré que l'utilisation de cette méthode ex vivo gouttelette de culture conjointement avec les inhibiteurs à petites molécules peut être utilisée pour étudier les processus et les interactions qui se produisent au cours du développement des gonades ³ signalisation; ces processus serait difficile d'examiner in vivo en raison de problèmes techniques (par exemple, le passage de la drogue à travers le placenta ou de létalité affectant plusieurs organes en utilisant des approches génétiques ou pharmacologiques).

La culture de la gouttelette est non seulement une amélioration de certains aspects plus expérimentation in utero, mais il est aussi une amélioration par rapport in vitro et ex visystèmes vo ainsi. L'utilisation de lignées de cellules pour étudier la morphogenèse est extrêmement difficile car ils ne possèdent pas les divers types de cellules, ne disposent pas des éléments essentiels matrice extracellulaire (ECM) qui permettent la formation de l'architecture d'organes, et peuvent présenter des artefacts dans les cascades de signalisation. Bien que l'ingénierie tissulaire a apporté des améliorations significatives dans la création d'échafaudages simulant ECM, le manque de connaissances à l'égard de laquelle les signaux sont tenus par chaque type de cellule pendant l'organogenèse, il est difficile de construire un système d'organes in vitro. Autres ex vivo systèmes ont déjà été mis en place pour étudier l'organogenèse, ou plus précisément la morphogenèse, et ont eu beaucoup de succès pour l'imagerie en direct des organes du fœtus dans l'agar ^4, Transwells ^{5, 6,} filtres et autres matrices d'échafaudage ^7,8. L'avantage du système de culture de gouttelettes est qu'il permet l'étude de la morphogenèse en offrant la possibilité d'utiliser moins de réactifs, qui sont des oouvent cher, mais donnant également la tension superficielle de l'organe, ce qui est important pour la capacité de croissance et de signalisation ^9.

Chez la souris, la morphogenèse des testicules initiale a lieu entre embryonnaire (E) met en scène E11.5 et E13.5; Ces étapes comprennent la fenêtre temporelle optimale pour les facteurs qui influencent la différenciation spécifique du sexe d'instruction. Parmi les processus critiques qui se produisent pendant la formation du testicule sont la génération de l'architecture de la moelle testicule et la formation d'un réseau vasculaire spécifique au testicule. En utilisant cette ex vivo système de culture de gouttelettes d'organes ensemble, on est en mesure de modifier la vascularisation spécifique au mâle et inhiber testicule morphogenèse grâce à l'utilisation d'un inhibiteur à petite molécule qui bloque l'activité des récepteurs de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF); Remodelage vasculaire VEGF est critique pour le développement des testicules ^10-12. Cette technique peut être appliquée avec succès à d'autres organes et peut cibler temps spécifiquefenêtres de développement. Imagerie d'organes totalité montage permet la visualisation des structures vitales ainsi que les changements structurels et cellulaires résultant de l'administration de divers inhibiteurs. Surtout, ce système est avantageux en ce que le chercheur peut contourner les effets de confusion potentiels de l'administration de drogues par la mère ou la perturbation systémique pendant vivo stratégies de gènes ciblés dans. Ainsi, toute cette ex vivo système de culture de gouttelettes organe peut améliorer de façon significative la capacité de comprendre les interactions et la signalisation qui se produisent spécifiquement dans des organes particuliers durant le développement fœtal.

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Protocole

Toutes les souris utilisées dans ces études étaient des souris CD-1 obtenues auprès de Charles River Laboratories. Précédentes expériences de culture ont également été réalisées sur d'autres souches, telles que des souris C57BL / 6J (données non présentées), mais toute souche peut être utilisée. Femmes adultes enceintes sont âgés d'environ 2-3 mois et ont été euthanasiés par inhalation de CO ₂ suivie d'une dislocation cervicale et la thoracotomie bilatérale avant le retrait de l'embryon. Les souris ont été logés conformément aux directives du NIH et protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle Hospital Medical Center de Cincinnati Children.

