Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Résumé

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Résumé

Cultures organotypiques permettent la reconstitution d'un environnement 3D critique pour les interactions de contact cellule-cellule et de cellule-matrice qui imite la fonction et la physiologie de leurs homologues in vivo de tissus. Ceci est illustré par des cultures organotypiques de peau qui récapitule fidèlement la différenciation épidermique et le programme de stratification. Kératinocytes primaires épidermiques humains sont génétiquement manipulable par rétrovirus où les gènes peuvent être facilement surexprimés ou renversé. Ces kératinocytes génétiquement modifiées peuvent ensuite être utilisés pour régénérer l'épiderme humain dans des cultures organotypiques de peau qui fournissent un modèle puissant pour étudier les voies génétiques croissance épidermique d'impact, la différenciation et la progression de la maladie. Les protocoles présentés ici décrivent des procédés pour préparer de derme humains dévitalisés ainsi que pour manipuler génétiquement les kératinocytes humains primaires afin de générer des cultures organotypiques de peau. La peau humaine régénéré peut être utilisé dans downstrEAM applications telles que le profilage de l'expression génique, une immunocoloration, des immunoprécipitations et de chromatine suivie de séquençage à haut débit. Ainsi, la production de ces cultures organotypiques de peau génétiquement modifiés permettra à la détermination des gènes qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie de la peau.

Introduction

L'épiderme humain est un épithélium stratifié qui se connecte au derme sous-jacent à travers une matrice extracellulaire connu comme l'épiderme zone.The de la membrane basale sert non seulement une barrière imperméable pour empêcher la perte d'humidité, mais aussi en tant que première ligne de défense pour protéger le le corps des substances étrangères et toxiques ^1. La couche de base, qui est la couche la plus profonde de l'épiderme, les cellules épidermique contient souches et progénitrices qui donnent lieu à la descendance différenciée qui forment le reste de l'épiderme ^2. Comme les cellules progénitrices de l'épiderme se différencient de leur migration vers le haut pour former la première couche de cellules différenciées connu que la couche épineuse ^3. Dans la couche épineuse, les cellules tournent sur l'expression de kératines 1 et 10, qui fournit alors la force de résister à une contrainte physique pour les couches différenciées de l'épiderme. Comme les cellules de la couche épineuses se différencient en outre, ils se déplacent vers le haut dans l'épiderme à dem la couche granulaire qui est caractérisée par la formation de granules de kératohyaline et lamellaires ainsi que des protéines de structure qui sont assemblés en dessous de la membrane plasmique. Comme les cellules passent dans le processus de différenciation, les protéines sous la membrane de plasma sont réticulés les uns aux autres, tandis que les granulés sont extrudés lamellaires à partir des cellules pour former une barrière lipidique riche appelée stratum corneum ^4.

Les maladies qui impliquent des altérations de croissance épidermique et de l'impact de la différenciation de ~ 20% de la population ^5. Ainsi, la compréhension des mécanismes de ce processus est d'une grande importance. Depuis manifestation de plusieurs de ces maladies est subordonnée à cellule-cellule ou cellule-matrice de contact, cultures organotypiques où l'épiderme humain est reconstitué dans un environnement 3D ont été créés ^6-10. Ces procédés impliquent typiquement l'utilisation de kératinocytes primaires ou transformées ensemencées sur la matrice extracellulaire telles que les humains dévitalisésderme, Matrigel, le collagène ou.

Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes qui sont importants pour la croissance et la différenciation de l'épiderme, les kératinocytes peuvent être manipulées génétiquement par des vecteurs rétroviraux pour surexprimer des gènes knockdown ou en culture 2D et ensuite reconstitués en 3D. Ces méthodes ont été largement utilisées pour caractériser les gènes impliqués dans l'épiderme souches et cellules progénitrices auto-renouvellement et de différenciation ainsi que la progression de la néoplasie ^11-21. Ici, un protocole en profondeur sur la façon de modifier l'expression génique dans des cultures organotypiques épidermiques par l'utilisation de retrovirus est fourni.

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Protocole

Le protocole de la peau humaine a été réalisée en conformité avec les directives de l'Université de Californie, Comité d'éthique de la recherche de San Diego. La peau humaine peut être obtenue à partir d'échantillons chirurgicaux jetés ou achetés auprès des banques de la peau (banque de peau est listé dans la table Matériel / Equipement). L'endroit où la peau est dérivée de ou âge du donneur est pas critique pour l'expérience, tant que les protéines de la zone de la membrane basale (collagène / laminine) dans le derme sont pas dégradées.