1. Préparation des instruments, Culture Media, et les plats

1. Préparer une solution d'éthanol à 70%. L'eau déminéralisée autoclave (pour faire des chambres humidifiés et pour la fabrication de solutions de dilution /). Stériliser les outils de dissection (forceps, ciseaux, et 27 g d'aiguilles des seringues) par pulvérisation vers le bas avec 70% d'éthanol.
2. Préparer10X tampon phosphate salin (PBS) contenant du calcium et du magnésium (80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, 2,4 g de KH _{2 PO} 4, 6,75 ml de 1 M _CaCl2, 3,75 ml de 1 M _de MgCl2 ). Remuez pour dissoudre dans 1 L d'eau à l'autoclave stérile et puis filtrer avec un papier filtre. Diluer 10 fois avec de l'eau pour faire du PBS 1X.
3. Inactiver la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) à 55 ° C pendant 30 min et stériliser par filtration avec un filtre à seringue de 0,22 um.
4. Préparer 38 ml 1X milieu de culture complet (appelé DMEM complet, cDMEM), constitué de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 10% filtré dilution de chaleur FBS inactivé et 1/100 de la pénicilline-streptomycine stock. Ceci devrait être habituellement utilisée fraîche, mais peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois.
5. Reconstituer le VEGFR Kinase Inhibitor II Tyrosine (TKI II) dans le DMSO pour une concentration stock de 5 mg / ml, et diluer avec de stock cDMEM pour obtenir une solution de travail. Le con finalecentration de cette étude est de 1,875 ug / ml dans cDMEM. Selon les recommandations de la société, les solutions mères sont stables jusqu'à 6 mois à -20 ° C. Quant aux solutions de travail, assurez-fraîche et utiliser le même jour.
   Remarque: La concentration de ce médicament dans la solution de travail doit être deux fois supérieure à la concentration finale désirée (car il sera dilué deux fois dans la goutte). Dans le même temps, préparer le même volume de cDMEM contenant le même volume de DMSO pour le traitement de "contrôle".
6. Préparer les réactifs queue de digestion (NaOH 50 mM et 1 M de Tris-HCl [pH 8,0]) séparément dans de l'eau distillée.
7. Faire un bilan de 25 uM des amorces PCR XY (XY Forward 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'et 5'-XY inverse GCC CTG CCA AAT TCT TTG G-3') ensemble dans l'eau sans nucléase.
8. Préparer tampon TAE 50X (242 g de base Trizma, 57,1 ml acide acétique glacial, 100 ml d'EDTA 0,5 M, pH 8,5, et ajouter de l'eau à 1 L file volume final). Préparez tampon Courir TAE 1X (20 ml 50X TAE dilué avec de l'eau à 1 L de volume total).
9. Pour créer une solution à 2,5% d'agarose (0,625 g d'agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml d'eau), une solution d'agarose de chaleur au micro-ondes jusqu'à ébullition, puis laisser refroidir jusqu'à environ 55-65 ° C (mesure de toucher). Une fois refroidi, ajouter 2 pi de solution de bromure d'éthidium à 1%, et versez gel.
   ATTENTION! Le bromure d'éthidium est un mutagène et tératogène; s'il vous plaît utiliser des gants en nitrile et le protocole de sécurité lors de la manipulation. En variante, d'autres agents colorants ou de gel résoudre potentiellement moins toxiques peuvent être utilisés.
10. Préparer une solution de blocage (PBS avec 0,1% de Triton X-100, 10% de sérum bovin fœtal [FBS], et 3% d'albumine de sérum bovin [BSA]) pour immunofluorescence.
11. Préparer la solution de lavage (PBS avec 0,1% de Triton X-100, 1% de FBS, et 3% de BSA) pour immunofluorescence.
12. Préparer PbTx (PBS avec 0,1% de Triton X-100) pour immunofluorescence.
13. Préparer les chambres d'incubation pour culture. Remplissez de grands plats (100 mm de diamètre) de Petri avec 35 ml d'eau à l'autoclave. Placez près du lieu où la dissection et cultures seront effectuées.

2. Isolement des testicules du fœtus à partir de Mus musculus

1. Vérifiez la souris femelle pour bouchons vaginaux chaque matin. Midi le jour où le bouchon vaginal est détecté est considéré E0.5. Euthanasier la souris femelle enceinte à E11.5, d'une manière compatible avec les protocoles d'animaux approuvés.
2. Pulvérisation vers le bas de l'abdomen de la souris avec 70% d'éthanol.
3. Ouvrez la peau du ventre et du péritoine avec une incision en forme de V à l'aide de ciseaux fins et tirez lambeau de tissu pour exposer les organes intérieurs.
4. Repérez les ovaires aux deux extrémités de la corne utérine. Avec des ciseaux, couper à l'ovaire et le tissu conjonctif de séparer l'utérus contenant les embryons provenant du corps de la mère.
5. Ouvrez la paroi utérine en coupant doucement du côté opposé au placenta, exposant les sacs de jaune. Veillez à ne pas puncture jaune sac pour éviter d'endommager ou de perdre les embryons.
6. Coupez près du placenta pour enlever les sacs de jaune contenant l'embryon et les placer dans un plat contenant du PBS avec le calcium et le magnésium. La présence d'ions calcium et magnésium permettra de molécules d'adhésion cellulaire de support pour maintenir l'architecture tissulaire et empêchent le tissu de coller aux outils de dissection.
7. Avec une pince, retirer la vésicule ombilicale et amnios de l'embryon par ponction attentivement le sac jaune pour créer un trou dans lequel l'embryon peut glisser. Une fois que l'embryon est à l'extérieur de la vésicule ombilicale, couper le cordon ombilical.
8. De ce point en avant, utiliser un microscope situé dans une hotte de culture de tissu stérile. Retirer la tête de l'embryon et le jeter en pinçant avec des pinces de chaque côté du cou.
9. Retirer la queue et la placer dans nouveau tube pour l'analyse PCR XY pour déterminer le sexe de l'embryon.
   Remarque: Bien qu'il est optimal de gonades de la culture dès que possible après la récolte, il est également possible pour éliminer l'ADN de queue et effectuer XX / XY génotypage avant la culture, de sorte que le sexe de chaque embryon est connue et que le sexe désiré doit être mis en culture. Alors que le génotypage est fait, les embryons peuvent être tenus séparés (de sorte qu'ils peuvent être suivis) à 4 ° C ou sur de la glace avant d'être prêt pour la culture. Une mise en garde est que cette période en dehors in utero ou conditions de culture peut potentiellement affecter la viabilité de la culture ou le développement ultérieur au cours de la culture.
10. Fixez l'embryon dans une position couchée sur le fond de la boîte de culture en épinglant les aisselles de l'embryon avec une paire de pinces (généralement la pince détenus dans la main faible). Maintenir ces forceps en place pour maintenir l'embryon encore pendant le processus de dissection entier.
11. Avec autre paire de pinces, retirer la peau recouvrant l'abdomen et retirez délicatement le foie, les intestins et autres organes d'exposer paroi arrière du corps.
12. Comme les gonades se trouve sur la paroi arrière du corps de chaque côté de l'aorte dorsale,un grand navire de sang qui coule le long de la ligne médiane du corps, écope sous la crête urogénitale avec des pinces fermées et enlever la crête urogénitale en ouvrant la pince et soulevez. Comme les gonades seront mal fixés au mur, faites attention à ne pas tirer trop vite sans enlever ces raccordements ou les gonades peuvent étirer, causant des dommages aux organes.
13. Déplacez la crête urogénitale dans cDMEM dans un plat pour acclimater tissus aux médias.
14. Séparer le complexe gonades-mésonéphros du reste de la crête urogénitale en utilisant 27 g d'aiguilles. Utilisez une aiguille pour couper en appuyant vers le bas, et utiliser l'autre pour guider le tissu correctement pour permettre une séparation optimale. Évitez d'utiliser un mouvement de sciage contre le fond plat, comme des aiguilles pointues vont créer des tessons de plastique qui peuvent se coller sur le tissu. Veillez à garder les mésonéphros complètement attachés à la gonade.