1. Préparation de dévitalisées derme humain

1. À la réception de la peau humaine, placer le tissu dans la hotte de culture de tissu à décongeler (~ 3-5 min). Selon la taille de la peau, placez le tissu décongelé dans un tube conique de 50 ml stérile à usage unique ou flacon de 125 ml. La taille typique de la peau à partir de la banque de la peau est de 0,75 pieds carrés.
2. Remplissez le réservoir plein à 75% avec 4x pénicilline et de streptomycine (stylo / angine) dans PBS 1x. Agiter vigoureusement pendant5 min et éliminer le liquide. Répétez cette étape 3 fois de plus.
3. Après le dernier lavage, transférer le tissu dans un nouveau tube / bouteille et ajouter 4x frais stylo / streptocoque / PBS à combler 75% du récipient. Incuber ce mélange dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C pendant 2 semaines pour permettre la séparation du derme de l'épiderme.
4. Dans des conditions stériles, utiliser une pince pour décoller l'épiderme du derme. Le derme est complètement blanc tandis que l'épiderme auront coloration en fonction de la course du donneur (figure 1A). Jeter l'épiderme selon le protocole de l'établissement pour le traitement des tissus humains.
5. Placez le derme dans un tube ou le flacon et le laver à 4x stylo / angine dilué dans PBS 1x avec une agitation vigoureuse (lavages de 5 min pour 4 fois). Après le dernier lavage, transférer le derme pour un nouveau tube / bouteille dans 4x stylo / angine dilué dans PBS 1x et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir. Derme peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à un an.

2. modifier génétiquement primaire kératinocytes humains

REMARQUE: utiliser des cellules de Phoenix amphotropes cultivées en milieu DMEM complet [DMEM + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) + stylo / angine] pour produire des virus pour infecter les kératinocytes humains primaires. Gènes d'encapsidation virale qui codent pour des protéines telles que gag-pol et l'enveloppe sont intégrés de manière stable dans le génome de la cellule Phoenix qui permet la production de virus lorsque transfectée avec un vecteur rétroviral. Phoenix cellules peuvent être transfectées avec un rendement élevé permettant une production élevée de titre viral. Virus produite à partir de cette ligne d'emballage peut également infecter une grande variété de cellules de mammifères y compris l'homme.

1. Jour 1: Le jour avant la transfection, les cellules de Phoenix de semences dans une plaque à 6 puits à une densité de 800.000 cellules par puits dans des milieux DMEM complet.
2. Jour 2: Le jour de la transfection, utilisez 3 pg de vecteurs rétroviraux par puits. Aliquote 3 pg de vecteur rétroviral dans un tube de 1,5 ml. Utilisez un mélange de 100 μ; l DMEM plus 6 pi de réactif de transfection pour chaque 3 pg de vecteur. Mélanger 6 ul de réactif de transfection avec 100 ul de DMEM dans un tube de 1,5 ml. (Les vecteurs rétroviraux qui sont utilisés sont listés dans le tableau équipement / matériaux).
   1. Incuber pendant 5 min et ajouter le mélange 106 pi dans le tube pré-aliquoté contenant le 3 pg de vecteur retroviral. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Ajouter l'ensemble de ce mélange goutte à goutte dans chaque puits des cellules de Phoenix.
3. Jour 3: Le jour après la transfection, retirez le support à partir des cellules de Phoenix et ajouter 2 ml de milieu complet frais DMEM. Le même jour, ensemencer les kératinocytes humains primaires dans des plaques 6 puits à une densité de 75.000 cellules par puits. Maintenir les kératinocytes dans un milieu de sérum de kératinocytes libre (KCSFM) avec des antibiotiques (pénicilline / streptomycine).
   REMARQUE: kératinocytes humains primaires ont été achetés. Les cellules peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs (énumérés dans le tableau Matériel / Equipement).
4. Jour 4: Haracquises les médias à partir des cellules transfectées de Phoenix, qui contient maintenant des particules virales. Passez les médias à travers un filtre de 0,45 um en utilisant une seringue (pour enlever les cellules contaminantes Phoenix) et placer 2 ml sur les kératinocytes (étalées à 75.000 cellules / puits la veille: voir l'étape 2.3). Ajouter le bromure de hexadiméthrine (5 ug / ml) aux médias pour aider à la médiation du processus d'infection. Les titres viraux sont ~ 1 x 10 ⁷ TU / ml.
   1. Faites tourner les plaques à 6 puits dans une centrifugeuse à 200 xg pendant 1 heure à température ambiante. Après le spin, retirez le support contenant le virus et laver les cellules une fois avec PBS 1x avant d'ajouter KCSFM.
5. Jour 5: Infect le même lot de kératinocytes de nouveau comme dans l'étape 2.4.
   REMARQUE: Sélectionnez les kératinocytes en utilisant un médicament si il est un marqueur de sélection sur le vecteur rétroviral et d'étendre pour une utilisation dans l'analyse ou des applications telles que les cultures organotypiques aval.