3. La culture des gonades avec un inhibiteur de petite molécule

1. Placer les deux 20 μl pipettes à 15 pi de chacun. Couper environ 1-2 mm de l'un des conseils barrière de pipette en utilisant une propre, stérilisé lame de rasoir pour le transfert des gonades et plus de contrôle cDMEM, tandis que l'autre pipette sera utilisé uniquement pour cDMEM du traité par un médicament.
2. Alignez les gonades avec leur grand axe parallèle à la pointe de la pipette afin qu'ils puissent facilement être pipette en utilisant la pointe de coupure. Méfiez-vous des gonades coller à l'intérieur de la pointe de la pipette.
3. Attribuer un côté de la gouttelette de commande et l'autre comme la gouttelette contenant un médicament. Seulement deux gouttelettes peuvent tenir sur un couvercle de boîte de 35 mm. Assurez-vous que les étiquettes sur les couvercles correspondent aux étiquettes sur des microtubes queue contenant le tissu.
4. Pipette 15 ul de cDMEM contenant un seul gonades dans une gouttelette dans le couvercle d'un petit (35 mm) boîte de culture (utiliser uniquement les couvercles, car les fonds sont trop grand pour tenir dans une chambre de boîte de Pétri humidifié). Placez deux gouttelettes contenant des gonades distinctes de chaque côté de l'assiette, bien séparés from une autre. Arrivée au microscope pour s'assurer que les gonades ont été transférés à des gouttelettes.
5. Pour la gouttelette désigné comme le contrôle, ajouter un 15 pi supplémentaires de cDMEM contenant DMSO (faite à l'étape 1.5) à faire une gouttelette avec un volume total de 30 pi. Utilisez uniquement le «contrôle» pipette qui ne sera pas contacter le médicament.
6. Pour l'autre gouttelette (échantillon traité par le médicament), ajouter 15 ul de TKI-II contenant cDMEM effectuer une gouttelette d'un volume total de 30 ul. Utilisez uniquement la pipette désigné pour les échantillons traités avec le médicament.
7. Utilisation de la pipette, étaler les gouttes selon un motif circulaire expansion jusqu'à ce qu'ils soient environ 15 à 18 mm de diamètre et la gonade se trouve à peu près au milieu. Orientez la gonade sorte qu'il se trouve sur le côté et la gonade et mésonéphros sont facilement reconnaissables. Orientez le poumon de sorte que les deux lobes à plat.
   1. Bien que le diamètre des gouttelettes peut varier légèrement, veiller à ce que les gonades ne sont pas floating et sont maintenus en place par la tension de surface. Assurez-vous que les gouttelettes ne se touchent pas les uns les autres ou sur le côté du couvercle. Sans la tension de surface, les organes vont croître sur le couvercle pendant la culture et l'aplatir, faussant ainsi la morphologie d'organes.
8. Placez délicatement le couvercle de la boîte de culture contenant les gouttelettes debout sur la surface de l'eau dans le grand (100 mm) plat de l'humidificateur. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles emprisonnées sous le fond du couvercle et qu'il soit bien à plat sur la surface de l'eau. Ne pas inverser le couvercle et faire attention à ne pas laisser l'eau toucher le haut du couvercle où se trouvent les gouttelettes.
9. Pour créer une petite chambre humide, couvrir immédiatement avec le couvercle de la boîte de l'humidificateur plus grande pour enfermer les cultures des gonades. Agir aussi rapidement que possible afin de minimiser toute évaporation des médias. Veiller à ce que le plus petit plat a de la place entre lui et le couvercle de la plus grande antenne de se déplacer librement; autrement, une condensation peut faire un joint et bl'échange d'air verrouillage au tissu.
10. Une fois que deux petits couvercles sont placés dans la chambre, placer immédiatement la chambre dans l'incubateur. Incuber les cultures de gouttelettes de 48 heures dans un _incubateur à CO2 humidifié à 37 ° C.