3. Configuration de cultures de peau organotypiques

1. Construire leCassette organotypique à partir de matières communes trouvées dans le laboratoire ou les cassettes peut être personnalisé grâce à un atelier de fabrication métallique (figure 2A - F). Pour rendre ces cassettes à partir d'une plaque de culture de tissu de 3,5 cm, utiliser un cautère pour enlever un carré 1.0 cm x 1.0 cm du centre du couvercle d'un plat de 3,5 cm (Figure 2A-B). Pour ce faire, dans des conditions stériles.
   1. Fixez des chevilles carrées au fond de la cassette (couvercle de 3,5 cm plat) en utilisant vernis à ongles transparent (figure 2C). Laisser 5 min pour le vernis à ongles de sécher et de retourner la cassette au cours de sorte qu'il repose sur les chevilles carrées (figure 2D). Placez la cassette dans un plat de 6 cm.
      REMARQUE: Square Pegs peuvent être achetés à partir d'une variété de boutiques d'artisanat.
2. Préparer un milieu de croissance de kératinocytes (KGM) composé de 66% de DMEM, 22% F12 de Ham, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, 10% de FBS, 2,67 pg / ml adenine, 40 ng / ml d'hydrocortisone, 10 toxine ng / ml de choléra, 4,94 pg / ml d'insuline, 5 pg / ml de transferrine, 1,36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml d'EGF, et 10 ug / ml de chlorhydrate de ciprofloxacine. Filtrez les médias à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
3. Prenez le derme de la plume 4x / streptocoque + solution de PBS et laver 2 fois dans KGM puis incuber dans KGM à 37 ° C pendant deux jours avant de les utiliser.
4. Couper le derme à l'aide d'un scalpel à 1,5 cm x 1,5 cm de morceaux de la taille et ensuite placer sur la cassette organotypique. Placez le derme avec la partie supérieure du derme vers le haut. La partie supérieure du derme sera le côté qui vient en contact avec les kératinocytes (figure 1B).
5. Placez le derme prédécoupées sur le trou carré de la cassette organotypique avec le côté supérieur du derme vers le haut (figure 3A).
6. Retournez la totalité de la cassette contenant organotypique le derme plus de l'aide de pinces (figure 3B). Décongeler la solution de la matrice extracellulaire sur la glace. Utiliser une aiguille et une seringue pour tirer 100 pi de solution de matrice extracellulaire par cassette. Ajouter 5 gouttes au fond du derme (côté brillant) et secouez légèrement pour assurer une distribution uniforme à travers le derme (figure 3B).
7. Autoriser 5 min pour la solution de la matrice extra-cellulaire commerciale pour solidifier complètement (figure 3C). Après solidification, utiliser une pince pour retourner la cassette terminée. Ajouter 4 ml de KGM à 6 cm plat.
8. Placez 0,5-1 millions de kératinocytes génétiquement modifiés sur les cassettes contenant les organotypiques derme (figure 3D).
   1. Trypsiniser les kératinocytes en plaçant 4 ml de trypsine à 0,05% sur plaques de 10 cm pendant 5 minutes et éteindre avec 4 ml de milieu DMEM complet.
   2. Comptez les kératinocytes en utilisant un hémocytomètre puis centrifuger à 200 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules de 0,5 à 1 million (en fonction du nombre de cellules disponibles) dans 90 μl de KGM et placez toutes les cellules sur le derme.
      Remarque: il est important de placer le même nombre de cellules de derme dans la même expérience pour s'assurer que les différences observées dans épaisseur de l'épiderme régénéré est pas due à des différences dans le nombre de cellules de départ. Placer moins de 0,5 millions de cellules sur le derme peut conduire à une mauvaise stratification et de différenciation.
9. Changer de support KGM sur les cultures organotypiques tous les autres jours. Récolte tissus 1-14 jours après le placement des kératinocytes sur le derme. Stratification complète et la différenciation de l'épiderme survient généralement après 5 jours.

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Résultats

La première étape dans la génération de la peau humaine organotypique est d'enlever l'épiderme du derme. Le 2 semaines d'incubation de la peau à 37 ° C dans 4 x pen / strep / PBS devrait permettre la séparation du derme de l'épiderme (figure 1A). Si la séparation des épiderme et le derme est difficile puis placez le tissu à 37 ° C en 4x stylo / streptocoque / PBS pendant une semaine et puis essayer de nouveau pelage en utilisant une pince.

Une de...

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Discussion

La manipulation génétique dans la peau humaine cultures organotypiques offrent de nombreux avantages à couramment étudié 2D cellules cultivées ainsi que des modèles de souris. Cultures 2D pas les trois dimensions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire interactions trouvés dans les tissus et organes intacts. Des études récentes ont également trouvé d'énormes différences entre les cellules de cancer de la peau en culture 2D et 3D avec les cellules cultivées en 3D montrant beaucoup plus de si...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G