4. Polymerase Chain Reaction pour déterminer le sexe des embryons

1. Ajouter les queues embryonnaires de fond d'un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Ajouter à chaque tube 200 ul de NaOH 50 mM.
3. Placez à 95 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissous.
4. Ajouter 50 pi de Tris-HCl 1M et vortex légèrement et brièvement.
5. Dans un tube de 1,5 ml, faire un mélange maître PCR frais en multipliant chaque volume par le nombre total d'échantillons: solution à 0,5 pi 25 uM d'amorce, 2,5 pi 10X Taq Buffer, 0,5 pi 10 mM dNTP (nucléotides), 19,3 pi nuclease- eau libre, 0,2 ul ADN polymérase Taq. Bien mélanger.
6. Ajouter 23pi de PCR Master Mix PCR à tubes contenant 3 pi lysat de queues digérés.
7. Tubes de Flick à les mélanger, puis effectuer un essorage court pour apporter les échantillons au fond du tube.
8. Exécutez le programme XY (Short) PCR (Tableau 1).
9. Charger les échantillons (avec 5x colorant) et de l'échelle dans un gel d'agarose à 2,5% dans un tampon TAE 1X.
10. Exécutez l'électrophorèse sur gel d'agarose jusqu'à bandes XX et XY peuvent être résolus.
11. L'image du gel de capture d'image avec de la lumière UV et.
12. Analyser le vs Y bandes spécifiques d'un chromosome X-chromosome spécifique (chromosome X = 331 paires de bases [BP] et XY = 302 pb) ^13; XY échantillons (hommes) auront deux bandes de 331 et 302 pb, tandis que les échantillons XX (femelles) apparaîtra comme une seule bande 331 pb.

5. Le total des immunofluorescence Mont Organ

Jour 1:

1. Retirez les gonades de la culture à l'aide d'une pipette de 1000 pi avec une pointe de coupure. Si on le désire, ils peuvent êtreplacé dans une boîte de PBS pour laver les milieux et réactifs. Placer dans PBS dans un tube de 0,5 ml à centrifuger. Le diamètre de tube inférieur permettra d'économiser les réactifs et le rendre plus facile de garder une trace des échantillons dans le tube.
   1. Soyez sûr de garder le contrôle et les échantillons traités, ainsi que des échantillons XX et XY, dans des tubes séparés et les retirer de la culture avec des ensembles distincts de pipettes pour éviter toute contamination de la drogue.
2. Laver les gonades deux fois avec PBS. De ce point sur, ce protocole peut utiliser PBS 1X manque calcium et le magnésium. Pour les laver, permettent les gonades pour couler au fond du tube (par gravité) puis retirez le liquide au-dessus. Veillez à ne pas perdre de gonades par pipetage trop près d'eux.
3. Enlever autant que possible à partir de PBS le tube. Ajouter 250 pi de paraformaldehyde à 4% dans du PBS contenant 0,1% de Triton X-100, et laisser incuber O / N à 4 ° C sur une bascule. En variante, cette fixation peut se faire pendant 2 heures à 4 ° C sur une bascule. ATTENTION! Paraformaldehyde est une substance toxique, alors suivez le protocole de sécurité lors de la manipulation.

Jour 2:

4. Rincer les gonades deux fois dans 250 pi PbTx à TA.
5. Laver les gonades 3 fois avec 250 ul PbTx chacune pendant 10 minutes à température ambiante sur une bascule.
6. Bloquer les gonades au moins 1 heure dans 250 pi solution à la température ambiante sur une bascule de blocage.
7. Colorer les gonades O / N à 4 ° C sur une bascule dans 250 pi d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage.

Jour 3:

8. Rincer les gonades deux fois dans 250 Solution de lavage ul.
9. Laver les gonades 3 fois avec 250 pi de la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante chacun sur une bascule.
10. Bloquer les gonades 1 h dans 250 pi de solution de blocage à la température ambiante sur une bascule.
11. Couvrir le microtube de papier d'aluminium pour protéger les anticorps secondaires fluorescents de la lumière.
12. Incuber les gonades 2-4 heures à température ambiante sur arocker dans 250 ul anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage contenant Hoechst 33342. Alternativement, effectuer anticorps secondaire et Hoechst 33342 incubation O / N à 4 ° C sur la bascule.
13. Rincer les gonades deux fois dans 250 pi PbTx.
14. Laver les gonades 3 fois dans 250 pi PbTx chacune pendant 10 minutes à température ambiante sur une bascule.
15. En utilisant une pointe de pipette coupure, transférer gonades sur une lame de liquide minime. Retirer l'excès de liquide à la pipette, mais assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas.
16. Orientez les gonades dans la mode désirée avec une pince, et ajouter rapidement une goutte de milieu de montage pour monter les gonades sur la diapositive. Assurez-vous que les manteaux de médias de montage tous les échantillons complètement; il est essentiel d'éviter de laisser sécher les échantillons.
17. Utilisez des lamelles (1.5 Numéro style) de taille appropriée pour couvrir délicatement échantillons. Laissez montage diffusion de médias pour communiquer avec toute la surface de la lamelle. Si nécessaire, appuyez très légèrement sur les coins de la lamelle couvre-objet de sorte queil n'y a pas de grosses bulles d'air.
18. Sceller les diapositives avec du vernis à ongles clair sur les bords pour réduire l'évaporation des médias de montage. Magasin diapositives montées dans l'obscurité à 4 ° C.

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Résultats

La culture ex vivo des gouttelettes permet de manipuler des organes entiers, tels que la gonade, pour étudier les interactions cellulaires et dynamique. La figure 1 montre d'une façon pas à pas comment préparer une culture E11.5 gonadique de gouttelettes. Les premières étapes du protocole de culture comprennent la suppression initiale de l'utérus contenant l'embryon de la souris mère (Figure 1A et 1B). Après élimination de l'utérus de la mère, la par...

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Discussion

Cette étude démontre un tout méthode de gouttelettes d'organes ex vivo qui a de nombreuses applications potentielles pour étudier le développement du fœtus. Cette technique peut être utilisée pour de multiples organes, et permet au chercheur de répondre à des questions biologiques qui sont difficiles à examiner à l'aide des approches in vivo en raison de l'inaccessibilité des embryons et létalité embryonnaire potentiel. Cette méthode de culture a des avantages supplémentair...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)	Fisherbrand	12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible	Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps	GeneMate	T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L	Gilson	FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
Fine Scissors	FST	91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles	BD PrecisionGlide	309623
10 ml syringe	BD	305559
0.2 μM PES syringe filter	VWR	28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm	Whatman	1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish	Falcon/Corning	353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator	Eppendorf	CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet	Nuare	NU-425-400
Mini-centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL	GeneMate	R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel	Eppendorf	950040015
SMZ445 stereomicroscope	Nikon	SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software	Alpha Innotech Corporation	Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol	Fisher	BP2818-500
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4	Fisher	S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S671-3
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma	C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
XY PCR Primer	IDT	N/A
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP2482-1
1% Ethidium bromide solution	Fisher	BP1302-10	Toxic
Agarose	GeneMate	E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	367176-2.5KG
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions	Thermo Scientific	R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer	Denville	CB-4050-3
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500	Toxic
FluorMount-G	Southern Biotech	0100-01
Hydrogen Chloride (HCl)	Fisher	A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation	Bioexpress	0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered	Fisher	03-600-511	Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered	Sigma	D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem	EMD Millipore	676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody	Millipore	AB5535	Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody	BD Pharmingen	553370	Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signaling	9661S	Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)	Life Technologies	13-1900	Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen (Molecular Probes)	H1399	Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-165-153	Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A31572	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21206	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21208	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Life Technologies	A31573	Use at dilution: 1:500